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PHARMACOGNOSIE
Effet antibactérien et anti-biofilm de trois espèces de Mentha : Mentha
spicata, Mentha pulegium et Mentha piperita
Antibacterial and anti-biofilm Effects of three species of Mentha: Mentha spicata, Mentha
pulegium and Mentha piperita
A. Barchan · M. Bakkali · A. Arakrak · A. Laglaoui
© Lavoisier SAS 2015
Résumé Dans la première partie de la présente étude, on a
procédé à l’évaluation de l’effet antibactérien des extraits
organiques bruts de trois espèces de Mentha vis-à-vis de six
souches bactériennes pathogènes incluant trois bactéries
Gram (-) et trois bactéries Gram (+). L’activité antibacté-
rienne a été évaluée par la méthode de diffusion en milieu
solide et celle de micro-dilution en milieu liquide. Les extraits
hexaniques et dichlorométhaniques (extraits non-polaires)
sont beaucoup plus actifs contre les bactéries testées que les
extraits méthanoliques et aqueux (extraits polaires). Les bac-
téries Gram (+) se sont montrées plus sensibles que les bac-
téries Gram (-). La bactérie S. aureus est la plus sensible de
toutes les bactéries testées dans cette étude, elle était sensible
vis-à-vis tous les extraits même ceux aqueux. Ces derniers se
sont montrés inactifs à la plus grande concentration utilisée
(12 mg/ml) vis-à-vis des cinq autres souches.
Dans la seconde partie, les extraits apolaires ont été testés
pour leur effet anti-biofilm vis-à-vis des biofilms de 48 heures
formés par S. aureus et E. coli. Tous les extraits ont montré
une efficacité anti-biofilm spectaculaire dans l’élimination de
la totalité des biofilms formés après 30 min de traitement.
Mots clés Effet antibactérien · Effet anti-biofilm · Mentha
pulegium · Mentha spicata · Mentha piperita · Extraits
apolaires · Extraits polaires
Abstract In the first part of this study, we were proceeded to
the evaluation of the antibacterial effect of the organic
extracts from the leaves of three plant species of Mentha
against six pathogenic bacterial strains including Gram (-)
bacteria and Gram (+) bacteria. The methods of diffusion
in solid and micro-dilution method in liquid medium were
used for antibacterial testing. The results showed that non-
polar extracts are much more active then polar extracts. The
Gram (+) bacteria showed more sensitive than the Gram (-)
bacteria. S. aureus was shown to be the most sensitive of all
bacteria testing in this study, it was sensitive against all
extracts include that aqueous. All aqueous extracts have
no antibacterial activity with the highest concentration used
(12 mg/ml) against the five other strains.
In the second part, non-polar extracts were tested for their
anti-biofilm effect against biofilms formed by S. aureus and
E. coli in 48 hours. All extracts showed a spectacular anti-
biofilm effect with elimination of all the biofilms formed
after 30 min of treatment.
Keywords Antibacterial effect · Anti-biofilm effect ·
Mentha pulegium · Mentha spicata · Mentha piperita · Polar
extracts · Non-polar extracts
Introduction
La résistance aux antibiotiques est un p hénomène biologique
que la médecine a ura du mal à faire dispa raître. Il y a quelques
décennies, plusieurs maladies semblaient maîtrisées grâce à
l’utilisation des antibiotiques. Les progrès scientifiques et
technologiques laissaient même croire à une possible éradica-
tion de nombreuses pathologies. La résistance développée de
plus en plus par les microorganismes et l’émergence régulière
de nouveaux agents in fectieux ont démenti ce pronostic opti-
miste. Depuis plus de vingt a ns, d e nombreux déterminants de
résistance ont été décrits avec l’émer gence de bactéries de plus
en plus résistantes [1]. Aucune espèce bactérienne connue et
aucun antibiotique n’échappent aujourd’hui au phénomène de
résistance.
Face à ce phénomène, mis en péril par l’émergence de
germes multi-résistants, la découverte de nouvelles molécu-
les antibactériennes, qui pourraient constituer une alternative
àl’usage des antibiotiques conventionnels devenus ineffica-
ces, est devenue une nécessité absolue.
A. Barchan · M. Bakkali · A. Arakrak · A. Laglaoui (*)
Equipe de recherche en Biotechnologies
et Génie des Biomolécules (ERBGB),
Département de Biologie, Faculté des Sciences et Techniques,
Université Abdelmalek Essaâdi, BP 416, Tanger, Maroc
e-mail : laglaouiamin@yahoo.fr
Phytothérapie
DOI 10.1007/s10298-015-0970-y
Les plantes, qui ont déjà fourni à la médecine des molécu-
les thérapeutiques majeures, comme l’aspirine, la morphine,
la quinine ou le taxol, offrent un véritable potentiel pour la
recherche de molécules à activité antibactérienne. Peu d’espè-
ces végétales sont connues et seule une minorité d’entre elles
est explorée chimiquement. Il resterait entre 300 000 et
500 000 espèces de plantes à découvrir [2] ce qui laisse pré-
sager un nombre conséquent de nouvelles molécules à identi-
fier. Actuellement, de nombreux médicaments utilisés sont
extraits de plantes. Environ 25% des produits pharmaceu-
tiques renferment des préparations à base de plantes [3].
L’évaluation de l’activité antibactérienne d’une plante est
souvent réalisée en milieu liquide où les bactéries ont un
mode de vie planctonique. Pourtant dans la plupart des éco-
systèmes, les bactéries s’associent à des surfaces solides
vivant ainsi à l’état sessile sous forme de biofilm, ce qui
leur confère une résistance aux traitements de désinfectants
et de nettoyage [4]. Dans le domaine de l’industrie agro-
alimentaire, les biofilms constituent un grave problème puis-
qu’ils touchent la chaine alimentaire et par conséquence la
santé. C’est pourquoi dans le présent travail on s’intéresse à
étudier l’effet antibactérien de trois espèces de Mentha contre
six souches pathogènes sous leur état planctonique (en milieu
liquide) et leur état sessile (biofilm). Les trois espèces de
Mentha (Lamiacées) utilisées dans cette étude sont reconnues
pour leurs effets biologiques divers [5-7]. Et leurs infusions
sont largement utilisées dans la tradition marocaine soit
comme herbe à thé ou comme antiseptique, dans le traitement
du rhume, la sinusite, le choléra, les intoxications alimentai-
res, la bronchite et la tuberculose.
