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1
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA
DE MÉXICO
FACULTAD DE CIENCIAS
LAS CATALASAS DE D. hansenii: ANÁLISIS DE LA
COMPLEMENTACIÓN HETERÓLOGA EN UNA MUTANTE
ACATALASÉMICA DE S. cerevisiae
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE:
BIOLOGO
P R E S E N T A :
MIGUEL ANGEL GARCÍA CAMPOS
DIRECTORA DE TESIS:
DRA. CLAUDIA ANDREA SEGAL KISCHINEVZKY
2014
2
1. Datos del alumno
García
Campos
Miguel Angel
62 84 34 57
Universidad Nacional Autónoma de
México
Facultad de Ciencias
Biología
408030452
2. Datos del tutor
Dra.
Claudia Andrea
Segal
Kischinevzky
3. Datos del sinodal 1
Dra.
Martha Eydi Ruse
Calahorra
Fuertes
4. Datos del sinodal 2
M. en C.
Norma Silvia
Sánchez
Sánchez
5. Datos del sinodal 3
Biól.
Geovani
López
Ortiz
6. Datos del sinodal 4
Biól.
Mónica
Ramírez
Hernández
7. Datos del trabajo escrito.
Las catalasas de D. hansenii: Análisis de la complementación heteróloga en una
mutante acatalasémica de S. cerevisiae
67p
2014
3
El presente trabajo de tesis se llevó a cabo en el Laboratorio de Biología
Molecular y Genómica del Departamento de Biología Celular de la
Facultad de Ciencias, bajo la tutoría de la Dra. Claudia Andrea Segal
Kischinevzky.
Parte de esta investigación fue financiada gracias al programa PAPIIT,
proyecto IN218611, “Estrés oxidativo en Debaryomyces hansenii”.
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Dedicatoria
A mi madre María del Rocío Campos Regalado, porque aun con las
innumerables adversidades que enfrentamos año tras año, me ha
apoyado durante mis 25 años de vida, en los que hemos aprendido a ser
compañeros de vida, tratarnos como iguales, amarnos y procurarnos en
las buenas y en las malas. Gracias por no dejarme sólo.
A mi abuela Rosa Amelia Regalado Hernández, porque es la persona que
más me ha enseñado a sonreír y hacerle frente a la vida con esa sonrisa,
siendo yo mismo. Gracias por quererme tal cual soy.
5
Agradecimientos
Agradezco a la Dra. Claudia Andrea Segal Kischinevzky por todo el apoyo
que me ha brindado a lo largo de este proyecto, e incluso antes y después.
Al recibirme con amabilidad, orientarme en la investigación y siempre
buscar mi superación como investigador en formación. Sus consejos y
enseñanzas me han servido para crecer como estudiante y como ser
humano. ¡Muchas gracias Clau!
A la Dra. Luisa Alvarina Alba Lois por abrirme las puertas a su laboratorio
al realizar el servicio social y volver a recibirme para realizar la tesis con
Claudia, además de su apoyo y consejos. Al Dr. Víctor Valdez López y al M.
en C. José Vilchis Peluyera por el apoyo y las recomendaciones que me
dieron al ser parte de su laboratorio. A la Quím. Viviana Escobar Sánchez
y al M. en C. Arístides III Sampieri Hernández, por el apoyo técnico
recibido, las pláticas y las recomendaciones prácticas en el trabajo diario.
A Mónica Ramírez Hernández por ser una excelente compañera de
laboratorio, y brindarme su tiempo y apoyo como amiga. A Román
Alfonso Castillo Díaz por siempre estar dispuesto a ayudarme en el
trabajo de laboratorio.
A mis sinodales el Biól. Geovani López, la M. en C. Norma Silvia Sánchez
Sánchez, la Dra. Martha Eydi Ruse Calahorra Fuertes, y la Biól. Mónica
Ramírez Hernández por el tiempo y la seriedad con la que revisaron mi
trabajo de tesis, y sus observaciones atinadas.
Al programa PAPIIT IN218611 “Estrés oxidativo en Debaryomyces
hansenii” por el apoyo económico brindado.
A todos mis amigos: Ricardo, Alan, Daniel, Eder, Diana, Rigel, Fernanda,
Elena, Marcos, Leopoldo, Rubén, Tania, y los que me faltan. Gracias por el
apoyo, los buenos ratos y las enseñanzas de vida en estos años, porque sin
eso no estaría titulándome.
A la persona que ha estado apoyándome y aguantándome durante ya más
de 2 años, y aun así sigue buscando siempre hacerme reír y que me sienta
bien, gracias Gerardo.
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“Nearly everything is really interesting if you go into it deeply enough”
-Richard P. Feynman
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ÍNDICE
I. RESUMEN..................................................................................................................................................................... 8
II. INTRODUCCIÓN.….................................................................................................................................. 9
Las levaduras. Empezando por el principio............................................................................................................... 9
Saccharomyces cerevisiae. Una levadura antropológica............................................................................................ 9
S. cerevisiae como organismo modelo y la complementación homóloga........................................................... 11
Debaryomyces hansenii, una levadura extrema............................................................................................................. 13
D. hansenii en procesos biotecnológicos.......................................................................................................................... 16
Estrés oxidativo y las especies reactivas de oxígeno................................................................................. 17
Origen del oxígeno atmosférico, agente tóxico en la vida temprana................................................................... 17
La toxicidad del oxígeno.......................................................................................................................................................... 18
Estrés oxidativo, bagatelas en el siglo XX........................................................................................................................ 19
Formación de las ERO.............................................................................................................................................................. 20
Blancos celulares de las ERO y patologías asociadas................................................................................................. 22
Funciones fisiológicas relacionadas a ERO..................................................................................................................... 23
Antioxidantes............................................................................................................................................................................... 25
H2O2, una ERO con dos caras................................................................................................................................................. 27
Catalasas......................................................................................................................................................................................... 28
Catalasas en S. cerevisiae y D. hansenii.............................................................................................................................. 30
III. ANTECEDENTES...................................................................................................................................................... 31
IV. JUSTIFICACIÓN........................................................................................................................................................ 33
V. OBJETIVOS................................................................................................................................................................. 34
VI. MATERIALES Y MÉTODOS..................................................................................................................................... 35
Cepas y medios de cultivo.................................................................................................................................................... 35
Mantenimiento de las cepas y condiciones de cultivo......................................................................................... 37
Protocolo: Curvas de crecimiento................................................................................................................................... 37
Cálculo de tiempo de duplicación.................................................................................................................................. 38
Protocolo: Obtención del extracto crudo.................................................................................................................... 39
Protocolo: Cuantificación de proteínas en extractos crudos por el método de Bradford.............. 40
Protocolo: Ensayo de actividad específica de catalasa........................................................................................ 40
Protocolo: Ensayo de sensibilidad a choque por peróxido de hidrógeno................................................ 41
Análisis bioinformático de secuencias de aminoácidos..................................................................................... 42
VII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN................................................................................................................................. 43
Curvas de crecimiento............................................................................................................................................................ 43
Tiempo de duplicación en fase de crecimiento exponencial........................................................................... 44
Ensayos de actividad de catalasa..................................................................................................................................... 47
Ensayos de sensibilidad a choque por peróxido de hidrógeno...................................................................... 51
Adaptaciones halofílicas de las catalasas DhCTA y DhCTT: análisis bioinformático.......................... 54
VIII. Perspectivas.................................................................................................................................................... 58
IX. CONCLUSIONES......................................................................................................................................... .............. 59
X. REFERENCIAS............................................................................................................................................................ 60
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I. RESUMEN
Debaryomyces hansenii es una levadura aislada por primera vez del mar, pero
presente en diversos hábitats naturales y creados por el hombre. Estos en su mayoría
presentan baja actividad acuosa, altos contenidos de sales y temperaturas bajas. Por lo
que D. hansenii ha tenido que desarrollar sistemas celulares de resistencia ante tales
tipos de estrés.
El estrés oxidativo es un efecto secundario del metabolismo aerobio, la presencia del
oxígeno en las células, y el desequilibrio entre la consecuente generación de especies
reactivas de oxígeno y los sistemas que las controlan. Este estrés provoca daños a
estructuras celulares como DNA, lípidos y proteínas, por lo que está relacionado con
diversas enfermedades como cáncer, diabetes, ateroesclerosis, enfermedades
cardíacas, Alzheimer, envejecimiento, entre otras.
A partir de la experiencia que se ha obtenido del modelo biológico Saccharomyces
cerevisiae, y de las investigaciones que se han realizado en la levadura D. hansenii, se
han realizado estudios en los genes que codifican a las catalasas de la segunda,
llamados DhCTT y DhCTA. La presente investigación se centró en caracterizar la
fisiología y bioquímica de cepas mutantes acatalasémicas de S. cerevisiae,
transformadas con los genes de catalasa de D. hansenii.
Los resultados demostraron que las cepas complementadas con los genes de catalasa
de D. hansenii, presentan características fisiológicas y bioquímicas diferentes a la cepa
silvestre de S. cerevisiae, obteniendo en la mayoría de los casos mejores tasas de
crecimiento y mayor resistencia a estrés oxidativo que esta última. Se concluyó que la
catalasa T de D. hansenii tiene notables contribuciones como sistema de defensa
contra el estrés oxidativo, tanto endógeno como exógeno. Por otra parte se obtuvieron
indicios y respaldo experimental de la regulación de ambos genes expresados en la
levadura modelo.
9
II. INTRODUCCIÓN
Las levaduras. Empezando por el principio
La palabra inglesa yeast para levadura, ha sido usada desde poco antes del año 1,000
de nuestra era; su origen proviene del inglés antiguo gyst que significó “hervir”,
“espumar”, “burbujear” y este probablemente del sánscrito yásati (hierve)
(Dictionary.com-Unabridged); en español, el diccionario de la Real Academia de la
Lengua Española, da referencia a que la palabra proviene de “levar”, “levantar”, como
lo es la acción que tiene la masa de pan al agregársele levadura, pero también define la
palabra con un enfoque biológico más actualizado, como: el nombre genérico que se le
da a ciertos hongos unicelulares, que tienen forma ovoidea, se reproducen por
gemación o división y que producen enzimas capaces de descomponer diversos
cuerpos orgánicos, principalmente los azúcares, en otros más sencillos.
Las levaduras han estado presentes a lo largo de cada una de nuestras vidas, y sin
percatarnos, lo han estado en toda la historia de la civilización humana; pero su
carácter microscópico las ha despojado por mucho tiempo del protagonismo que
merecen. Quedo en que la siguiente información, cambie este punto de vista del lector.
Saccharomyces cerevisiae. Una levadura antropológica.
Saccharomyces cerevisiae es un hongo perteneciente al phylum Ascomycota, siendo la
principal característica de este grupo la formación de una estructura microscópica
sexual llamada asca, la cual da origen a esporas no mótiles, llamadas ascosporas;
aunque algunas especies pueden formar ascas de forma asexual.
Presente en la vida del ser humano por milenios, el uso de S. cerevisiae, aunque fue
inconsciente, se remonta de acuerdo a evidencias arqueológicas a 7,000 años antes de
nuestra era en la producción de bebidas fermentadas en China (McGovern et al.,
2004), pero se estima que el uso de este hongo y la domesticación de las cepas se
10
remonta aún más, a los inicios de la civilización humana en Mesopotamia, hace más de
10 mil años (Legras et al., 2007).
Desde entonces S. cerevisiae ha jugado un papel importante en el procesamiento de
diversos tipos de alimentos, y también ha sido parte del proceso de diversificación
cultural. S. cerevisiae participa en la elaboración de panes, vinos, cervezas,
preparaciones fermentadas de fruta o leche y otras bebidas alcohólicas, y las
diferentes cepas o variedades que existen en la actualidad se han diversificado
reflejando la historia humana, pues estas se han generado a partir de los procesos de
migración de nuestra especie, teniendo así una estrecha relación con el hombre y sus
alimentos; la plantación de viñedos y granos, que son fermentados para la obtención
de bebidas alcohólicas; los lugares en los que se realizan los procesos de
fermentación, como los sótanos, ambientes ideales para su alojamiento; y a sus otros
usos, como el de “elevar” la masa de pan (Legras et al., 2007).