Matériels et méthodes
Matériel végétal
Les plantes qui ont fait l’objectif de ce travail ont été collec-
tées durant la saison d’été de 2009, dans la région tangéroise
du nord Marocain. Mentha pulegium L. est collecté dans les
lieux humides des plaines du tangérois à l’état spontané,
alors que Mentha x piperita (L.) et Mentha spicata L. à l’état
cultivé.
Les plantes fraîchement collectées ont été séchées à l’om-
bre et à l’abri de l’humidité. Une fois séchées, les feuilles ont
été réduites en poudres fines en vue de leur extraction.
Préparation des extraits
La préparation des extraits organiques bruts est effectuée par
épuisement successif de poudre végétal au soxhlet par trois
solvants organiques à polarité croissante : n-Hexane, Dichlo-
rométhane (DCM), Méthanol 100% et finalement par l’Eau
distillée à 100°C [8].
Les extraits ont été ensuite concentrés sous pression
réduite à sec et à une température de 50°C à l’aide d’un
évaporateur rotatif. Les résidus formés ont été conservés à
4°C pour utilisation ultérieur.
Dosage des polyphénols totaux
La teneur en polyphénols totaux des extraits des plantes a été
déterminée par la méthode de Manian et al. [9] utilisant le
réactif de Folin–Ciocalteu.
Dans des tubes à essais on introduit un volume de 50 μlde
chaque extrait, 450 μld’eau distillée puis 250 μl de Folin
Ciocalteu dilué 2 fois est rajouté. Le mélange est agité au
vortex. Apres 5 min, 1,25 ml de carbonate de sodium
(20 %) est additionné. Les tubes sont agités et conservés à
l’obscurité pendant 40 min.
L’absorbance est mesurée à 725 nm à l’aide d’un spectro-
photomètre. Une courbe d’étalonnage à différente concentra-
tion d’acide tannique a été préparée. Les teneurs en polyphé-
nols totaux dans les extraits sont exprimées en μg équivalent
d’acide tannique par mg d’extrait (EAT/mg).
Détermination de l’activité antibactérienne
Souches bactériennes testées
Six souches bactériennes de la collection internationale
CECT (Collection Espagnole de Cultures Type) pathogènes
et/ou impliquées dans le processus d’altération des aliments
ont été étudiées. Trois bactéries Gram(-) : Escherichia coli
405, Escheric
hia coli 471, Yersinia enterocolitica 4315;Et
trois bactéries Gram(+) : Listeria monocytogenes 4031,
Enterococcus hirae 4081, Staphylococcus aureus 976.
Avant utilisation, les bactéries sont sub-cultivées d’abord
en stries sur milieu Muller Hinton Agar puis en Bouillon de
Muller Hinton.
Technique de diffusion en puits
10 ml du milieu Muller Hinton Agar sont coulés dans des
boites de Pétri stériles et laissés refroidir. Après solidification
du milieu, des puits de 6 mm de diamètre sont réalisés.
A partir des cultures bactériennes de 24 h, des dilutions
dans l’eau peptonée (0.01%) sont effectuées, 100 μldela
dilution 10
6
bactéries est ensemencée à la surface. Les puits
sont ensuite remplis par 20 μldel’extrait (50 mg/ml) à tester.
Les boîtes sont ensuite incubées à 37 °C pendant 24 h.
L’activité antibactérienne des extraits est révélée par
l’apparition de zones d’inhibition autour des puits, les diamè-
tres des zones d’inhibition formés autour des puits ont été
mesurés en millimètre.
2 Phytothérapie
Technique de micro-dilution
Détermination de CMI
La méthode de micro-dilution [10] est utilisée avec quelques
modifications pour déterminer la concentration minimale
inhibitrice (CMI). Des séries de dilutions allant de 0.75 à
24 mg/ml dans le Bouillon Muller Hinton (MHB) et le tween
80 sont préparées. Dans chaque puits d’une plaque à 96 puits,
on dépose 20 μl de la souche bactérienne (10
7
UFC/ml), 80
μl du Bouillon Muller Hinton et 100 μld’une dilution
d’extrait déjà préparée. Ainsi les dilutions sont réduites en
moitié et passent de 0.75 - 24 mg/ml à 0.375 – 12 mg/ml.
Les puits servant de contrôle négatif ne contiennent pas
d’extrait, et ceux servant de contrôle positif contiennent
l’extrait sans bactérie. Les plaques sont ensuite incubées à
37 °C pendant 18 h.
Pour la révélation de la CMI, 5 μl de la résazurine 0.01%
(w/v) sont ajoutés à chaque puits. La CMI correspond à la
plus petite concentration de l’extrait qui ne produit pas de
changement de coloration de la résazurine, et qui correspond
àl’absence de la croissance bactérienne [11].
Détermination de CMB
La CMB est la concentration minimale de l’extrait capable
de tuer l’inoculum.
Elle est déterminée par ensemencement des aliquotes de
10 μl prélevés à partir des puits où on n’a pas eu de change-
ment de la coloration de la résazurine, sur le milieu Muller
Hinton Agar (MHA), et la CMB correspond à la plus petite
concentration qui ne donne aucune subculture.
Détermination de l’activité anti-biofilm
• Préparation des cultures bactériennes
Les souches bactériennes S. aureus et E. coli 405 sont pré-
cultivées en stries sur milieu gélosé, puis dans 50ml de bouil-
lon Brain Heart Infusion (BHI) jusqu’à ce que le nombre des
bactéries atteint environ 10
8
UFC/ml.