El desarrollo tecnológico de las bebidas alcohólicas es un fenómeno casi universal, las
sociedades humanas en distintos niveles de complejidad han descubierto cómo hacer
bebidas fermentadas a partir de las fuentes de azúcares de sus hábitats locales
(McGovern, 2003), este fenómeno casi universal puede ser explicado por los
evidentes efectos combinados del etanol: analgésico, desinfectante y de alteración de
la mente. Quizá siendo el más importante el segundo, ya que es sabido que en la
cultura occidental, desde la primeras civilizaciones históricas como Egipcia,
Mesopotámica, Hebrea, Asiria, Romana o Griega hasta el siglo XIX, consideraban al
agua como inadecuada para el consumo, debido a que regularmente esta generaba
enfermedades agudas o crónicas al ser ingerida; y a diferencia de la cultura oriental, el
método de purificación por ebullición era desconocido o desdeñado en esta zona
geográfica (Jansson et al., 1994).
No cabe duda que los productos alimenticios generados a partir de la fermentación,
que en gran medida es causada por S. cerevisiae, han llegado a marcar identidades
culturales, como lo es el sake para Japón, la cerveza para Alemania.
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Con esto en mente no cabe duda que en el momento en el que los estudios de las
ciencias biológicas se volvieron más finos, los investigadores centraron
inmediatamente su atención en S. cerevisiae; y debido a que resultó ser un organismo
con amplia versatilidad experimental, bajo costo de mantenimiento y rápida tasa de
crecimiento se ha convertido en la actualidad en uno de los organismos modelo más
estudiados.
S. cerevisiae como organismo modelo y la complementación homóloga.
El primer genoma eucarionte secuenciado fue el de S. cerevisiae y se liberó de forma
electrónica en 1996 (Cherry et al., 1998). La importancia del estudio de S. cerevisiae en
las ciencias biológicas radica principalmente en que al ser un organismo eucarionte,
los hallazgos de su biología en general pueden ser extrapolados a distintas ramas de la
biología, incluyendo al estudio del ser humano.
Pero en primera instancia ¿qué tan similar es con respecto a los mamíferos? Hasta
donde se sabe, el 31% de las secuencias con potencial para codificar proteínas tienen
un homólogo en proteínas de mamífero (Botstein et al., 1997), lo cual es remarcable
tomando en cuenta el tiempo de divergencia entre los reinos Fungi y Animalia, el cual
fue aproximadamente hace 1,600 millones de años (Wang et al., 1999). Por lo que la
probabilidad de que un nuevo gen descubierto en humano tenga su homólogo en la
levadura es bastante buena, más aun la manipulación genética en levadura es fácil y
barata, mientras que tal manipulación no lo es así en sistemas mamíferos aun cuando
sea posible.
La importancia del estudio de la biología molecular de la levadura, como organismo
modelo para toda la biología eucariota, puede justificarse por la facilidad con la que se
puede establecer la relación entre estructura del gen y función de su proteína
(Botstein et al., 1988).
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El desarrollo de diversas técnicas de manipulación genética ha hecho posible el
objetivo anterior. Por ejemplo, a través de la deleción de genes en S. cerevisiae es
posible observar los efectos que genera la falta de ese gen en el organismo o en sus
partes. Estas modificaciones en el genoma de la levadura pueden ser benéficas o
neutrales bajo ciertas condiciones, pero comúnmente se presentan como deletéreas o
letales, presentando fenotipos que proporcionan pistas de la función del gen
suprimido y de su proteína, en el caso de codificar alguna.
La complementación homóloga sería la contraparte a la deleción como herramienta
genética, por la cual se introduce nuevamente el gen que se removió, de forma que se
demuestra que la causante del fenotipo deletéreo era la falta del gen; si el gen con el
que se restaurará la función perdida pertenece a otro organismo, se le denomina
complementación heteróloga. Por medio de esta técnica es posible recuperar el
fenotipo silvestre o generar distintos fenotipos, que proporcionan información de las
características del gen insertado y de la función de su proteína en el caso
correspondiente.
Los mejores ejemplos relativos al uso de esta tecnología usando a la levadura como
organismo modelo, conciernen a los avances en la comprensión de las enfermedades
genéticas humanas, de las cuales en muchos casos sólo se conocía que la herencia de
los genes resultaba en la enfermedad. Un ejemplo ilustrativo es el caso del síndrome
de Lynch o cáncer colorrectal hereditario no asociado a poliposis, que está asociado a
los genes homólogos MSH2 y MLH1 en S. cerevisiae. Las células con mutaciones en
estos genes presentan inestabilidad en las secuencias cortas, fenotipo celular
compartido entre células de mamífero y de levadura. Otros ejemplos de enfermedades
genéticas que han sido mejor comprendidas gracias al estudio de S. cerevisiae serían:
Ataxia-telangiectasia (TEL1 en levadura), Neurofibromatosis tipo 1 (IRA2 en
levadura), y el síndrome de Werner (SGS1 en levadura); en este último el fenotipo
celular compartido es un máximo de tiempo de vida acortado, y se descubrió que el
gen mutado codifica para una DNA helicasa en levadura, muy probablemente
codificando una proteína de igual función en humano (Botstein et al., 1997).
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En las áreas de biología molecular, biotecnología y farmacéutica, la expresión de
proteínas foráneas ha sido una herramienta para el aprovechamiento biológico que ha
recurrido al uso de S. cerevisiae, ya que al ser tan ampliamente usada en procesos
biotecnológicos tradicionales, esta levadura es clasificada como “organismo
generalmente considerado seguro” (GRAS por sus siglas en inglés) (Ostergaard et al.,
2000), y esto ha permitido que tanto el trabajo de laboratorio como la generación de
productos sea sencilla y segura.
La expresión de proteínas foráneas se realiza al insertar el gen deseado en la levadura,
mediante vectores de expresión genética, los cuales pueden integrarse al genoma o
expresarse en forma de plásmidos; pero la simple inserción en un vector no garantiza
un alto nivel de expresión de la proteína foránea. La expresión génica es un proceso
multifactorial y pueden surgir problemas en distintas etapas de la producción de una
proteína, desde el reconocimiento y transcripción del gen hasta la estabilidad de su
proteína.
Con todo lo anterior, podemos asegurar que Saccharomyces cerevisiae es la levadura
mejor estudiada y la mayoría de nuestros conocimientos de expresión heteróloga en
eucariontes proviene de estudios realizados en este organismo (Breuer & Harms,
2006); sin embargo, S. cerevisiae tiene limitaciones y no es apta para todos los fines
biotecnológicos, por lo menos no en su forma silvestre.
Debaryomyces hansenii. Una levadura extrema.
Dadas las limitaciones de S. cerevisiae como organismo modelo y de producción, se
han realizado esfuerzos por investigar otras levaduras para obtener un conocimiento
más amplio de la diversidad genética y metabólica esperada en éstas. Por ejemplo, se
generó interés en las levaduras extremófilas, entre estas Debaryomyces spp. que
probaron ser levaduras genética y bioquímicamente interesantes con amplia promesa
biotecnológica (Breuer & Harms, 2006).
14
El género Debaryomyces se caracteriza por ser osmotolerante y los miembros de este
género pueden crecer hasta en 4 M de NaCl, mientras que S. cerevisiae está limitada a
menos de 1.7 M de NaCl (Breuer & Harms, 2006), lo cual lo hace biotecnológicamente
interesante, ya que permite la producción cuasi-no-estéril y altas concentraciones de
producto/volumen entre otras ventajas (Breuer & Harms, 2006). Sin embargo, este
género presenta dificultades para ser transformado y no se han logrado realizar en él
técnicas de genética clásica, como deleciones o cruzas, lo que ha dificultado su estudio.
Entre las levaduras Debaryomyces se encuentra la especie D. hansenii var. hansenii,
que destaca marcadamente como organismo extremófilo, ya que tiene características
osmo-, xero-, halo-, quimio- y criotolerantes (Breuer & Harms, 2006; Davenport,
1980). Los primeros estudios de esta levadura los realizó Norkrans en 1966,
aislándola del mar, estos constaron de analizar su crecimiento en distintas
concentraciones de NaCl (Norkrans, 1968), por lo que es considerada generalmente
como una levadura marina (González-Hernández & Peña, 2002; Butinar et al., 2005),
pero también se le encuentra en diversos hábitats, frecuentemente con baja actividad
acuosa, naturales tales como: el agua de mar, formando parte de la microbiota
intestinal de truchas, suelo, fruta; y artificiales como: queso, carne, vino, cerveza,
productos con altos niveles de azúcar o sal y productos en congelación (Dalton et al.,
1984; Flores et al., 2004; Ferreira & Biljoen, 2003; Reyes-Becerril et al., 2008;
Petersen et al., 2002; Guerzoni et al., 1993).
D. hansenii se caracteriza por poder crecer en un medio con hasta 25% de NaCl o 18%
de glicerol (Butinar et al., 2005), asimila un amplio espectro de sustratos de carbono,
como lo muestra la tabla 1. D. hansenii tiene alta tolerancia al estrés químico, por lo
que puede ser cultivada en altas concentraciones de muchos sustratos, sin embargo
presenta crecimiento pobre en ausencia de oxígeno (Tilbury, 1980). Su temperatura
de crecimiento óptimo se encuentra entre los 20 – 25 °C, pero el crecimiento entre 5 –
10 °C e incluso debajo de 0 °C ha sido reportado (Davenport, 1980), y su rango de pH
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es de 3.0 a 10 en diferentes condiciones de temperatura y actividad acuosa (van den
Tempel, 2000).
Glucosa
+
Melecitosa
V
N-Acetil-D-glucosamina
V
D-Gluconato
+/D
Galactosa
+
Inulina
V
Metanol
-
DL-Lactato
V
L-Sorbosa
V
Almidón soluble
V
Etanol
+/D
Succinato
+
Sacarosa
+
D- Xilosa
+
Glicerol
+
Citrato
V
Maltosa
+
L-Arabinosa
+/D
Eritritol
V
Inositol
-
Celobiosa
+
D-Arabinosa
V
Ribitol
+
Hexadecano
V
Trehalosa
+
L-Rhamnosa
V
D-Manitol
+
Nitrato
-
Lactosa
V
D-Glucosamina
V
D-Glucitol
+/D
Nitrito
V
Melibiosa
V
2-ceto-D-gluconato
+
α-Metil-D-glucósido
+
5-Ceto-D-gluconato
V
Rafinosa
+
Sacarato
-
Salicina
+/D
Ribosa
V
Dulcitol
V
+, positiva; D, débil; V, variable; -, negativa.
Tabla 1. Asimilación de sustratos por D. hansenii. Tomada de Breuer & Harms, 2006
basándose en los trabajos de Nakase et al. 1998.
Una amplia revisión de la filogenia, ecología, fisiología y biología molecular de D.
hansenii fue realizada por Breuer et al. en el año 2006 (Breuer & Harms, 2006), siendo
una de las mejores referencias para empezar a conocer sus características particulares
y tener referencias de los estudios realizados sobre este organismo.
Debido a las características que hacen a D. hansenii una levadura extrema, fue incluida
por el Consorcio Génolevures para ser completamente secuenciada, publicándose un
adelanto de su genoma en el año 2000 y completamente en el 2004 (Rosa & Peter,
2006; Dujon et al., 2004; Lépingle et al., 2000). Gracias a este adelanto científico, el
trabajo de investigación en D. hansenii a nivel molecular y genético se ha visto
ampliamente beneficiado.
16
D. hansenii en procesos biotecnológicos
Como anteriormente fue mencionado, las levaduras han formado parte de los
procesos de transformación de alimentos humanos desde tiempos ancestrales, esta no
es la excepción con D. hansenii, ya que es común de encontrar en todo tipo de quesos
(Ferreira & Biljoen, 2003; Petersen et al., 2002; Borelli et al., 2006). Su presencia en
los quesos afecta características importantes que determinan su valor, como el olor,
color y sabor; estos son generados debido a la coloración del propio hongo, del color
que adquieren sus ascosporas y a las sustancias volátiles y no volátiles que produce
(van den Tempel & Jakobsen, 2000; Hansen & Tempel, 2001; Nakase et al., 1998;
Nichon et al., 1996; Arfi et al., 2002; Leclercq-Perlat et al., 2004). Incluso se ha
demostrado que existe una sucesión microbiana entre diferentes cepas de D. hansenii
en la producción de un solo tipo de queso, debido a las diferentes condiciones que se
generan en el proceso (Petersen et al., 2002).
Así como D. hansenii ha demostrado ser relevante para la elaboración de distintos
tipos de quesos, esta levadura también es importante en el procesamiento de carnes
fermentadas; Dalton y cols. encontraron que D. hansenii era la levadura más común en
383 aislados de muestras de embutidos (Dalton et al., 1984), indicando su
importancia en estos productos cárnicos; la participación en este proceso es conocida
desde los años 1960’s, cuando Rankine y cols. describieron brevemente cepas
inespecíficas de Debaryomyces como productoras de sulfito de hidrógeno, compuesto
que sirve como conservador en la carne (Rankine, 1964).