• Préparation du système permettant la formation
du biofilm
Le modèle expérimental de la formation de biofilm a été éla-
boré sur la base d’un système utilisé par Bagge [12] et par
Gram [13] avec quelques modifications. Le système se com-
pose d’un bécher de 1 litre contenant deux disques d’acier
inoxydable sur lesquels, il peut être placé des pièces d’acier
inoxydables en position droite. Les pièces sont âgées de plus
de 6 ans, faites d’acier inoxydable (AISI 304), coupées en 10-
28 mm avec une épaisseur de 1 mm. Ces morceaux d’acier
ont été utilisés dans une société agroalimentaire. Le support
contenant les morceaux d’acier est immergé dans un milieu de
culture contenant les bactéries à tester. Le bêcher a été scellé
avec une boîte de Pétri et du papier aluminium.
• Préparation et nettoyage des pièces d’acier
Afin d’engager la phase d’adhérence des cellules bactérien-
nes, les morceaux et les disques d’acier inoxydable ont été
précédemment hygiénisés et stérilisés selon une procédure
utilisée par Rossoni et Gaylarde [14] avec quelques
modifications :
•
Nettoyage avec de l’acétone à 100% ;
•
Lavage par immersion dans un détergent alcalin NaOH
1% pendant 1 h ;
•
Rinçage à l’eau distillée stérile ;
•
Séchage pendant 2 h à 60°C et stérilisation à l’autoclave à
121°C∕15 min.
• Adhésion des bactéries à la surface des morceaux
d’acier inoxydables
Pour favoriser la formation des biofilms sur les pièces
d’acier inoxydables, 450 ml de BHI stérilisé et 50 ml de
BHI contenant la culture bactérienne ont été ajoutés dans le
bécher contenant les pièces d’acier inoxydable fixées sur les
deux disques. Le bécher a été scellé et incubé pendant 48 h à
37°C.
• Traitement des pièces d’acier inoxydable à l’aide
des extraits bruts
Les extraits ont d’abord été dilués avec le diméthylsulfoxide
(DMSO), puis par l’ajout de la solution saline à 0.5% de
Tween 80. La concentration des extraits utilisés dans chaque
solution désinfectante était égale à la concentration minimale
inhibitrice (CMI) trouvée par l’analyse de l’effet antibacté-
rien en milieu liquide des cellules planctoniques de S. aureus
et E. coli.L’action de la désinfection de chaque solution
contre les cellules bactériennes adhérées à la surface des piè-
ces d’acier inoxydable a été évaluée après 48 heures. Ainsi,
les pièces d’acier ont été rincées 3 fois successives par l’eau
peptonée (0.1%) pour éliminer les cellules planctoniques,
suivie par 30 min d’immersion dans 4 ml de la solution
désinfectante contenant l’extrait à tester. La solution contrôle
contient 90% de la solution saline à 0.5% de Tween 80 et
10% de DMSO.
• Dénombrement des cellules bactériennes adhérées
Le nombre des cellules adhérées aux pièces d’acier inoxy-
dable a été déterminé après des traitements utilisant les
Phytothérapie 3
solutions désinfectantes à base des extraits bruts et la solu-
tion de contrôle suivant le protocole cité par Valeriano [15].
Le nombre des cellules adhérées sur les pièces non traitées
par les solutions désinfectantes a également été calculé.
L’élimination des cellules adhérées a été réalisée par grattage
de la surface de la pièce à l’aide d’écouvillons stériles. Les
écouvillons sont ensuite transférés dans des tubes contenant
10 ml de l’eau peptonée (0.1 %), suivie d’une agitation au
vortex pendant 1 min. Des dilutions en série sont réalisées
dans des tubes eppendorf contenant 900 μld’eau peptonée.
Un aliquote de 100 μl de chaque dilution a été ensemencé en
surface dans une boîte de Pétri contenant le milieu solide de
Tryptone Soy Agar (TSA). Les boîtes de pétri ont été incu-
bées à 37°C pendant 24 h.
Conception expérimentale
Toutes les mesures ont été reproduites trois fois. Les deux
souches utilisées dans le test du biofilm ont été individuelle-
ment analysées. Dans chaque expérience, 3×2 pièces d’acier
(désinfectants × répétition) ont été disposées dans le système.
Résultats et discussion
La teneur en polyphénols totaux
L’extraction avec des solvants à polarité croissante, utilisée dans
ce travail, permet de séparer les composés d’une plante selon
leur degré de solubilité. La plupart des effets pharmacologiques
des plantes sont attribués à leur richesse en polyphénols. Les
taux de polyphénols totaux enregistrés dans les extraits hexani-
ques, dichlorométhaniques, méthanoliques et aqueux des espè-
ces de Mentha étudiées sont résumés dans la figure 1.
D’après ces résultats on constate clairement que le taux de
polyphénols estimés varie proportionnellement en fonction
de la polarité des solvants d’extraction. En effet, les extraits
méthanoliques et aqueux ont présenté les taux les plus élevés
(entre 167.2 et 305.4 μg EAT/mg), suivis par les extraits
dichlorométhaniques (entre 111.8 et 133.8 μg EAT/mg).
Alors que les teneurs les plus faibles sont enregistrées pour
les extraits hexaniques avec des valeurs comprises entre 0.2
et 23.4 μg EAT/mg. En accord avec ces résultats, plusieurs
travaux affirment que les polyphénols sont plus solubles
dans les solvants polaires que dans ceux apolaires. Lee et
al. [16] ont trouvé que l’extrait aqueux de Pleurotus citrino-
pileatus présente la plus grande teneur en polyphénols. De
même l’étude des extraits de Smilax excelsa a permis de
démontrer que l’extrait aqueux présente le taux le plus élevé
en polyphénols alors que l’extrait d’acétate d’éthyle ren-
ferme le taux le plus faible [17].
Plusieurs études réalisées sur des espèces de Mentha
ont permis de mettre en évidence la présence de certains
dérivés de flavonoïdes et d’acides phénoliques tels que :
eriocitrin, luteolin-7-O-glucoside, acid rosmarinic et acid
caffeic [18-20].