D. hansenii también tiene potencial para ser usada en aplicaciones biotecnológicas de
alta tecnología, como lo son la síntesis de compuestos orgánicos y enzimas relevantes
para la industria química, farmacéutica, agroquímica y alimenticia. De entre los
compuestos que es capaz de sintetizar se encuentran: D-arabinitol y xilitol,
principalmente usados como edulcorantes; riboflavina, vitamina relevante en la
alimentación humana; ácido pirúvico, sustancia con amplio uso en la industria
química y farmacéutica. Debido a su versatilidad, puede ser competitiva como fuente
17
de superóxido dismutasa (SOD) (EC 1.15.1.1), una metaloenzima con aplicaciones
médicas tales como la modulación de la respuesta inmune, regresión de tumores
malignos, protección en quimioterapia, artritis y tratamientos antienvejecimiento
(Breuer & Harms, 2006).
Biotecnológicamente, D. hansenii es un organismo prometedor debido a
características clave que posee: a) oleagenicidad, la capacidad de acumular del 20 al
25% de su biomasa en aceite; b) las levaduras pueden producir lípidos
potencialmente útiles que no producen las plantas; c) halotolerancia, esta resistencia
puede ser útil para generar cepas industriales para procesos con estrés salino; d)
adicionalmente existe el interés de generar plantas resistentes a la salinidad (Serrano,
1996) para incrementar el área de tierras cultivables en el planeta, expresando los
genes que le confieren a D. hansenii la resistencia a sal (Breuer & Harms, 2006); e) no
patogenicidad, esta característica es crucial para disminuir tiempos y costos de
desarrollo de un producto biotecnológico, sin embargo se han reportado algunos
casos emergentes de patogenicidad en humanos de D. hansenii, uno de infección en
hueso y otro en el que generó alveolitis alérgica extrínseca (Qong et. Al, 1982;
Yamamoto & Osanai, 2002), por lo que es necesario su estudio en esta área para
conocer esta posibilidad y evitarlo.
Estrés oxidativo y las especies reactivas de oxígeno.
Origen del oxígeno atmosférico, agente tóxico en la vida temprana
La Tierra tiene poco más de 4.5 giga años (giga = G = 1x109) de edad, es decir 4,500
millones de años. Durante los primeros 500 millones de años, eón geológico conocido
como el Hadeano, el ambiente de la Tierra estuvo caracterizado por frecuentes y
masivos impactos de meteoritos, algunos de los impactos tenían tal fuerza que se
piensa que pudieron ser capaces de evaporar toda el agua del planeta; al finalizar
estos fenómenos comenzó el eón Archeano, que se caracteriza por el inicio de la vida,
18
probablemente comenzando hace aproximadamente 3.8 a 4.0 G-años. Los primeros
estromatolitos fósiles, que contienen la evidencia de la fijación biológica de carbono,
tienen 3.8 G-años de edad, y sólo tomó 0.3 G-años para que evolucionara la vida
fotosintética, en forma de los ancestros de las cianobacterias con el fotosistema II,
comenzando así un proceso de cambio atmosférico que alteraría la vida en su
totalidad: la generación de una atmósfera oxidante (Xiong & Bauer, 2002).
En aproximadamente 1 G-año, las cianobacterias incrementaron los niveles de
dioxígeno (O2) aproximadamente en un cuarto del nivel actual. Algunos sugieren que
el éxito de las cianobacterias no sólo fue debido a la ventaja energética de la
fotosíntesis, la cual produce 18 veces más energía que el metabolismo anaerobio
(Dismukes et al., 2001), sino también por la inhibición de competidores a través de la
creación de un agente tóxico, el dioxígeno (O2) (Xiong & Bauer, 2002).
La toxicidad del oxígeno
La popularización del conocimiento del uso de dioxígeno como parte esencial de
nuestra respiración y su presencia en nuestra atmósfera, muchas veces nos hace
desconocer u olvidar sus efectos tóxicos.
La toxicidad del oxígeno se explica debido a la formación de las especies reactivas del
oxígeno (ERO). Estas especies de O2 son moléculas altamente reactivas, algunas ERO
son radicales, es decir tienen electrones desapareados, sin embargo el hecho de que
una molécula sea un radical no indica una alta reactividad (Hansberg, 2008).
Se consideran ERO al oxígeno atómico (O), generado al romper los dos enlaces
covalentes en la molécula de O2 a través de la luz ultravioleta de alta energía o a
descargas eléctricas; al ozono (O3), que se genera con la unión del antes mencionado O
al O2; al oxígeno singulete (1O2), que se produce con la excitación de uno de los
electrones desapareados del O2; al anión superóxido (O2-), formado cuando un O2
capta un electrón que se aparea con uno de los dos electrones libres de los orbitales
19
π*; al peróxido de hidrógeno (H2O2), formado en los organismos vivos principalmente
vía la depuración del superóxido; y al radical hidroxilo (OH). Esta última molécula es
una de las especies más reactivas que se conocen (Hansberg, 2008).
Figura 1. Generación de diferentes ERO por transferencia de energía o reducción
secuencial univalente del oxígeno triplete en estado basal. Modificado de Klaus A. et al.
(Konigsberg-Fainstein, 2008).
Aun con el conocimiento de estas especies y de su capacidad tóxica, gran parte de la
comunidad científica de mediados del siglo XX desconocía o negaba su presencia y
participación de las mismas dentro de los organismos vivos, debido a los daños que
generarían en sus estructuras moleculares sensibles, este paradigma cambió
drásticamente con dos grandes descubrimientos.
Estrés oxidativo. Bagatelas en el siglo XX.
En 1954, Rebecca Gerschman y Daniel Gilbert realizaron experimentos en ratones,
exponiéndolos a radiación de rayos X y/o a altas concentraciones de O2 (6 atm), y
propusieron una correlación con el mecanismo que genera sus efectos dañinos, la
formación de radicales libres oxidantes, en el caso del oxígeno, derivados del
metabolismo oxidativo. Además demostraron que la administración de agentes, que
ya se conocía reducían los efectos negativos de la radiación, también disminuyeron los
efectos negativos de la exposición al oxígeno, estos ahora conocidos como
antioxidantes (Gershman et al., 1954).
20
Sin embargo esta hipótesis fue dejada de lado por veinte años debido a diversos
factores, quizá el principal era la oposición a la concepción teórica de que el
metabolismo oxidativo, presente en toda la vida compleja y en el ser humano, fuera en
cierta medida tóxico. Fue hasta los años 1970’s que el trabajo de Gerschman cobró
validez generalizada, cuando Joe McCord e Irwin Fridovich demostraron la actividad
de la enzima SOD, la cual cataliza la dismutación del radical anión superóxido (O2- +
O2- + 2H+ O2 + H2O2), con esto se demostró la presencia de radicales libres
oxidantes en los organismos vivos. Al mismo tiempo realizaron ensayos en distintos
tejidos, demostrando que la SOD se encuentra ampliamente distribuida en los
organismos mamíferos (McCord & Fridovich, 1969); posteriormente se descubriría
que están presentes en todos los dominios de la vida (Brioukhanov et al., 2000; Kroll
et al., 1995). McCord y Fridovich puntualizan en su investigación que la abundancia y
distribución de la SOD sugiere que puede jugar un papel importante, incluso vital, en
la protección del organismo ante los efectos dañinos del radical superóxido (McCord &
Fridovich, 1969).
Estos dos descubrimientos fueron la chispa que daría inicio a una prolífica área de
estudio, la del estrés oxidativo, cuya definición fue establecida por vez primera en los
1980’s por Helmut Sies: “un desbalance entre los oxidantes y antioxidantes en favor
de los oxidantes, llevando a una disrupción de la señalización y control reductor-
oxidante y/o al daño molecular” (Stahl & Sies, 2012; Lane, 2012).
Formación de las ERO
Las ERO han formado parte de las dinámicas celulares, prácticamente desde los
inicios de la vida misma, su importancia se encontraría a discusión y no es el
propósito de este trabajo. Sin embargo, no cabe duda al menciona{r que la presencia
del oxígeno en la atmósfera liberó un gran potencial energético, que le ha permitido a
la vida evolucionar en formas cada vez más complejas; algunos de los mecanismos
21
más relevantes para la evolución de la vida eucariota como la diferenciación celular y
la apoptosis están directamente relacionados con las ERO (Valko et al., 2007).
Algunas ERO pueden ser generadas a partir de la excitación de los átomos de oxígeno
por radiaciones ionizantes, tales como las de los rayos UV que provienen del sol, u
otros mecanismos que ocurren abióticamente; cuando estas especies son asimiladas,
son de fuente externa a la célula. Sin embargo existen muchas otras vías por las cuales
son generadas por la célula misma, tales como las reacciones enzimáticas,
espontáneas, de fotosensibilización, flujos y escape de electrones, entre otras. Debido
a la gran diversidad de mecanismos por las que las ERO son generadas y la
imposibilidad de describirlas a detalle, se presenta la tabla 2 como resumen práctico
(Hansberg, 2008).
Especie
Fuente
Concentración
intracelular
Reactividad
Eliminación
O2
Dioxígeno
Externa, catalasa
10 a 20 µM
Hemo, Fe(II), flavinas,
pterinas alcoxilos,
NO
Respiración,
oxidasas
O3
Ozono
Externa
≈ 0
Ácidos nucleicos,
proteínas, lípidos,
sacáridos y demás
compuestos celulares
Ascorbato
1O2
Oxígeno
singulete
Fotosensibilización,
descomposición H2O2
(HOBr), dismutación
espontánea del O2-,
peroxilípidos, NO2 + ONOO-
ρM, vida ½ < 1 µseg
Ácidos nucleicos,
proteínas, lípidos,
sacáridos y demás
compuestos celulares
Carotenos,
tocoferoles,
glutatión, ascorbato.
O2-
Radical anión
superóxido
Externa e interna: cadena
respiratoria, NADPH
oxidasas, xantina oxidasas,
lipoxigenasa, P450,
hemoglobina, peroxidasas
ρM - µM
O2-, NO, Fe(III), [4Fe-
4S], quinonas,
difenoles
SOD, dismutación
espontánea
H2O2
Peróxido de
hidrógeno
Externa e interna:
dismutación del O2-,
oxidasas
nM - µM
Ascorbato, hemo, Fe-S
Catalasa,
peroxidasas,
peroxirredoxinas
OH
Radical
hidroxilo
Reacción de Fenton
≈ 0
Cualquier compuesto
vecino
Glutatión, ascorbato,
solutos compatibles
Tabla 2. Fuente, concentración intracelular, reactividad y eliminación del dioxígeno y
de las principales ERO. Tabla tomada del capítulo 2 del libro “Radicales libres y estrés
oxidativo. Aplicaciones médicas” [Hansberg, 2008].
22
Blancos celulares de las ERO y patologías asociadas.
Las proteínas, al ser después del agua el componente más abundante de cualquier
sistema biológico, ya sean células o tejidos -incluso en las membranas plasmáticas de
muchas células 50 a 60 % del peso seco corresponde a proteínas (Zentella & Piña,
2008)-, son de las moléculas más comprometidas con el daño oxidativo.
El daño oxidativo a proteínas puede afectar tanto a las cadenas laterales de los
aminoácidos que la integran, como a la cadena proteínica dada por los enlaces
peptídicos, la columna vertebral de la proteína. La reacción de ERO menos reactivas
con residuos azufrados específicos de aminoácidos (-SH y -S-CH3) en las proteínas,
produce oxidación del residuo, que se acompaña de un cambio en la estructura,
función y actividad de la proteína, dicha oxidación es reversible; cuando las proteínas
son dañadas por oxidación no reversible estas son degradadas intracelularmente por
proteasas, sin embargo en algunas ocasiones se acumulan irremediablemente en
células y tejidos. Tanto el daño oxidativo a proteínas como la acumulación excesiva de
las proteínas oxidadas están asociadas a numerosas enfermedades humanas como
Alzheimer, síndrome de inmunodeficiencia respiratoria, distrofia muscular, cataratas,
artritis reumatoide, progeria, diabetes, aterosclerosis, envejecimiento, entre otras
(Zentella & Piña, 2008).