L’activité antibactérienne
Technique de diffusion en puits
En fonction des diamètres des zones d’inhibition des bacté-
ries testées on a classé les extraits en trois catégories : ceux
non actifs, ceux à activité moyenne et ceux à forte activité
antibactérienne (tableau 1). Selon les résultats obtenus on a
constaté que les diamètres des zones d’inhibition varient en
fonction de l’extrait et de la souche testée. La plupart des
souches Gram (+) se sont montrées sensibles vis-à-vis des
différents extraits avec des diamètres supérieures à 12 mm
dans la plupart des cas. Alors que les trois souches Gram (-)
se sont montrées résistantes contre la majorité des extraits
sauf ceux hexaniques. Y. enterocolitica s’est montré la plus
résistante de toutes les souches avec des zones d’inhibition
inférieures à 8 mm. Celle-ci a montré une légère sensibilité
vis-à-vis des extraits dichlorométhaniques de M. piperita et
M. spicata. Les travaux de Tadesse et al. [21] ont révélé que
29 % des extraits testés ont montré une forte activité contre
les bactéries Gram (+) alors que seulement 13 % des extraits
étaient actifs contre les souches Gram (-).
A
vec des diamètres supérieures à 12 mm sur la plupart
des souches testés, les extraits hexaniques se sont révélés
les plus actifs. Alors que les extraits aqueux ont pratique-
ment manifesté les plus faibles activités en induisant des
diamètres inférieurs à 8 mm contre la majorité des souches.
Selon Hambaba et al. [22] les extraits apolaires (dichloromé-
thanique et d’éther de pétrole) ont produits des zones d’inhi-
bitions plus grandes que celles obtenues avec les extraits
polaires (méthanolique et aqueux).
Fig. 1 Taux de polyphénols des extraits hexaniques (H), dichloro-
méthaniques (DCM), méthanoliques (M) et aqueux (A)
4 Phytothérapie
Détermination des valeurs de CMI et CMB
Les résultats de l’évaluation des CMI et CMB résumés dans
le tableau 2. À partir de ces résultats, on remarque que les
extraits ayant induit une importante zone d’inhibition pré-
sentent les plus faibles valeurs de CMI sur les germes cor-
respondants. Cela est observé pour les hexaniques et dichlo-
rométhaniques dont les CMI obtenues sont compris entre
1,5 et 12 mg/ml. Alors que les extraits méthanoliques et
les extraits aqueux se sont montrés sans effet aux concen-
trations testées avec des valeurs de CMI supérieures à
12 mg/ml dans tout les cas étudiés sauf dans le cas de S.
aureus. Celle-ci s’est montré sensible vis-à-vis tous les
extraits sans exception. Nos résultats sont en accord avec
un grand nombre d’études déjà faites et qui montrent que
les extraits aqueux sont moins efficaces contre les bactéries
que les extraits organiques. El-Amraoui et al. [23] ont monté
que l’extrait dichlorométhanique été actif contre toutes les
bactéries testées alors que les extraits hydro-alcooliques
n’avaient aucune activité antibactérienne.
Les souches Gram (+) ont montré des valeurs de CMI
plus faibles que celles enregistrées par les souches Gram
(-). Cela confirme la sensibilité des souches Gram (+) testées
par rapport à ceux Gram (-). S. aur eus s’est montré la plus
sensible de toutes les souches testées alors que Y. enteroco-
litica s’est montrée la plus résistante.
Dans la présente étude, le test de diffusion en puits a
démontré que les souches Gram (+) testées sont plus sensi-
bles que les souches Gram (-). Ces résultats ont été confir-
més après la détermination des CMI par le test en milieu
liquide. Nos résultats sont en accord avec plusieurs études.
En effet, il est connu dans la littérature que les souches
Gram (+) représentent une sensibilité toujours supérieure
à celle des bactéries Gram (-) [24 – 30]. Ceci est dû princi-
palement à la différence de la structure de la paroi cellulaire
entre les Gram (+) et les Gram (-) [31]. Par ailleurs, d’après
ce qu’est rapporté par Basli et al. [32], la paroi des bactéries
Gram (+) est riche en protéines tandis que chez les souches
Gram (–), elle est surtout composée en lipopolysaccharides
(LPS), la membrane extérieure de ces dernières constitue
une barrière efficace à la diffusion des molécules antibac-
tériennes. Le LPS, grâce à ses charges négatives de surface,
empêche la diffusion des molécules hydrophobes, et les
protéines excluent le passage des molécules hydrophiles
de poids moléculaire élevé. Alors que les bactéries Gram
(+) sont moins protégées contre les agents antibactériens,
le peptidoglycane n’entrave que la diffusion des molécules
supérieures à plus de 50 000 D [33].
Aussi, une nette différence en terme d’activité antibacté-
rienne entre les extraits hexaniques et ceux aqueux a été
démontrée par le test de diffusion en puits. La détermination
des CMI a mis le point d’avantage sur cette différence et a
permis de démontrer que les extraits apolaires (hexaniques
Tableau 1 Activité antibactérienne des différents extraits testés vis-à-vis des souches bactériennes.
Extraits hexaniques Extraits
dichlorométhanol iques
Extraits méthanoliques Extraits aqueux
M.
piperita
M.
pulegium
M.
spicata
M.
piperita
M.
pulegium
M.
spicata
M.
piperita
M.
pulegium
M.
spicata
M.
piperita
M.
pulegium
M.
spicata
Gram (+)
S. aureus ++ ++ ++ ++ + + - - - + - +
L.
monocyto-
genes
+ + + ++++++ ++++++ - - -
E. hira e ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ - - -
Gram (-)
E. coli 405 ++ ++ ++ - - - + - - - - -
E. coli 471 ++ ++ ++ - - - + - - + - -
Y.
enterocolitica
--- +-+ --- ---
(-) : non inhibition (< 8 mm), (+) : inhibition moyenne (8 mm < X < 12 mm), (++) : inhibition forte (> 12 mm). M1, M2 et M3 : Mentha piperita, Mentha pulegium et Mentha
spicata respectivement
Phytothérapie 5
et dichlorométhaniques) sont bactériostatiques avec des CMI
bien déterminées alors qu’aucun effet bactériostatique n’est
enregistré par les extraits apolaires (aqueux et méthanoliques)
dont les CMI sont toutes supérieures à 12 mg/ml. Ceci est
peut être en relation avec la concentration et la richesse des
extraits apolaires en composés antibactériens par rapport à
ceux polaires. L’eau est capable d’extraire les composés
hydrophiles alors que les solvants organiques sont générale-
ment capables d’extraire les composés hydrophobes polaire et
non-polaire [34]. Touré et al. [35] ont mis en évidence la pré-
sence dans l’extrait hexanique, en proportion élevée, des alca-
loïdes, des flavonoïdes, des stérols et des polyphénols dont les
activités antibactériennes ont été rapportées par plusieurs tra-
vaux [36-39]. Cela pourrait donc expliquer en partie les acti-
vités antibactériennes des extraits apolaires dans ce travail.