Para el DNA la mayoría de las ERO son relativamente poco reactivas, pero el radical
OH, generado por la reacción de Fenton o por radiólisis del agua inducida por rayos X
o γ, es muy reactivo, no sólo abstrayendo átomos de hidrógeno sino también
adhiriéndose a las bases formando aductos, lo cual produce una gran diversidad de
daños. Debido a que el DNA es una molécula de información genética única en cada
célula su importancia es singular. Las ERO producen diferentes tipos de daño al DNA,
como daño a las bases, azúcares, entrecruzamientos de proteínas con DNA, así como
rupturas de cadena doble o sencilla y formación de sitios abasídicos. Este tipo de
lesiones se han relacionado con procesos cancerígenos, de envejecimiento,
enfermedades neurodegenerativas y muerte celular (Medeiros, 2008).
23
Los lípidos también son blancos celulares importantes del daño causado por ERO,
daño conocido como lipoperoxidación no enzimática. Cuando la lipoperoxidación es
inducida por ROS resulta en lípidos con radicales libres formados en sus carbonos,
estos radicales afectarán de la misma forma a otros lípidos, propagando así el daño
oxidativo de forma autocatalítica, sin una defensa en contra de estos radicales. La
peroxidación generalmente termina cuando un radical lipídico reacciona con otro,
formando un agregado o un dímero que queda dentro de la membrana y altera sus
funciones, principalmente la fluidez y permeabilidad. Este daño a las membranas
celulares altera el funcionamiento de proteínas, receptores e iones integrados en las
mismas y la concentración de iones al interior de la célula, por lo que sus efectos a
nivel tejido pueden ser diversos. Los daños generados a lípidos están relacionados con
enfermedades como la ateroesclerosis y el daño tisular provocado por infarto de
miocardio, pero potencialmente está relacionado con una gran cantidad de patologías
(Zenteno-Savin, 2008).
Funciones fisiológicas relacionadas a ERO
Hasta aquí las ERO parecen ser los jinetes del apocalipsis de la fisiología celular, pero
cabe recordar que no son solamente agentes dañinos para las células; como antes se
mencionó, el estrés oxidativo ocurre sólo cuando hay un desequilibrio entre las ERO y
los mecanismos de defensa que las contrarrestan. Cada vez existen mayores
evidencias de que algunas enzimas específicas, como las NADPH oxidasas (NOX),
producen ERO para regular diferentes funciones celulares, incluyendo inmunidad,
diferenciación celular, proliferación celular, adhesión celular, transducción de señales,
transporte de iones y apoptosis (Foreman et al., 2003; Finkel, 2003; Aguirre et al.,
2005; Dröge, 2002).
Los peroxisomas son organelos que en su interior poseen la maquinaria enzimática
para producir H2O2, pero no O2-. Bajo condiciones fisiológicas (Valko et al., 2004) los
peroxisomas tienen un gran consumo de oxígeno en la célula y participan en varias
funciones metabólicas que producen H2O2. El peróxido producido es usado para
24
oxidar una variedad de moléculas, el organelo también contiene catalasa, una enzima
que descompone al peróxido de hidrógeno y presumiblemente previene la
acumulación de este compuesto tóxico. Así, el peroxisoma mantiene un balance
delicado con respecto a las concentraciones o actividades relativas de estas enzimas
para asegurar que no exista una producción neta de ERO. Los mecanismos de
mantenimiento de este equilibrio aún no son totalmente claros, pero si los
peroxisomas fueran dañados y sus enzimas consumidoras de H2O2 reguladas
negativamente, el H2O2 se liberaría al citosol, lo cual generaría un gran estrés
oxidativo en la célula (Valko et al., 2007).
Estudios recientes han demostrado que la unión a receptor de numerosos factores de
crecimiento peptídicos estimulan la generación de ERO y que este estallido oxidativo
es requerido para ciertos aspectos de la señalización río abajo (Dröge, 2002); una de
las modificaciones involucradas en esta señalización es la que se lleva a cabo en
residuos específicos de cisteína, a través de esta modificación enzimas como la
Cdc25C, que es una enzima regulatoria del ciclo celular, sufren una inactivación, que
puede ser enzimática o espontáneamente reversible a su forma activa; algunas
evidencias sugieren que por lo menos para algunas proteínas, la restauración de la
actividad requiere de un intermediario proteína-glutatión (Finkel, 2003). En el
dominio eucariota se ha propuesto que las ERO están directamente relacionadas con
la regulación de la diferenciación celular (Aguirre et al., 2005), característica de los
organismos complejos.
Hace casi 45 años el papel de las ERO en los sistemas biológicos fue apenas dilucidado
y aceptado por la comunidad científica, pasando primeramente por descripciones
meramente dañinas hasta la concepción en la actualidad, de sus beneficios,
demostrando ser parte de un fenómeno complejo al interior de los sistemas biológicos
celulares y que necesitan estar libres de concepciones maniqueas. Su descripción y
mayor comprensión necesitarán justamente un enfoque que no las catalogue como
malas ni buenas, sino que meramente las comprenda como parte de las moléculas
biológicas que conforman a la vida y sus funciones.
25
Antioxidantes
Como se ha descrito anteriormente, la participación de las ERO en las células no es
fortuita, ni sólo dañina; es amplia y con papeles distintos bajo diferentes cantidades,
tiempos y lugares. El estrés oxidativo que pueden generar las ERO presentes en las
células, es prevenido y/o regulado por distintos mecanismos, los más estudiados en la
actualidad son aquellos relacionados con la producción de moléculas llamadas
comúnmente antioxidantes.
Se conoce como antioxidantes a las moléculas que median la depuración de las ERO en
las células, estos pueden ser de diversa naturaleza, pero en general se les divide en
enzimáticos y no enzimáticos.
A grandes rasgos, el mecanismo de acción de los antioxidantes no enzimáticos es
reaccionar con las ERO, neutralizándolas, amortiguando así el daño que se generaría
en la función o estructura de otras moléculas; posteriormente los antioxidantes no
enzimáticos en su forma oxidada pueden ser reciclados, siendo reducidos por
diferentes enzimas específicas usando NADPH como poder reductor (Apel & Hirt,
2004).
Entre los principales antioxidantes no enzimáticos se encuentran: ascorbato, glutatión
(GSH), tocoferoles, flavonoides, alcaloides, y carotenoides (Apel & Hirt, 2004). No
todos los grupos filogenéticos producen todos estos antioxidantes, en el caso
particular de los animales, como el humano, una cantidad importante de antioxidantes
son adquiridos de la dieta, o producidos por la microbiota comensal del tracto
digestivo.
Los antioxidantes enzimáticos por otro lado, son parte del repertorio enzimático
celular, son la defensa antioxidante que tiene cada organismo codificada en su propio
genoma. El papel de estos antioxidantes es catalizar reacciones que conviertan a las
ERO en moléculas menos reactivas o completamente inocuas. Tal es el caso de la
26
superóxido dismutasa, que está encargada de catalizar la transformación del radical
anión superóxido (O2-), en una especie menos reactiva, peróxido de hidrógeno
(H2O2); posteriormente esta especie será transformada en agua por otras enzimas
antioxidantes como las catalasas (Gómez-Quiroz & Cuevas-Bahena, 2008).
Los principales antioxidantes enzimáticos son: superóxido dismutasa (SOD), glutatión
peroxidasas, tiorredoxinas, hemo-oxigenasas y catalasas. Aunque la mayoría de estas
enzimas están presentes en todos los dominios de la vida, no todos los organismos las
poseen; sin embargo debido a la versatilidad del genoma y a la fuerza motora de la
evolución, los sistemas antioxidantes codificados por los propios organismos
demuestran gran plasticidad y suelen tener redes de regulación que compensan la
carencia de uno u otro antioxidante, por ejemplo, incrementando la producción de un
antioxidante por otro, que tenga una producción deficiente, nula o presente
mutaciones deletéreas, o bien por redundancia de protección antioxidante (Willekens,
1997).
Los antioxidantes mantienen un “estado de equilibrio” en las concentraciones de ERO
en las células, determinado por el balance entre las tasas de producción de las ERO y
las tasas de su remoción por los diversos antioxidantes (Valko et al., 2007). De esta
forma, cada célula está caracterizada por una concentración particular de electrones
almacenados en diferentes constituyentes celulares, conocidos como parejas redox -
como es el caso de la pareja GSSG/2GSH-; la relación de sus formas reversibles
oxidadas y reducidas es lo que se ha definido originalmente como “estado redox”, pero
más recientemente se ha usado este término no sólo para describir el estado de una
pareja redox en particular, sino también para describir el “ambiente redox”. Schafer y
Buettner proponen que una correcta definición de este término sería: “la suma de los
productos del potencial de reducción y la capacidad reductiva de un conjunto de
parejas redox relacionadas en un fluido biológico, organelo, célula o tejido” (Schafer &
Buettner, 2001).
27
El mantenimiento del ambiente redox de una célula es similar al mantenimiento de su
pH, en el sentido de que bajo condiciones normales se mantiene en un rango reducido;
sin embargo, el cambio del ambiente redox en algunos organelos o en la célula en
general es necesario para una forma de señalización recientemente descrita, la
señalización redox (Valko et al., 2007).
Juntos antioxidantes y ERO, forman parte de una intrincada red de regulación, cuya
comprensión apenas ha sido arañada, y los resultados se podrán ver reflejados en el
mejoramiento de terapias y medicamentos para enfermedades relacionadas con ERO,
procesos biotecnológicos asociados con estrés oxidativo y el entendimiento de la
señalización redox y sus implicaciones biológicas.
H2O2 una ERO con dos caras.
El peróxido de hidrógeno, comúnmente conocido como agua oxigenada, se forma
cuando cada uno de los dos electrones libres del O2 se han apareado con un electrón
de giro contrario. Es un líquido similar al agua aunque más denso y más viscoso. Es un
ácido débil y como base es 106 veces más débil que el agua. Tiene un momento dipolar
y una constante dieléctrica mayor que el agua, por lo que forma más puentes de
hidrógeno y es un mejor disolvente de solutos polares que el agua; sin embargo, en
concentraciones mayores a 70% es explosivo, por lo que generalmente se usa diluido
en agua al 30% o menos (Hansberg, 2008).
La reacción de la enzima SOD transforma al radical anión O2-, una de las ERO más
reactivas, en una especie con menor toxicidad oxidativa, el H2O2, de esta forma se
produce la mayor parte del peróxido intracelular, contribuida también en menor
proporción por la actividad de algunas oxidasas. El H2O2 no interacciona con los
compuestos como el NADPH, los ácidos nucleicos, los aminoácidos de proteínas -salvo
algunos tioles particularmente reactivos-, ni con los lípidos, incluso en
concentraciones milimolares, por lo que es considerada una de las ERO menos
reactivas y más estables. Sin embargo la toxicidad del H2O2 es en mayor parte debida a
28
que esta especie puede difundir a través de los compartimentos celulares y
membranas, formando aductos (uniones directas entre moléculas sin cambios
estructurales) con algunos carbohidratos, aminoácidos y bases nitrogenadas, y en
estos sitios generar a otras especies más reactivas como el 1O2 y el OH, a través de la
reacción con algunos metales de transición como el hierro (reacción de Fenton). En
este caso forma , el cual interacciona en el sitio donde se forma; así una molécula
de peróxido de hidrógeno antes casi inocua, es transformada en un radical hidroxilo y
ocasiona modificaciones irreversibles en las proteínas y alteraciones en el DNA, las
cuales no siempre pueden ser reparadas (Hansberg, 2008). Esta es una de las razones
por las que la vida desarrolló mecanismos de defensa contra las ERO.
En contraste, el peróxido de hidrógeno puede actuar como segundo mensajero en la
transducción de señales, principalmente para la activación de los sistemas
antioxidantes, de las células inmunológicas, inflamación, proliferación celular y
apoptosis (Zamocky, 2008).
Catalasas
En respuesta a la toxicidad indirecta del H2O2, los organismos han tenido que generar
mecanismos que controlen el estrés oxidativo provocado por esta especie. Uno de los
mecanismos más estudiados para contender con esta ERO son los antioxidantes
enzimáticos conocidos ampliamente como catalasas, aunque más correctamente
llamadas hidroperoxidasas (Chelikani et al., 2004).
La reacción completa catalizada por las catalasas es la degradación de dos moléculas
de peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno (fórmula 1), usando a una molécula de
H2O2 como oxidante y una segunda como reductor, volviendo así la enzima a su estado
de reposo.
Fórmula 1:
29
Se han caracterizado tres distintas clases de proteínas sin relación en estructura ni
secuencia que presentan alta actividad de catalasa. La clase más distribuida en la
naturaleza y más estudiada, está compuesta por enzimas monofuncionales con grupo
hemo, subdivididas por tener subunidades pequeñas (<60 kDa) o grandes (>75kDa).
El segundo grupo está compuesto por enzimas bifuncionales con actividad de
catalasa-peroxidasa, también con grupo hemo. Y la tercera clase incluye a las catalasas
sin grupo hemo, también conocidas como catalasas de manganeso (Chelikani et al.,
2004).
Las catalasas están presentes en los tres dominios de la vida, también se han
encontrado en organismos anaerobios facultativos y estrictos (Peraza-Reyes, 2008),
sugiriendo que estos organismos también están expuestos al oxígeno y sus especies
reactivas y la importancia de los mecanismos para controlarlas para sobrevivir.
Las catalasas monofuncionales son las más abundantes y se encuentran presentes a lo
largo y ancho del árbol de la vida, dividiéndose en tres clados: el clado 1 contiene
catalasas de eubacterias, algas y plantas, siendo estas de subunidad pequeña (55-69
kDa); el clado 2 de bacterias y hongos de subunidad grande (75-84 kDa); y el clado 3,
la más ampliamente distribuida, con catalasas de todos los dominios y reinos de la
vida, siendo de subunidad pequeña (43-75 kDa). En este último clado se encuentran
las catalasas de hígado bovino, eritrocito humano y de S. cerevisiae, con gran
importancia médica y científica (Zamocky, 2008).
La falta de catalasa o su deficiencia en humanos, está ligada a: agregación y
malfuncionamiento de eritrocitos, inflamación pulmonar, generación de ERO por
células cancerígenas, defectos en proliferación celular y acatalasemia. La acatalasemia
es una enfermedad hereditaria, en la que la actividad de catalasa es menor al 10% del
nivel normal, lo que generalmente conduce a síntomas como: gangrena oral;
ulceración; alteraciones en metabolismos de lípidos, sacáridos y homocisteína; y un
mayor riesgo de desarrollar diabetes mellitus (Zamocky, 2008).
30
Catalasas en S. cerevisiae y D. hansenii
S. cerevisiae posee dos catalasas: ScCTT1 -comúnmente llamada catalasa T- localizada
en el citoplasma; y ScCTA1 –o catalasa A-, cuya localización es en peroxisoma.
Los estudios de las catalasas de S. cerevisiae han propuesto que estas enzimas no
tienen un papel significativo en la detoxificación del H2O2 bajo condiciones
fisiológicas, sin embargo han remarcado que estas enzimas sí son relevantes para
condiciones de estrés, como lo es la fase estacionaria y también para optimizar una
respuesta adaptativa al estrés por peróxido (Izawa et al., 1996); a su vez también se
ha descrito que el sistema de detoxificación del H2O2 por medio de la catalasa es
redundante con el de glutatión, esto es: la presencia de uno compensa la ausencia del
otro, pero si ambos sistemas tienen deficiencias, el estrés oxidativo se verá
exacerbado (Grant et al., 1998). Por lo que la relevancia de su estudio radica
principalmente en entender los mecanismos del estrés oxidativo en S. cerevisiae,
cuyos resultados con el debido cuidado pueden ser extrapolados a otros organismos.
En D. hansenii se encuentran homólogos de ambas catalasas de S. cerevisiae, DhCTA
para la catalasa A y DhCTT para la catalasa T. Sus secuencias de nucleótidos y
aminoácidos se encuentran publicadas en la página del Consorcio Génolevures
http://genolevures.org/. El estudio de estas enzimas es realizado actualmente en el
Laboratorio de Biología Molecular y Genómica de la Facultad de Ciencias, UNAM.
31
III. Antecedentes
El presente estudio encuentra sus antecedentes principalmente en el trabajo de
investigación realizado por el equipo del Laboratorio de Biología Molecular y
Genómica, Facultad de Ciencias, UNAM. De este destacan el artículo publicado “The
Euryhaline Yeast Debaryomyces hansenii has two catalase genes encoding enzymes
with differential activity profile” por Segal-Kischinevzky et al. (Segal-Kischinevzky et
al., 2011); la tesis para grado de licenciatura “Complementación heteróloga de una
mutante acatalasémica de Saccharomyces cerevisiae con el gen de la catalasa A de
Debaryomyces hansenii” de Diego Noriega-Samaniego (Noriega-Samaniego, 2012) y la
tesis para grado de licenciatura “Expresión del gen DhCTT1 de Debaryomyces hansenii
en una mutante acatalasémica de Saccharomyces cerevisiae” de Román Alfonso
Castillo-Díaz (Castillo-Díaz, 2013).
En estos trabajos se obtuvieron resultados relevantes para el estudio de las catalasas
tanto de D. hansenii como de S. cerevisiae.
Segal-Kischinevzky y colaboradores observaron que D. hansenii presenta una
actividad específica de catalasa alta, mayor que la de S. cerevisiae, cuando ambas
levaduras son crecidas en las mismas condiciones y que esta actividad aumenta aún
más cuando D. hansenii es cultivada en etanol como única fuente de carbono en fase
estacionaria; sin embargo cuando se agrega NaCl al medio de cultivo, la actividad
específica de catalasa disminuye, lo que sugiriere una disminución en el estrés
oxidativo bajo esta condición, argumento que se suma a los ya varios reportes sobre
un papel protector que tendría el NaCl contra distintos tipos de estrés en D. hansenii
(Segal-Kischinevzky et al., 2011; Prista & Almagro, 1997).
A su vez, probaron mediante Northern blot que la mayor actividad de catalasa
corresponde a un mayor nivel de RNA mensajero del gen que codifica para la catalasa
A en D. hansenii; sin embargo la baja en actividad en presencia de NaCl no la
32
relacionan con una reducción de los niveles de expresión de mRNA cuando la fuente
de carbono es etanol pero sí cuando ésta es glucosa. Por otra parte sus resultados
mostraron que la proteína DhCTT sólo es evidente en cultivos crecidos en medio rico
con glucosa (YPD) en fase estacionaria, mientras que demostraron la presencia de su
mRNA tanto en cultivos de fase exponencial como estacionaria: también demostraron
que la expresión de DhCTT es reprimida cuando está en presencia ya sea de etanol,
NaCl o ambos. Por lo que concluyen que tanto DhCTA como DhCTT, poseen
mecanismos post-transcripcionales que juegan un papel importante en su regulación,
y que el incremento de actividad de catalasa en presencia de NaCl en S. cerevisiae no
se observa en D. hansenii, por el contrario esta se ve disminuida (Segal-Kischinevzky
et al., 2011).
Noriega-Samaniego y Castillo-Díaz determinaron que los genes de catalasa de D.
hansenii DhCTA y DhCTT complementaron exitosamente cepas de S. cerevisiae antes
acatalasémicas, generando dos cepas de S. cerevisiae con actividad de catalasa
correspondiente a las proteínas de D. hansenii: Sc acat::DhCTA, una cepa doble
mutante de S. cerevisiae antes acatalasémica conteniendo el gen de catalasa A de D.
hansenii (Noriega-Samaniego, 2012); y Sc acat::DhCTT, conteniendo el gen de catalasa
T de D. hansenii (Castillo-Díaz, 2013).
Ambos genes lograron ser expresados bajo el control de su promotor nativo (D.
hansenii) utilizando la maquinaria transcripcional de S. cerevisiae y la actividad de
catalasa fue restituida en las dobles mutantes de S. cerevisiae.
Sus resultados también demostraron que la cepa Sc acat::DhCTA se caracterizó por
crecer de forma más rápida en medio rico con etanol como fuente de carbono,
mientras que la cepa Sc acat::DhCTT presentó mayor actividad específica de catalasa y
mayor biomasa que las cepa silvestre de S. cerevisiae (Sc Wt) y sus mutantes simples:
Sc ΔCTA, sin catalasa A; y Sc ΔCTT, sin catalasa T.
33
IV. Justificación
Los procesos de estrés oxidativo son generales para todas las formas de vida, el
estudio de los mecanismos que los controlan es de relevancia académica,
biotecnológica, económica y social, pues el estudio de los mismos ha permitido el
avance de muchos campos de interés común como lo son la medicina, la industria
alimentaria, la ciencia y la tecnología, entre otras.
El estudio aquí presentado plantea analizar la expresión heteróloga de las catalasas A
y T de D. hansenii en una mutante acatalasémica de S. cerevisiae con el fin de apreciar
las diferencias fisiológicas y bioquímicas relevantes de dicha expresión en
comparación con su completa ausencia y la expresión nativa de las catalasas de S.
cerevisiae y de D. hansenii.
34
V. Objetivos
Objetivo general
Realizar un análisis fisiológico y bioquímico comparativo de las cepas transformadas
Sc acat::DhCTA y Sc acat::DhCTT con un enfoque en el estrés oxidativo.
Objetivos particulares
Obtener información fisiológica y bioquímica de la expresión heteróloga de los genes
que codifican para las catalasas A y T de D. hansenii en una mutante acatalasémica de
S. cerevisiae, relevante a los procesos que median estas enzimas.
Cuantificar y comparar la actividad específica de catalasa en las distintas cepas
transformantes en comparación con S. cerevisiae, D. hansenii y una mutante
acatalasémica de S. cerevisiae, esto a su vez en diferentes condiciones de cultivo.
Determinar cualitativamente la resistencia a estrés oxidativo de las cepas
transformantes Sc acat::DhCTA y Sc acat::DhCTT, en comparación con la cepa silvestre
de S. cerevisiae.
Evidenciar posibles mecanismos de defensa celular simultánea a estrés osmótico y
oxidativo.
35
VI. Materiales y métodos
Cepas y medios de cultivo
Para el análisis fisiológico de las cepas Sc acat::DhCTA y Sc acat::DhCTT se usaron
como referencia las levaduras S. cerevisiae en su forma silvestre (Sc Wt), D. hansenii
también en su forma silvestre (Dh Wt) y una cepa de S. cerevisiae completamente
acatalasémica (Sc acat), previamente obtenida de la cruza de dos levaduras con
deleciones en los genes que codifican para catalasas, una en el gen ScCTA1 (YDR256C)
y la otra en el gen ScCTT1 (YGR088W), las cepas utilizadas para la realización de los
experimentos se encuentran enlistadas en la tabla 3.
Cepa
Nomenclatura
usada
Origen
Genotipo
S. cerevisiae
S288c
Sc Wt
Cepa de referencia
MATα SUC2 gal2 mal
mel flo1 flo8-1 hap1 ho
bio1 bio6
S. cerevisiae
Y13615
Δcta1
Euroscarf: European
Saccharomyces
cerevisiae Archive for
Functional Analysis
BY4742 MATα his3Δ1
leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0
YDR256c::KanMX4
S. cerevisiae
Y04718
Δctt1
Euroscarf: European
Saccharomyces
cerevisiae Archive for
Functional Analysis
BY4741 MATa his3Δ1
leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0
YGR088w::KanMX4
S. cerevisiae
Y04718xY13615
Sc acat
Laboratorio de
Biología Molecular y
Genómica, Facultad de
Ciencias, UNAM
BY4742xBY4741 MAT ?
his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0
ura3Δ0
YDR256c::KanMX4
YGR088w::KanMX4
S. cerevisiae
Y04718xY13615
pRS316::DhCTA
Sc acat::DhCTA
Laboratorio de
Biología Molecular y
Genómica, Facultad de
Ciencias, UNAM
BY4742xBY4741 MAT ?
his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0
YDR256c::KanMX4
YGR088w::KanMX4
S. cerevisiae
Y04718xY13615
pRS316::DhCTT
Sc acat::DhCTT
Laboratorio de
Biología Molecular y
Genómica, Facultad de
Ciencias, UNAM
BY4742xBY4741 MAT ?
his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0
YDR256c::KanMX4
YGR088w::KanMX4
D. hansenii Y7426
Dh Wt
Cepa de referencia
Genotipo silvestre
desconocido
Tabla 3. Listado de cepas por: nombre, nomenclatura usada, origen y genotipo.
36
Los medios usados en los experimentos fueron medios ricos, conteniendo todos
extracto de levadura (Becton Dickinson Microbiology Systems) y peptona de caseína
(Becton Dickinson Microbiology Systems), pero difiriendo en su fuente de carbono -
glucosa o etanol- y en la adición de NaCl, su composición se presenta en la tabla 4.
Proveedor
YPD
YPD+NaCl
0.6M
YPE
YPE+ NaCl
0.6M
Extracto de
levadura
Becton
Dickinson
Microbiology
Systems
10 g
10 g
10 g
10 g
Peptona de
caseína
Becton
Dickinson
Microbiology
Systems
20 g
20 g
20 g
20 g
Dextrosa
Sigma
20 g
20 g
-
-
Etanol*
Sigma
-
-
20 mL
20 mL
NaCl
Amresco
-
35.7 g
-
35.7 g
* El etanol se esterilizó por luz UV y filtración y se añadió a los medios ya esterilizados
en autoclave.