La bonne activité antibactérienne enregistrée par les
extraits hexaniques, très pauvres en polyphénols, peut être
due principalement à leur richesse en huiles essentielles. Plu-
sieurs études ont prouvé la richesse du genre Mentha en hui-
les essentielles. Dans la littérature, il est reconnu que les
huiles essentielles de plusieurs espèces de Mentha dont
M. spicata, M. piperita et M. pulegium possèdent des pro-
priétés antimicrobiennes [40-42]. L’huile essentielle de Men-
tha pulegium est riche en pulegone (30-70%) [43-47]. La
pulegone est reconnu pour ses effets antibactériens divers.
Il a montré un important effet antibactérien contre S. aureus
[48]. Le menthol et la menthone constituent deux compo-
sants majoritaires de l’huile essentielle de M. piperita [49,
50], le menthol possède un effet antibactérien contre plu-
sieurs souches pathogènes compris Clostridium sporogenes,
Salmonella pullorum et Staphylococcus aureus [51].
Plusieurs facteurs peuvent influencer la composition chi-
mique d’uneplantetelsqueletempsdelacollecte,lestade
de développement de la plante, la méthode d’extraction, l’ori-
gine géographique et même les conditions climatiques et sai-
sonnières [52,53]. Par ailleurs, les extraits sont d es mélanges
très complexes de composés majoritaires et minoritaires ce qui
rend difficile l’explication de leurs propriétés antimicrobien-
nes. L’activité antibactérienne pratiquement négligeable des
extraits aqueux et méthanoliques malgré leur richesse en poly-
phénols est peut être expliqué e par le fait que l’ef ficacité d’un
extrait dépend plus de la qualité des composés phénoliques,
qu’il renferme, que leur quantité elle même. L’efficacité d’un
composé phénolique dépend de ses propriétés physicochimi-
ques et de sa structure hétérogène. L’efficacité optimale d
’un
extr
ait peut ne pas être due à un constituant actif principal, mais
àl’action combinée (synergie) de différents composés à l’ori-
gine de cet extrait [54].
Détermination de l’activité anti-biofilm
En se basant sur les résultats du test antibactérien, les
extraits hexaniques et dichlorométhaniques ont été choisis
pour tester leur effet sur l’élimination de biofilm de Staphy-
lococcus aureus et d’Escherichia coli 405. Les valeurs de
CMI qui ont démontré une activité antibactérienne sur les
Tableau 2 Concentration minimal inhibitrice (CMI) et bactéricide (CMB) des extraits en mg/ml.
Souches bactériennes testées
Gram (+) Gram (-)
S. aureus L. monocytogenes E. hirae E. coli 405 E. coli 471 Y. enterocolitica
CMI CMB CMI CMB CMI CMB CMI CMB CMI CMB CMI CMB
Extraits
hexaniques
M. piperita 363 1261212>123126>12
M.
pulegium
1,5 3 1,5 3 6 6 12 >12 6 12 6 >12
M. spicata 1,5 3 6 >12 6 12 12 >12 6 >12 6 >12
Extraits
au dichloro-
méthane
M. piperita 3 >12 3 12 6 12 6 >12 6 >12 3 >12
M.
pulegium
3 >12 6 6 12 >12 6 >12 6 12 12 >12
M. spicata 3 >12 6 >12 6 >12 6 >12 12 >12 3 >12
Extraits
méthanoli-
ques
M. piperita 12 >12 >12 - >12 - >12 - >12 - >12 -
M.
pulegium
12 12 >12 - >12 - >12 - 12 >12 >12 -
M. spicata 12 12 >12 - >12 - >12 - >12 - >12 -
Extraits
aqueux
M. piperita 3 3 >12 - >12 - >12 - 12 >12 >12 -
M.
pulegium
12 12 >12 - >12 - >12 - >12 - >12 -
M. spicata 3 >12 >12 - >12 - >12 - >12 - >12 -
6 Phytothérapie
cellules bactériennes à l’état planctonique sont les mêmes
choisies pour tester leur effet sur les cellules bactériennes à
l’état sessile : biofilm.
Activité sur le biofilm de S. aureus
La figure 2 résume les résultats de l’effet des extraits vis-à-vis
le biofilm formé par S. aureus. Après 48 heures de culture, le
biofilm formé à la surface des pièces d’acier inoxydable avant
la désinfection était de 3.96 ± 1.33 Log UFC/cm
2
.L’utilisa-
tion de la solution de contrôle a permis de réduire d’environ
2.66 Log UFC/cm
2
des cellules bactériennes fixées. L’utilisa-
tion de la solution désinfectante à base d’extraits hexaniques
et dichlorométhaniques s’est avérée très efficace. Aucune bac-
térie de S. aureus n’a pu être détectée sur les surfaces des
pièces d’acier après traitement de 30 min et ceci pour tous
les extraits testés sans exception.
Activité sur le biofilm d’E. coli 405
Les résultats de traitement du biofilm formé par E. coli sont
reportés par la figure 3. Le nombre de bactéries adhérentes
après 48 h de contact de la suspension bactérienne sur les
pièces d’acier était d’environ 4.19 ± 0.05 Log UFC/cm
2
.
Le traitement de ces pièces par la solution désinfectante de
contrôle a réduit le nombre de bactéries fixées à 2.40 ± 0.69
Log UFC/cm
2
. La solution désinfectante à base d’extraits a
permis d’enlever toutes les bactéries d’E. coli fixées et ceci
pour tous les extraits testés.