Tabla 4. Composición de ingredientes por litro en los distintos medios usados en los
experimentos del presente estudio.
Para el mantenimiento de las cepas transformantes se usó un medio mínimo YNB
(Amresco) adicionado con aminoácidos (Sigma) sólo para sus auxotrofías
correspondientes, su composición se encuentra en la tabla 5.
Tabla 5. Composición medio mínimo selectivo por litro.
Medio mínimo selectivo por litro
YNB
6.7 g
Glucosa
10 g
Agar
10 g
Histidina (49 mM)
2 mL
Metionina (67mM)
2 mL
Leucina (76.2 mM)
3 mL
Lisina ( 54.7 mM)
3 mL
Sulfato de amonio
5 g
37
Mantenimiento de las cepas y condiciones de cultivo
Las cepas fueron mantenidas en cajas Petri por separado, conteniendo medio
adicionado con agar purificado para microbiología (Merck) al 2% en refrigeración a 4
°C, las cepas fueron resembradas cada 30 días; las cepas de Sc Wt y Sc acat fueron
mantenidas en YPD-agar, las cepas transformantes Sc acat::DhCTA y Sc acat::DhCTT en
medio selectivo YNB-agar, mientras que D. hansenii fue mantenida en YPD-agar + NaCl
0.6 M.
La temperatura de crecimiento que se mantuvo en la incubadora para todos los
experimentos fue 28 °C, en el caso de medios líquidos se aplicó agitación a 180 rpm.
Para todos los experimentos se realizaron precultivos con incubación por 48 y hasta
72 horas.
Curvas de crecimiento
Cada cepa fue cultivada en 100 mL de medio rico, con glucosa o etanol como fuente de
carbono, y con presencia o ausencia de NaCl a una concentración de 0.6 M. Las
levaduras se inocularon a una densidad óptica de 0.05 A600nm y se crecieron durante
72 horas a 28 °C con agitación constante a 180 rpm.
Durante el crecimiento se tomaron muestras en los intervalos de tiempo: 0, 3, 6, 9, 12,
24, 30, 36, 48, 54, 60 y 72 horas; se diluyó la muestra en agua bidestilada cuando la
densidad óptica sobrepasaba 0.5 A600nm, buscando precisión en la medición. Los
resultados obtenidos se muestran en las gráficas de la figura 3.
Protocolo: Curvas de crecimiento
1. Inocular medios de cultivo líquido YPD (50 mL) o YPD-NaCl en el caso de D.
hansenii, con levadura crecida en medio sólido, en condiciones asépticas.
2. Incubar los cultivos a 28 °C, 180 rpm, durante dos días.
38
3. Centrifugar los cultivos en tubos cónicos de polipropileno de 50 mL a 3,000
rpm durante 10 min.
4. Lavar las levaduras con H2O ddi (destilada, desionizada, esterilizada)
5. Volver a centrifugar a 3,000 rpm durante 10 min
6. Resuspender en H2O ddi en un volumen pequeño, aprox. 2 mL.
7. Realizar una dilución en cámara de espectrofotómetro 1:1000. Colocando
2,970 μl de H2O ddi + 30 μl del concentrado de levadura.
8. Medir en espectrofotómetro a 600 nm. Tomar como blanco H2O ddi
9. Realizar los cálculos necesarios para obtener una absorbancia final en los
medios en los que se realizará la curva de crecimiento de 0.05 A600nm.
10. Inocular con la cantidad calculada los medios, agitar vigorosamente.
11. Tomar una muestra de 3 mL y medir en espectrofotómetro la absorbancia (A) a
600 nm. Tomar como blanco medio YPD estéril.
12. Colocar en incubadora a 28 °C, 180 rpm.
13. Tomar mediciones subsecuentes de la absorbancia a 600 nm de los medios en
los siguientes intervalos de tiempo: 3, 6, 9, 12, 24, 30, 36, 48, 54, 60 y 72 horas.
Nota: El rango de linearidad del instrumento considera una A600nm de 0.05 a 0.5,
por lo que las muestran fueron diluidas para entrar en ese rango, cuando fue
necesario.
Calcular tiempo de duplicación
El tiempo de duplicación se calculó usando la herramienta en línea Doubling-time
calculator (Roth, 2006), cuya URL es http://www.doubling-time.com/compute.php .
Procedimiento:
1. Tabular los datos de la fase de crecimiento exponencial por hora y absorbancia
en Excel.
2. Copiar los valores en el cuadro bajo el título Several Time Points.
3. Seleccionar si el valor que conforma la primera columna es el tiempo o la
cantidad.
4. Dar click en submit.
39
5. Los datos serán analizados y el programa dará como resultado el tiempo de
duplicación (Doubling Time) y la tasa de crecimiento (Growth Rate).
Figura 2. Ejemplo de resultados en pantalla del programa “Doubling-time calculator”.
Resaltado en negritas está el tiempo de duplicación, dado en la unidad de tiempo
usada en los datos ingresados.
Protocolo: Obtención del extracto crudo
1. Colectar las células de la fase estacionaria (72 horas de crecimiento) en tubos
cónicos de polipropileno de 50 mL y centrifugar 10 min a 3,000 rpm, repetir de ser
necesario hasta colectar todas las células.
2. Agregar aprox. 25 mL de H2O ddi, agitar en vórtex hasta que se resuspenda por
completo la pastilla.
3. Centrifugar nuevamente por 10 min a 3,000 rpm.
4. Poner 1 tubo de ensayo en hielo por cada experimento.
5. Resuspender las células del paso 2 en 1 mL de amortiguador de extracción de
catalasa (glicerol 20%, TrisHCl 0.1 M, pH 8).
6. Pasar a tubos de ensayo previamente enfriados, las células resuspendidas en el paso
5 y añadir ½ del volumen de perlas de vidrio de 710 – 1,180 m de diámetro
esterilizadas.
7. Agitar cada tubo en vórtex vigorosamente durante 1 min y reposar en hielo por lo
menos 1 min, repetir 4 veces más con cada muestra.
40
8. Transferir a microtubos estériles con pipeta Pasteur.
9. Centrifugar durante 15-20 min a 14,000 rpm en frío.
10. Pasar el sobrenadante a microtubos limpios.
Protocolo: Cuantificación de proteína en extractos crudos por el método de Bradford
(Bradford, 1976)
Curva patrón
1. En 5 tubos de ensayo poner 20 μL de estándares de Albúmina Sérica Bovina (BSA)
partiendo de 0.1 mg/mL hasta 0.9 mg/mL y añadirlos a 1 mL de reactivo de
Bradford 1X (Bio-Rad).
2. Agitar levemente en vórtex.
3. Incubar las muestras durante 5 minutos y leer en celdas de plástico de 1 mL a 590
nm.
Muestras problema
4. En tubos de ensayo con 1 mL de reactivo de Bradford agregar 20 μL de la muestra,
en caso de estar demasiado cargada, realizar diluciones hasta que su absorbancia
esté dentro de la curva patrón.
5. Agitar levemente en vórtex e incubar 5 minutos a temperatura ambiente.
6. Leer las muestras en espectrofotómetro a 590 nm.
NOTA: las muestras se deben analizar por triplicado.
Protocolo: Ensayo de la actividad específica de catalasa (Aebi, 1984 y Segal-
Kischinevzky, 2011)
1. Preparar una solución fresca de H2O2 500 mM
2. En una celda de cuarzo añadir 2.9 mL de buffer de actividad de catalasa (fosfato de
sodio 50 mM, pH 7.0) y de 1 a 20 μL de extracto proteínico.
41
3. Agregar 100 μL de la solución de H2O2 500 mM, mezclar por inversión la celda y
rápidamente iniciar la medición de la absorbancia a 240nm.
4. Seguir el decaimiento del H2O2 durante 2 minutos, obteniendo la pendiente por
minuto, m.
5. Calcular la actividad específica usando la fórmula 2.
Fórmula 2:
En donde:
AEC = Actividad Específica de Catalasa (mmol H2O2 oxidado/min/mg de proteína)
m = Pendiente por minuto calculada a partir de mediciones (1/min)
VextP = Volúmen de extracto proteínico usado (mL)
[P] = Concentración de proteína por ml de muestra (mg/mL)
ε = Coeficiente de extinción molar (H2O2) = 0.00422
Protocolo: Ensayo de sensibilidad a choque por peróxido de hidrógeno (Segal-
Kischinevzky, 2011)
1. Hacer precultivos de las cepas en 50 mL de medio rico YPD ó YPD-NaCl en el caso de
D. hansenii e incubar por dos días
2. A partir de los precultivos, reinocular 50 mL de cultivos nuevos del medio
pertinente para el experimento, a 0.05 A600nm, incubar durante 20 a 24 horas.
3. Preparar 8 tubos de ensaye que contengan 5 mL de cultivo limpio y las
concentraciones de H2O2 correspondientes a cada tubo, descritos en la tabla 6.
Tabla 6. Concentraciones de H2O2 por
tubo en el ensayo de sensibilidad.
# Tubo
μL de H2O2 (30%)
[H2O2, mM]
1
0
0
2
1.28
2.5
3
2.55
5
4
3.82
7.5
5
5.10
10
6
7.65
15
7
10.20
20
8
15.31
30
42
4. A partir del cultivo en fase exponencial (<24h), inocular los 8 tubos ajustándolos a
0.5 abs600nm, incubarlos durante 180 minutos a 28°C 180 rpm.
5. Transferir el contenido a tubos cónicos de polipropileno de 50 mL y centrifugar a
3,000 rpm durante 10 minutos, descartar el sobrenadante y resuspender la pastilla
celular en 1 mL de agua ddi estéril.
6. A cada muestra medir la absorbancia en 600 nm y diluir en microtubos con H2O2 ddi
estéril para tener 0.05 A.
7. Realizar diluciones seriales en microtubos 1:10, 1:100 y 1:1000.
8. Plaquear gotas de cada muestra y sus diluciones en cajas Petri YPD-agar,
manteniendo un orden en las concentraciones de peróxido usado por muestra y sus
diluciones.
9. Incubar durante 3 días a 28 °C.
Análisis bioinformático de secuencias de aminoácidos
Las secuencias de aminoácidos de las catalasas de D. hansenii y S. cerevisiae fueron
obtenidas de la base de datos del consorcio Génolevures (83), cada secuencia fue alineada
con su homólogo, es decir ScCTA1 fue alineada con DhCTA y ScCTT1 con DhCTT, con el
programa Clustal Omega (84), para finalizar se obtuvo la composición de aminoácidos de
las secuencias usando el programa bioinformático en línea PEPSTATS del proyecto de
software abierto EMBOSS (85).
Con el uso de estas herramientas se obtuvieron los porcentajes de identidad entre las
secuencias y la cuantificación de aminoácidos por proteína. Para realizar los cálculos de
diferencia de aminoácidos entre secuencias se tomó como 100% a los aminoácidos en los
que difiere la proteína, sólo se consideraron como aminoácidos de carácter hidrofóbico:
cisteína (Cys), fenilalanina (Phe), isoleucina (Ile), leucina (Leu), metionina (Met), valina
(Val) y triptófano (Trp).
43
VII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Curvas de crecimiento
Con el fin de analizar el crecimiento de las cepas transformadas S. cerevisiae
acatalasémica::DhCTA y S. cerevisiae acatalasémica::DhCTT, se procedió a su cultivo
simultáneo junto con cepas de D. hansenii silvestre (Dh Wt), S. cerevisiae silvestre (Sc Wt) y
acatalasémica (acat), fungiendo estas tres últimas como referencia para realizar el análisis
(figura 3).
Figura 3 (1ra Parte). Curvas de crecimiento de las cepas en distintos medios de cultivo,
durante 72 horas. Las mediciones se realizaron en espectrofotómetro, con las 5 cepas
cultivadas simultáneamente en cada medio (A) YPD, (B) YPD + NaCl, (C) YPE y (D) YPE +
NaCl, las muestras se tomaron en los mismos intervalos de tiempo.
44
Figura 3 (2da Parte). Curvas de crecimiento de las cepas en distintos medios de cultivo,
durante 72 horas. Las mediciones se realizaron en espectrofotómetro, con las 5 cepas
cultivadas simultáneamente en cada medio (A) YPD, (B) YPD + NaCl, (C) YPE y (D) YPE +
NaCl, las muestras se tomaron en los mismos intervalos de tiempo.
Tiempo de duplicación en fase exponencial
A partir de los datos de crecimiento, se tomaron los de la fase exponencial de la curva para
analizar los tiempos de duplicación correspondientes a cada cepa. Para obtener este
resultado se usó la herramienta informática en línea “Doubling Time On-line Calculator”
(Roth, 2006), la cual calcula la regresión exponencial a partir de los datos introducidos y la
ajusta a la ecuación de crecimiento exponencial (fórmula 3), dando como resultado la tasa
de crecimiento, k.
Fórmula 3:
en donde:
Xt = Concentración celular en tiempo t
45
X0 = Concentración celular inicial
k = Tasa de crecimiento
t = Tiempo
Posteriormente, el tiempo de duplicación Td se calcula con la tasa de crecimiento k usando
la siguiente fórmula:
Fórmula 4:
en donde:
Td = Tiempo de duplicación
k = Tasa de crecimiento
Los datos obtenidos fueron graficados por cepa en la figura 4 y los datos numéricos se
muestran en la tabla 7.
Figura 4. Tiempo de duplicación por cepa en medios de cultivo con glucosa o etanol como
fuente de carbono y en presencia o ausencia de sal (NaCl 0.6M). Los datos fueron
calculados en la fase exponencial de las curvas de crecimiento de cada cepa.
46
YPD
YPD+NaCl
YPE
YPE+NaCl
S. cerevisiae Wt
1.83
2.12
5.17
7.07
Sc acat::DhCTA
1.81
2.53
5.69
6.61
Sc acat::DhCTT
1.8
2.47
2.21
4.67
Sc acat
2.01
2.19
5.25
10.00
D. hansenii Wt
2.89
2.09
5.19
4.03
Tabla 7. Tiempo de duplicación (horas) en fase exponencial de cada cepa en los medios
usados. Se consideraron sólo los puntos que reflejan la fase de crecimiento exponencial y se
descartaron los demás datos para hacer este cálculo, se usó una herramienta en línea para
realizar los cálculos matemáticos. Datos numéricos de la figura 4.
En medio rico con glucosa al 2% (YPD), las cepas Sc Wt, Sc acat::DhCTA, Sc acat::DhCTT y Sc
acat presentaron crecimientos en fase exponencial y tiempos de duplicación muy similares
entre sí, mientras que D. hansenii tuvo un tiempo de duplicación ligeramente mayor. Las
dos cepas transformantes Sc acat::DhCTA y Sc acat::DhCTT junto con D. hansenii (Dh Wt)
alcanzaron una biomasa mayor a la de S. cerevisiae silvestre (Sc Wt) y acatalasémica, que
fueron muy similares entre sí. Al agregar NaCl 0.6M a este medio (YPD+NaCl) las fases
exponenciales y tiempos de duplicación fueron equivalentes para todos los genotipos de S.
cerevisiae, mientras que D. hansenii alcanzó una mayor densidad óptica, y por lo tanto
mayor biomasa, reflejando su naturaleza halófila.
En medio rico con etanol 2% (YPE), el crecimiento de Sc acat::DhCTT fue notablemente
mayor en biomasa, mientras que el crecimiento de S. cerevisiae, Sc acat::DhCTA, Sc acat y D.
hansenii fue muy similar entre sí. De igual manera, el tiempo de duplicación de Sc
acat:DhCTT fue por lo menos dos veces menor que las demás cepas; mientras que D.
hansenii fue la que tuvo el menor crecimiento, siendo este el medio en el que menor
crecimiento presentó esta levadura. Al agregar NaCl 0.6 M a este medio (YPE+NaCl) las
cepas presentaron curvas de crecimiento muy distintas entre sí: Sc acat tuvo el mayor
tiempo de duplicación, demostrando que la función de las catalasas es importante en esta
condición, mientras que D. hansenii presentó el menor tiempo de duplicación; sin embargo
la cepa que alcanzó la mayor biomasa fue Sc acat::DhCTT con un tiempo de duplicación
47
equiparable al de D. hansenii; mientras que Sc acat::DhCTA presentó un crecimiento similar
al de S. cerevisiae silvestre (Sc Wt).
La cepa transformante Sc acat::DhCTA mostró un crecimiento similar al de la transformante
Sc acat::DhCTT en medios con glucosa como fuente de carbono; en contraste, cuando fueron
cultivadas en medios con etanol como fuente de carbono, Sc acat::DhCTT tuvo un tiempo de
duplicación menor a los de Sc acat::DhCTA, 2 horas menos en medio YPE+NaCl y casi 3.5
horas menos en medio YPE, y por lo tanto una mejor adaptación a esta fuente de carbono y
el uso de oxígeno que conlleva su respiración, lo cual puede explicarse en función de que la
catalasa DhCTT se encuentre en el citoplasma y contienda mejor con las ERO de esta forma
que si sólo se encontrara en los peroxisomas, como puede ser el caso de la catalasa DhCTA,
que esperaríamos se encontrara en estos organelos únicamente.
De forma general, cuando las cepas transformantes crecieron en medios con presencia de
NaCl, su tiempo de duplicación se incrementó de forma similar a como sucede en la cepa
silvestre de S. cerevisiae, en contraste con D. hansenii que disminuye sus tiempos de
duplicación, lo que nos indica que en este caso el gen no está contribuyendo de manera
significativa a la adaptación osmótica.
D. hansenii demostró su naturaleza halófila (González-Hernández, J. & Peña, A., 2002) al
tener un tiempo de duplicación menor en los medios con NaCl a 0.6 M, con una reducción
de aproximadamente una hora en su tiempo de duplicación, con respecto a los medios con
la misma fuente de carbono en ausencia de NaCl.
Ensayos de actividad de catalasa
La actividad de catalasa fue determinada por un método adaptado por Segal-Kischinevzky
(Segal-Kischinevzky et.al, 2011) a partir de uno de Aebi (Aebi, 1984). Consiste en medir por
métodos espectrofotométricos el decaimiento del H2O2 provocado por la catalasa presente
en el extracto proteínico, midiendo la absorbancia a 240 nm en celda de cuarzo.
48
Después de que los cultivos crecieron por 72 horas se les realizó extracción proteínica
(método descrito en materiales y métodos); en celdas de cuarzo de 3mL con 2.9 mL de
buffer de actividad, se añadieron de 1 a 20 μL del extracto proteínico, finalmente la
reacción fue iniciada agregando 100 μL de H2O2 500mM a la celda (concentración final
H2O2 = 16.6 mM), rápidamente se agitó 3 veces por inversión y se colocó la celda en el
espectrofotómetro, la actividad de la catalasa fue seguida durante 2 min.
Los resultados de los ensayos arrojan una pendiente dada en minutos (m/min) la cual
describe el decaimiento del H2O2 en el tiempo, que es proporcional a la velocidad inicial de
reacción de la catalasa, condición en la que se encuentra un gran exceso de sustrato y la
cinética enzimática de la reacción es llevada a cabo en equilibrio dinámico (Schnell &
Chappell, 2006). Las actividades de catalasa fueron normalizadas a la cantidad total de
proteína cuantificada por muestra (procedimiento en materiales y métodos) y expresadas
en milimoles de H2O2 oxidado por miligramo de proteína (mmol H2O2 oxidado/min/mg de
proteína). Las actividades fueron determinadas por triplicado promediando los resultados
y obteniendo su desviación estándar, datos que se encuentran graficados en la figura 5 y en
la tabla 8 de forma escrita.
Tabla 8. Actividad específica de catalasa por cepa en diferentes medios de cultivo. Se
muestran los promedios con su desviación estándar (SD) y el número de muestras (N).
Datos numéricos de la figura 5.
YPD
YPD + NaCl
YPE
YPE + NaCl
Promedio
SD
N
Promedio
SD
N
Promedio
SD
N
Promedio
SD
N
Sc Wt
173.1
10.4
3
778.6
142.0
3
109.4
11.7
3
700.8
50.1
3
Sc acat::DhCTA
257.3
25.9
3
45.9
2.3
3
135.3
12.6
3
148.7
8.9
3
Sc acat::DhCTT
88.8
17.4
3
1673.7
127.2
3
377.1
6.4
3
2104.1
17.5
3
Dh Wt
556.0
35.4
3
372.1
27.7
3
889.3
19.6
3
2543.9
12.8
3
49
Figura 5. Actividad específica de catalasa por cepa en diferentes medios de cultivo. Se
extrajo la proteína de los cultivos crecidos por 72 h por rompimiento celular con perlas de
vidrio, con estos extractos se realizaron ensayos espectrofotométricos calculando el
decaimiento del H2O2 midiendo la absorbancia a 240 nm, las mediciones se realizaron por
triplicado y se calculó la desviación estándar graficada. Los valores numéricos de esta
gráfica se encuentran en la tabla 8.
50
La actividad específica de catalasa es una variable multifa ctorial, algunos de los
factores que probablemente afectan esta característica en cada cepa son: regulación
transcripcional, post-traduccional, metabólica y la respuesta mediada por la
susceptibilidad inherente del organismo al estrés osmótico y oxidativo -dada por la
composición molecular de su citoplasma, membrana y pared celular de cada especie-.
En las cepas transformantes, las secuencias de regulación genética de D. hansenii, que
poseen los genes de catalasa DhCTA y DhCTT, no son las mismas que tiene S. cerevisiae
para regular la expresión de sus propios genes de catalasa, por lo que su regulación no
debe ser exactamente la misma entre especies, incluso pueden no ser reconocidas, o
es posible que mantengan cierta conservación y similitud. A esta fecha no tenemos
certeza de cuáles sean los niveles de expresión ni la regulación post-traduccional de
los genes DhCTA, DhCTT y sus productos en S. cerevisiae.
Sin embargo los experimentos de actividad específica de catalasa realizados sugieren
que existe cierta relación en la expresión de las catalasas de D. hansenii en S. cerevisiae
con la regulación nativa de cada levadura; en el caso de Sc acat::DhCTA, la actividad
específica en medio con glucosa fue cinco veces mayor en ausencia de sal que en su
presencia, esto es acorde a los estudios de regulación de DhCTA en D. hansenii, la cual
presenta una sobre expresión de DhCTA en ausencia de NaCl (Segal-Kischinevzky, et
al., 2011), por lo que la regulación de este gen y su enzima debe funcionar de forma
similar en ambas levaduras cuando estas se encuentran en un medio de cultivo
fermentable. Por el contrario Segal-Kischinevzky y cols. muestran que la expresión de
DhCTA en D. hansenii aumenta en presencia de etanol, lo que no sucede en la cepa Sc
acat::DhCTA.
Por otro lado, la cepa Sc acat::DhCTT mostró similitudes con las actividades específicas
de S. cerevisiae en estado silvestre, siendo estas mayores en presencia de sal que en su
ausencia, 19 veces más cuando su fuente de carbono es glucosa y 5.5 veces más
cuando ésta es etanol. Los estudios de la regulación de DhCTT en D. hansenii es
contraria a estos resultados, lo que sugiere que en la cepa Sc acat::DhCTT, la
51
regulación de la expresión del gen de la catalasa DhCTT ocurre tal como lo haría S.
cerevisiae con su gen nativo ScCTT1.
Ensayos de sensibilidad a choque por peróxido de hidrógeno [H2O2]
Análisis previos de nuestro laboratorio dieron como resultado que tanto D. hansenii
como S. cerevisiae son más susceptibles al daño celular provocado por estrés oxidativo
en fase de crecimiento exponencial, generado por un choque con H2O2, que durante la
fase estacionaria, en la cual presentan mayor tolerancia (Segal-Kischinevzky, et al.,
2011).
Dando seguimiento a estos resultados, se realizaron pruebas de viabilidad ante un
choque con H2O2 a las cepas transformantes Sc acat::DhCTA y Sc acat::DhCTT, tomando
como referencia a la cepa silvestre de S. cerevisiae (Sc Wt). Las pruebas consistieron
en exponer a las células de la fase exponencial de crecimiento durante 180 minutos a
un medio con H2O2 a concentraciones crecientes desde 0 hasta 30 mM,
posteriormente a este tratamiento se removió el H2O2 y se colectaron las células por
centrifugación, finalmente se diluyeron las muestras en concentraciones 1:1, 1:10,
1:100 y 1:1000, sembrando gotas de cada dilución en placas de YPD-agar secas. Las
pruebas se realizaron en cultivos de levaduras con glucosa o etanol como fuente de
carbono y en presencia o ausencia de NaCl, buscando observar diferencias en la
susceptibilidad al choque mediada por los diferentes tipos de metabolismo y
condiciones de salinidad.