Dans le présent travail, les extraits hexaniques et dichlo-
rométhaniques de Mentha spicata, Mentha pulegium et Men-
tha piperita ont montrés une grande efficacité dans l’élimi-
nation de la totalité d’un biofilm de 48 heures des deux
souches bactériennes après un traitement de 30 min. La
solution contrôle s’est montrée efficace dans l’élimination
d’environ 2.66 Log UFC/cm
2
et 1.79 Log UFC/cm
2
du bio-
film formé par S. aureus et E. coli respectivement. Cette
efficacité reste modérée par rapport aux extraits testés. L’éli-
mination de toute trace du biofilm par les extraits, quel que
soit le gram de la bactérie testée, est peut être due, d’une part,
à leur richesse en huiles essentielles. En effet, dernièrement
plusieurs études ont été menées sur l’évaluation des effets
des huiles essentielles vis-à-vis les biofilms, visant leur uti-
lisation (ou l’utilisation de leurs constituants) comme désin-
fectants surtout dans l’industrie agroalimentaire. Ces études
ont révélé la capacité de plusieurs huiles essentielles à dégra-
der et/ou éliminer les biofilms. De Oliveira et al. [55]
ont montré que des solutions désinfectantes à base de
l’huile essentielle de Cymbopogon citratus et Cymbopogon
nardus L. ont réduit le nombre de cellules adhérés, d’un bio-
film de L. monocytogenes formé sur une surface en acier
inoxydable, après 60 min de contact. Gursoy et al. [56] ont
montré l’effet anti-biofilm de l’huile essentielle de Satureja
hortensis vis-à-vis d’un biofilm de Prevotellani grescens.
Une autre étude a montré que la présence de 5 composés
d’huiles essentielles a causé la réduction de l’activité méta-
bolique de biofilms de deux isolats pathogéniques de
L. monocytogenes [57]. El abed et al. [58] ont montré que
deux composés purs de diverses huiles essentielles (thymol
et carvacrol) inhibent la croissance d’un biofilm de Pseudo-
monas aeruginosa.Etd’autre part, à la nature fragile d’un
biofilm âgé de 48 h et qui reste plus au moins jeune et n’est
pas encore arrivé au stade de maturation. Au bout de ce temps,
les deux bactéries développent des biofilms qui ne dépassent
pas 10
5
UFC/cm
2
. Les études d’Anwar et al. [59] ont montré
que la résistance contre les divers désinfectants est plus
importante chez les biofilms plus âgés que chez les plus
jeunes. Ceci est peut être relié au fait que la majorité des
Fig. 2 Activité des extraits vis-à-vis le biofilm de S. aureus. H1,
H2 et H3: Extraits hexaniques de Mentha spicata, Mentha pule-
gium et Mentha piperita respectivement. DCM1, DCM2 et DCM3 :
Extraits dichloromethanoliques de Mentha spicata, Mentha pule-
gium et Mentha piperita respectivement
Fig. 3 Activité des extraits vis-à-vis le biofilm de E. coli 405. H1,
H2 et H3: Extraits hexaniques de Mentha spicata, Mentha pule-
gium et Mentha piperita respectivement. DCM1, DCM2 et DCM3 :
Extraits dichloromethanoliques de Mentha spicata, Mentha pule-
gium et Mentha piperita respectivement
Phytothérapie 7
cellules des jeunes biofilms sont encore à la phase réversible
d’adhérence, pendant cette phase les bactéries sont facilement
supprimées par l’application de forces minimum [60] et
même par un simple lavage [61].
Nous avons aussi constaté que S. aureus et E. coli 405
forment des biofilms qui ne dépassent pas 10
5
et 10
4
Log
UFC/cm
2
respectivement et ne développent pas de biofilms
épais. Valeriano et al. [15] ont trouvés que Salmonella ente-
rica développe un biofilm de l’ordre de 10
6
durant 48 h d’in-
cubation dans le Buillon Tryptone Soy (TSB).
Par ailleurs, selon Melo [62] plusieurs mécanismes
influencent l’attachement bactérien à une surface et qui sont
les caractéristiques des souches microbiennes, la composi-
tion et la rugosité de la surface d’adhérence, la disponibilité
et la concentration en nutriments, la charge de la surface, le
pH, la température, la concentration en électrolytes et le flux
de matériaux ainsi que le type de surface.
Conclusion
Dans le présent travail, on s’ est intéressé à l’étude de l’effet
antibactérien et anti-biofilm des extraits bruts (hexaniques,
dichlorométhaniques, méthanoliques et aqueux) de feuilles
de trois espèces de Mentha ; M. pulegium, M. pepirita et
M. spicata, plantes largement utilisées en médecine tradi-
tionnelle dans le Maroc. L’étude de l’activité antibactérienne
est déterminée d’abord qualitativement par le test de diffu-
sion en milieu gélosé puis quantitativement par la détermi-
nation des CMI et CMB en utilisant la technique de micro-
dilutions. Les deux tests utilisés dans ce travail ont montré
que les souches Gram (+) testées sont plus sensibles que les
souches Gram (-). En effet, les souches Gram (+) ont démon-
tré des zones d’inhibition plus grandes et des valeurs de CMI
plus faible en comparaison aux souches Gram (-). S. aureus
s’est montré la plus sensible de toutes les souches testées
alors que Y. enterocolitica s’est montrée la plus résistante.
Les hexaniques et dichlorométhaniques des espèces de
Mentha étudiées se sont montrés pourvues d’activités bacté-
riostatiques vis-à-vis toutes les souches bactériennes testées
sans exception et quel que soit leur Gram avec des CMI
comprises entre 1,5 et 12 mg/ml. Alors que les extraits métha-
noliques et les extraits aqueux se sont montrés sans activité aux
concentrations testées avec des valeurs de CMI supérieures à
12 mg/ml dans tous les cas étudiés sauf le cas de S. aureus.
L’étude de l’effet des extraits hexaniques et dichloromé-
thaniques sur l’élimination des biofilms de Staphylococcus
aureus et Escherichia coli, a permis de mettre en évidence la
grande capacité d’une solution désinfectante à base de ces
extraits à éliminer la totalité d’un biofilm de 48 quelle que
soit la Gram de la souche et quelque soit l’espèce de Mentha
étudiée. Par conséquence, ces extraits peuvent être de nou-
veaux alternatifs naturels pour assainir les surfaces d’acier
utilisées dans les industries agroalimentaires contaminées
par des bactéries pathogènes et qui conduisent à de graves
problèmes sanitaires et économiques. Pourtant ça sera inté-
ressant d’élargir nos études sur des biofilms plus âgés et sur-
tout sur la réduction du temps de traitement.