Los resultados de estos ensayos de viabilidad (figura 6) muestran que, en fase
exponencial Sc acat::DhCTT presentó una gran resistencia al estrés oxidativo en todas
las condiciones empleadas, creciendo en concentraciones de H2O2 en las que no logró
crecer S. cerevisiae silvestre. De forma muy interesante, el incremento en la
susceptibilidad de Sc acat::DhCTT ante el incremento de la intensidad del choque de
peróxido fue mínimo. Comparando la viabilidad control (0 mM H2O2) contra la
52
viabilidad a máxima concentración (30mM H2O2), no se percibieron cambios
significativos.
Estos resultados, aunados a que las regiones promotoras de DhCTT son las nativas de
D. hansenii, sugieren que la expresión del gen de la catalasa T es regulada por factores
de transcripción de estrés comunes para S. cerevisiae y D. hansenii, como yAP1p y el
elemento general de respuesta al estrés (STRE) (Moradas-Ferreira et al., 1996; Finkel,
2003), por lo que es regulado positivamente bajo el choque de H2O2. Además, la alta
actividad específica de catalasa de Sc acat::DhCTT, obtenida en los ensayos
mencionados en la sección anterior, en comparación a la de la cepa silvestre (Sc Wt),
puede estar amplificando la resistencia observada, obteniendo un fenotipo similar al
que se observa cuando S. cerevisiae ha llegado a fase estacionaria, en la cual las
defensas antioxidantes son positivamente reguladas.
En contraste, la cepa Sc acat:DhCTA sólo se mostró resistente al choque de peróxido
cuando el medio en el que se encontraba no contenía NaCl. Esto concuerda con la baja
actividad específica de catalasa en presencia de sal mostrada en los resultados de la
sección anterior y con los estudios de Segal-Kischinevzky sobre regulación de DhCTA
en D. hansenii, en los que se observa sobre-expresión del gen sólo en ausencia de sal
(Segal-Kischinevzky et al., 2011).
53
Figura 6. Resistencia a H2O2 de S. cerevisiae silvestre, Sc acat::DhCTA y Sc acat::DhCTT
en fase exponencial de crecimiento, en glucosa o etanol como fuente de carbono, con y
sin sal (NaCl 0.6M). Cultivos de Sc Wt, Sc acat::DhCTA y de Sc acat::DhCTT en fase
estacionaria fueron diluidos en medio fresco YPD (A), YPD+NaCl 0.6M (B), YPE (C),
YPE+NaCl 0.6M (D) y expuestos a una concentración de H2O2 de 0, 2.5, 5, 7.5, 10, 15,
20 y 30 mM durante tres horas. Después del tratamiento, el H2O2 fue removido por
centrifugación. Los cultivos fueron resuspendidos en agua bidestilada, diluidos
serialmente y sembrados en placas de YPD, buscando plaquear cantidades iguales de
células. Las placas fueron incubadas a 28 °C durante tres días.
54
La deficiente resistencia al H2O2 en presencia de NaCl de la cepa transformante Sc
acat::DhCTA puede deberse principalmente a la carencia de la catalasa citoplasmática,
ya que se ha demostrado que la catalasa T en S. cerevisiae tiene un papel importante
en la resistencia al estrés osmótico (Schüller et al., 1994), lo cual aunado al estrés
oxidativo generado por el H2O2 pudo provocar una menor viabilidad en condiciones
con estrés osmótico. Sin embargo se observó una mayor resistencia al estrés oxidativo
cuando la cepa creció en etanol como medio de cultivo, lo cual puede ser
contradictorio ya que el metabolizar el etanol conlleva generación de ERO en la
cadena de transporte de electrones. Esto se explicaría si el etanol regulara
positivamente a la catalasa A de D. hansenii y entonces así, esta catalasa sería la
responsable de contrarrestar eficientemente el estrés oxidativo generado por el
peróxido.
A la fecha no tenemos evidencia de la localización específica de las catalasas DhCTA y
DhCTT de D. hansenii en la misma levadura y en las transformantes, pero los
resultados aquí presentados sugieren que tienen la misma localización que las
catalasas de S. cerevisiae en su estado silvestre, es decir, la catalasa A en peroxisomas
y la T en citoplasma, ya que la función de mediación de estrés oxidativo está ligada con
la regulación positiva de la catalasa T, confiriendo una mejor resistencia a la cepa Sc
acat::DhCTT; mientras que la regulación positiva de la catalasa A está ligada a la
oxidación metabólica de ácidos grasos (Moradas-Ferreira et al., 1996). Realizar un
experimento en el que la cepa Sc acat::DhCTA sea forzada a adoptar este metabolismo
y comparar su eficiencia ante el estrés oxidativo con las demás cepas, podría dar
resultados positivos a este supuesto.
Adaptaciones halofílicas de las catalasas DhCTA y DhCTT.
Análisis bioinformático.
Debido a la importancia que debe representar la adaptación al NaCl en D. hansenii
para colonizar ambientes con estrés osmótico y halino, es posible que las catalasas de
D. hansenii presenten adaptaciones moleculares para estos ambientes. Se han descrito
55
una serie de características a nivel de secuencia de aminoácidos en las proteínas de
organismos halófilos como son mayor presencia de aminoácidos con carácter ácido,
pocos aminoácidos hidrofóbicos y una mayor cantidad de serina (Lanyi, 1974); por
esta razón, se realizó un análisis bioinformático para buscar estas modificaciones que
podrían significar una adaptación molecular de las catalasas a ambientes con altas
concentraciones de sal.
Se llevó a cabo un alineamiento pareado de las secuencias de aminoácidos de las
catalasas de D. hansenii con las de S. cerevisiae, utilizando la herramienta
bioinformática en línea Clustal Omega (Sievers et al., 2011); se determinó que los
porcentajes de identidad son del 68% en el caso de las catalasas tipo A y de 53% para
las catalasas tipo T.
Alineamiento de secuencias de aminoácidos para catalasas tipo A
DhCTA x ScCTA1= 68% de identidad
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56
Alineamiento de secuencias de aminoácidos para catalasas tipo T
DhCTT x ScCTT1 = 53% Identidad
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SACE0G07722g.aa KVIAECLGVPWEPVDLEGYAKTWSIASAN*
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Simbología:
* = Identidad : = Cambio conservativo . = Cambio semi-conservativo
Catalasas T
Posiciones totales
562
Aminoácidos idénticos
297
Aminoácidos diferentes
265
% de identidad
53%
Tablas 9 y 10. Resultados de la alineación de las secuencias de aminoácidos de las
catalasas T y A de D. hansenii y S. cerevisiae. Debido a que en el alineamiento pareado
algunas posiciones muestran espacios en blanco o gaps, para realizar el análisis, se
tomó en cuenta el número máximo de posiciones (posiciones totales), siendo éste el
de la secuencia de mayor tamaño; con este valor se calculó a partir del porcentaje de
identidad dado, el número de aminoácidos idénticos y diferentes, estos valores son
usados para el análisis posterior.
Catalasas A
Posiciones totales
515
Aminoácidos idénticos
348
Aminoácidos diferentes
167
% de identidad
68%
57
Tomando en cuenta la identidad de las proteínas (tablas 9 y 10), se le otorgó mayor
peso a los cambios en los aminoácidos que no están conservados en las secuencias, de
manera que sólo se usaron estos últimos para realizar el análisis.
Para determinar la presencia de aminoácidos con carácter hidrofóbico y ácido, se usó
el programa bioinformático en línea PEPSTATS del proyecto de software abierto
EMBOSS (Rice et al., 2000); resultó que tanto la catalasa tipo T como la tipo A de D.
hansenii presentan cambios en sus secuencias que reflejan las tres características
predichas por Lanyi como adaptaciones moleculares para proteínas halófilas (Lanyi,
1974): DhCTA tiene un decremento de 4% y DhCTT de 3% en la cantidad de
aminoácidos hidrofóbicos, ambas proteínas de D. hansenii tuvieron un contenido
mayor de aminoácidos de carácter ácido y de serina, en comparación con las catalasas
de S. cerevisiae (Tabla 11).
DhCTT
DhCTA
Aminoácidos
Número de
cambios
%
Número de
cambios
%
Hidrofóbicos
-9
-3.40
-7
-4.20
Ácidos
1
0.38
1
0.60
Serina
8
3.02
2
1.20
Tabla 11. Resultados finales del análisis de composición proteínica. Usando la
herramienta bioinformática PEPSTATS de la suite EMBOSS, se obtuvieron los datos
arriba presentados, los porcentajes fueron obtenidos tomando en cuenta como el
100% sólo los aminoácidos en los que difieren las secuencias de D. hansenii con
respecto a las de S. cerevisiae.
El tipo de interacciones que tienen los aminoácidos en las proteínas son muy
complejos como para determinar que los cambios aquí identificados en las secuencias
de las catalasas de D. hansenii son justamente adaptaciones moleculares, pero es
importante recalcar que tanto DhCTA como DhCTT tienen cambios en la composición
de aminoácidos comparándolos con ScCTA y ScCTT, de forma muy similar, por lo que
estos no deben ser producto del azar, lo que sugiere que estos cambios en realidad
son funcionales y probablemente estén ligados a una resistencia al estrés halino en
ambientes con altas concentraciones de sal.
58
VIII. PERSPECTIVAS
Los resultados aquí presentados, revisados con la bibliografía, sugieren que la catalasa
A de D. hansenii es poco relevante en la respuesta a estrés oxidativo exógeno,
generado por el peróxido, y endógeno, al metabolizar el etanol. Es posible que su
importancia radique en funciones del metabolismo de ácidos grasos; experimentos
que determinen su importancia y eficiencia en procesos que requieran este tipo de
metabolismo, pueden ser clave para mejorar la eficiencia de procesos biotecnológicos.
Estudios posteriores que busquen mecanismos de resistencia a estrés deben centrar
sus esfuerzos y observaciones en la comprensión de la catalasa DhCTT, ya que estos
estudios demuestran que su respuesta ante diferentes tipos de estrés de forma
simultánea es muy buena, contrarrestando los efectos negativos de las ERO y
permitiendo crecer bajo condiciones de estrés oxidativo.
Se sugiere que para tener una mayor comprensión de la función de las catalasas, se
realicen experimentos de inmunotinción o co-expresión con una proteína
fluorescente, para localizar a nivel celular las catalasas DhCTA y DhCTT, tanto en D.
hansenii como en las cepas transformantes. Aunado a esto, los análisis de expresión de
las catalasas en las transformantes ayudarán a comprender cómo están funcionando
los genes y específicamente en qué momentos son regulados positiva o
negativamente.
Por último, la generación de una cepa de S. cerevisiae complementada con las dos
catalasas de D. hansenii muy probablemente presente una gran resistencia al estrés
oxidativo, superior a la presente en las complementadas de forma simple. Se
recomienda a su vez que las nuevas transformantes sean generadas con plásmidos de
integración (Yip), ya que esto implicaría una mayor estabilidad del gen, lo cual es útil
en el laboratorio a largo plazo, ya que las cepas no perderán la actividad.
59
IX. CONCLUSIONES
La cepa complementada Sc acat::DhCTT resultó ser más resistente al estrés oxidativo
mediado por peróxido en la fase de crecimiento exponencial, que la cepa silvestre de S.
cerevisiae; también mostró una mayor ventaja de crecimiento en medio de cultivo con
etanol como fuente de carbono, sobre todas las demás cepas, y su actividad específica
en diferentes medios sugiere que es regulada como su homóloga en S. cerevisiae.
La cepa complementada Sc acat::DhCTA presentó un incremento en la resistencia a
peróxido, en comparación con la cepa silvestre de S. cerevisiae, sólo en ausencia de sal.
Lo cual respalda resultados anteriores y sugiere que la función de la catalasa A de D.
hansenii no media el estrés a nivel general. Además los resultados obtenidos sugieren
que la catalasa DhCTA en S. cerevisiae es regulada de forma diferente a su homóloga.
La composición de aminoácidos de las catalasas de D. hansenii, comparadas con las de
S. cerevisiae, sugiere que las catalasas de la levadura eurihalina tienen adaptaciones
moleculares a un ambiente halino.
Los resultados de este estudio sugieren que futuras investigaciones en las catalasas de
D. hansenii pueden evidenciar la existencia de nuevos mecanismos que puedan
simultáneamente proveer resistencia al estrés osmótico y al oxidativo.
Específicamente la catalasa T de D. hansenii se postula para ser un gen candidato para
mediar estrés oxidativo tanto exógeno como endógeno.
60
X. REFERENCIAS
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