Au cours de cette étude, aucune différence remarquable
n’est enregistrée, entre les trois espèces étudiées de Mentha
que ce soit par rapport à leur effet antibactérien ou leur effet
sur la dégradation des biofilms.
Liens d’intérêts : les auteurs déclarent ne pas avoir de liens
d’intérêts.
Références
1. Alekshun MN, Levy SB (2007) Molecular mechanism of antibac-
terial multidrug resistance. Cell 128:1037–50
2. UNEP-WCMC Biodiversity data sourcebook (2002) United
nation environment program-World conservation monitoring cen-
ter, Cambridge, England
3. Duke JA (1993) Medicinal plants and the pharmaceutical indus-
try. In New Crops. Edited by J Janick, JE Simon John Wiley and
Sons, Inc., New York, NY, pp, 664–9
4. Costerton JW, Lewandowski Z, Caldwell DE, et al (1995).
Microbial biofilms. Ann Rev Microbiol 49:711–42
5. Cherrat L, Espina L (2014) Chemical composition, antioxidant and
antimicrobial properties of Mentha pulegium, Lavandula stoechas
and Satureja calamintha Scheele essential oils and an evaluation
of their bactericidal effect in combined processes. Innova Food
Sci Emerg T echnol 22:221–9
6. Işcan G, Kirimer N (2002) Antimicrobial Screening of Mentha
piperita Essential Oils. J Agric Food Chem 50:3943–6
7. Moreno L, Bello R (2002) Pharmacological properties of the metha-
nol extract from Mentha suaveolens Ehrh. Phytother Res 16:10–3
8. Nikiema W (2005) Propriétés pharmaco-chimiques de Calotropis
Procera Ait. (Asclepiadaceae) récolté au Mali : étude préclinique
des effets anti-inflammatoires et antimicrobiens des extraits des
écorces de racines. Thèse de Doctorat en pharmacie, université
de Bamako, 162 p
9. Manian R, Anusuya N, Siddhuraju P, et al (2008) The antioxidant
activity and free radical scavenging potential of two different sol-
vent extracts of Camellia sinensis (L.) O. Kuntz, Ficus bengalen-
sis L. and Ficus racemosa L. Food Chemistry 107:1000–7
10. Ismaili H, Milella L (2004) In vivo topical anti-inflammatory and
in vitro antioxidant activieties of two extracts of Thymus satu-
reioides leaves. J Ethno-Pharmacol 91: 31–6
11. Mann C, Markham J (1998) A new method for determining the
minimum inhibitory concentration of essential oils. J Appl Micro-
biol 84:538–44
12. Bagge D, Hjelm M (2001) Shewanella putrefaciens adhesion and
biofilm formation on food processing surfaces. Appl Environm
Microbiol 67:2319–25
13. Gram L, Bagge-Ravn D (2007) Influence of food soiling matrix
on cleaning and disinfection efficiency on surface attached Liste-
ria monocytogenes. Food Control 18:1165–71
14. Rossoni E, Gaylarde C (2000) Comparison of sodium hypochlo-
rite and peracetic acid as sanitizing agents for stainless steel food
processing surfaces using epifluorescence microscopy. Internat J
Food Microbiol 61:81–5
15. Valeriano C, Oliveira T (2012) The sanitizing action of essential
oil-based solutions against Salmonella enteric serotype Enteritidis
S64 biofilm formation on AISI 304 stainless steel 25:673–7
8 Phytothérapie
16. Lee SB, Cha KH (2007) The antimicrobial activity of essential
oil from Dracocephalum foetidum against pathogenic microorga-
nisms. J. Microbiol 45:53–7
17. Ozsoy N, Can A, Yanardag R, et al (2008) Antioxidant activity of
Smilax excels L. leaft extracts. Food Chemistr 110:571–83
18. Areias FM, Valentão P (2001) Phenolic fingerprint of peppe-
rmint leaves. Food Chemistr 73:307–11
19. Dorman HJD, Kosar M (2003) Antioxidant properties and
composition of aqueous extracts from Mentha species, hybrids,
varieties, and cultivars. J Agricult Food Chemistr 51:4563–9
20. Triantaphyllou K, Blekas G, Boskou D (2001) Antioxidative pro-
perties of water extracts obtained from herbs of the species
Lamiaceae. Internat J Food Sci Nutr 52:313–7
21. Tadesse M, Gulliksen B (2008) Screening for antibacterial and
antifungal activities in marine benthic invertebrates from northern
Norway. J Invertebr Pathol 99:286–93
22. Hambaba L, Boudjellal K (2012) Etude in vitro des activités anti-
microbienne et antioxy-dante des extraits du fruit d’Elaeagnus
angustifolia L. Phytothérapie 10:350–6
23. El-Amraoui B, Biard JF (2010) Antifungal and antibacterial acti-
vity of Porifera extracts from the Moroccan Atlantic coasts. J
Mycol Med 20:70–4
24. Cosentino S, Tuberoso C.IG (1999) In vitro antimicrobial activity
and chemical composition of Sardinian Thymus essential oils.
Lett Appl Microbiol 29:130–5
25. Karaman I, Sahin F (2003) Antimicrobial activity of aqueous and
methanol extracts of Juniperus oxycedrus L. J Ethnopharmacol
85:231–5
26. Mahboubi M, Haghi G, (2008) Antimicrobial activity and chemi-
cal composition of Mentha pulegium L. essential oil. J Ethno-
pharmacol 119:325–7
27. McCaffrey E, Endean R (1985) Antimicro-bial activity of tropical
and sub-tropical sponges. Mar Biol 89:1–8
28. Nedorostova L, Kloucek P (2009) Antimicrobial properties of
selected essential oils in vapour phase against foodborne bacteria.
Food Control 20:157–60
29. Nevas M, Korhonen AR (2004) Antibacterial efficiency of fin-
nish spice essential oils against pathogenic and spoilage bacteria
J Food Prot 67:199–202
30. Sahin F, Karaman I (2002) Evaluation of antimicrobial activities
Satureja hortensis L. J Ethnopharmacol 87:61–5
31. Ali-Shtayeh M, Yaghmour R (1998) Antimicrobial activity of
20 plants used in folkloric medicine in the Palestinian area. J Eth-
nopharmacol 60:265–71
32. Basli A, Chibane M (2012) Activité antibactérienne des polyphé-
nols extraits d’une plante médicinale de la flore d’Algérie : Ori-
ganum glandulosum Desf. Phytothérapie 10:2–9
33. Hogan D, Kolter R (2002) Why are bacteria referactory to anti-
microbials. Curr Op Microbiol 5:272–4
34. Qualleh H, Idid S (2010) Antifungal and antibacterial activities of four
Malaysian sponge species (Petrosiidae) J Mycol Med 20:315–20
35. Touré A, Bahi C (2011) Phytochimical screening and in vitro
antifungicalactivities of extracts of lraves of Morinda morindoi-
des (Morinda, Rubiaceae) J Med Plants Res 5(31):6780–6
36. Biyiti LF, Meko’
o DJL, Tamzc V, et al (2004) Recherche de l’ac-
tivité
antibactérienne de quatre plantes médicinales camerounai-
ses. Pharm. Med Trad Afr 13:11–20
37. Cowan MM (1999) Plants products as antimicrobial activity. Clin
Microbiol Rev 4 (12):564–82
38. Kolodzie JH., Kayser O (1999) Evaluation of the antimicrobial
potency of tannins and related compounds using the rnicrodilu-
tion broth method. Planta Med 65:444–446
39. Scalbert A (1991) Antimicrobial properties of tannins. Phytoche-
mistry 30:3875–83
40. Daferera DJ, Ziogas BN, Polissiou MG (2003) The effectiveness
of plant essential oils on the growth of Botrytis cinerea, Fusarium
sp. and Clavibacter michiganensis subsp. Michiganensis. Crop
Protection 22:39–44
41. Economou KD, Oreopolou O, Thomopoulos CD (1991) Antioxi-
dant activity of some plant extracts of the family Labiatae. Jour-
nal of the American Oil Chemists’ Society 68:109–13
42. Kaur C, Kapoor HC (2002) Anti-oxidant activity and total phe-
nolic content of some Asian vegetables. Internat J Food Sci Tech-
nol 37(2):153–61
43. Aghel N, Yamini Y (2004). Supercritical carbon dioxide extrac-
tion of Mentha pulegium L. essential oil. Talanta 62:407–11
44. Ait-Ouazzou A, Lorán S (2012a) Evaluation of the chemical
composition and antimicrobial activity of Mentha pulegium, Juni-
perus phoenicea and Cyperus longus essential oils from Morocco.
Food Res Internat 45:313–9
45. Hajlaoui H, Trabelsi N (2009) Biological activities of the essen-
tial oils and methanol extract of tow cultivated mint species
(Mentha longifolia and Mentha pulegium) used in the Tunisian
folkloric medicine. W J Microbiol Biotechnol 25:2227–38
46. Kamkar A, Javan AJ, Asadi F et al (2010) The antioxidative
effect of Iranian Mentha pulegium extracts and essential oil in
sunflower oil. Food Chem Toxicol 48: 1796–1800
47. Lorenzo D, Paz D (2002) Essential oils of Mentha pulegium and
Mentha rotundifolia from Uruguay. Brazilian Arch Biol Technol
45(4):519–24
48. Duru ME, Öztürk M (2004) The constituents of essential oil and
in vitro antimicrobial activity of Micromeria cilicica from Turkey.
J Ethnopharmacol 94:43–8
49. Lawrence BM (1997) Progress in essential oils: peppermint oil.
Perfum. FlaVor 22 : 57–66
50. Spencer JS, Dowd E, Faas W (1997) The genuineness of two
Mint essential oils. Perfum. FlaVor 22:37–45
51. Deans SG, Svoboda KP (1988) Antibacterial activity of French
Tarragon (Artemisia dracunculus Linn.) essential oil and its
constituents during ontogeny. J Hortic Sci 63:503–8
52. Ait-Ouazzou A, Lorán S (2011a) Chemical composition and anti-
microbial activity of essential oils of Thymus algeriensis, Euca-
lyptus globulus and Rosmarinus officinalis from Morocco. J Sci
Food Agricult 91(14):2643–51
53. Burt S (2004) Essential oils: their antibacterial properties and
potential applications in foods-a review. Internat J Food Micro-
biol 94:223–53
54. Essawi T, Srour M (2000) Screening of some Palestinian medici-
nal plants for antibacterial activity. J Ethnopharm 70:343–9
55. De Oliveira MMM, Brugnera DF (2010) Disinfectant action of
Cymbopogon sp. essential oils in different phases of biofilm for-
mation by Listeria monocytogenes on stainless steel surface.
Food Control 21(4):549–53
56. Gursoy UK, Gursoy M (2009) Anti-biofilm properties of Satureja
hortensis L. essential oil against periodontal pathogens. Anaerobe
15:164
–7
57.
Sandasi M, Leonard CM, Viljoen AM (2008) The effect of five
common essential oil components on Listeria monocytogenes
biofilms. Food Control 19:1070–5
58. El abed S, Ibnsouda koraichi S (2011) Carvacrol and thymol
components inhibiting Pseudomonas aeruginosa adherence and
biofilm formation. Afr J Microbiol Res 5(20):3229-32
59. Anwar H, Dasgupta M (1990) Testing the susceptibility of bacte-
ria in biofilms to antibacterial agents. Antimicrob Agents Chemo-
ther 34:2043–6
60. Watnick P, Kolter R (2000) Minireview:Biofilm, city of micro-
bes. J Bacteriol 182:2675–9
61. Strevett K, Chen G (2003) Microbial surface thermodynamics
and applications. Res Microbio 154: 329–35
62. Melo L (2003) Biofilm formation and its role in fixed film pro-
cesses. In: The Handbook of Water and Wastewater Microbio-
logy. London, UK, Academic Press 337–49
Phytothérapie 9
