Content uploaded by Alex Enrique Bustillo
Author content
All content in this area was uploaded by Alex Enrique Bustillo on Jun 08, 2015
Content may be subject to copyright.
UNIVERSIDAD NACIONAL - PALMIRA
CURSO PATOLOGIA DE INSECTOS
Alex Enrique Bustillo Pardey
MÉTODO PARA CUANTIFICAR SUSPENSIONES DE ESPORAS DE
HONGOS Y OTROS ORGANISMOS
El hemocitómetro (cámara de Neubauer) es un instrumento ideado para contar células
sanguíneas y se puede usar también para estimar la concentración de conidias en una
suspensión acuosa de esporas (Figura 1).
El reglaje del hemocitómetro en su base consiste de 9 mm2.Las líneas limítrofes son
las líneas centrales en grupos de a tres. El milímetro cuadrado localizado en el centro,
está formado por 25 grupos cada uno de 16 pequeños cuadrados, cada grupo
separado por una triple línea, siendo la del medio el limite. Los cuatro milímetros
cuadrados de las esquinas están divididos en 16 pequeños cuadros (Figura 2). Estas
diferencias en las divisiones se hacen para ayudar en la orientación cuando se esté
contando. La altura del área del contaje cuando se coloca el cubreobjetos es de 0,100
mm, de tal manera que el volumen de la suspensión sobre un milímetro cuadrado es de
0,1 rnm". Los hemocitómetros son dobles o sea que tienen dos áreas sobre las cuales
se puede efectuar el conteo están localizadas una a cada lado de las áreas planas
levantadas en la sección central del hemocitómetro.
I
7~
CUBRE OBJETO GRU:so
I
'-----,
Figura 1. El hemocitómetro, compuesto de dos áreas de conteo en la sección central y
una laminilla gruesa.
t
3
3
3
3
:1
:1
t-
1mm
Figura 2. Reglaje del hemocitómetro en cada una de las áreas de conteo.
-t-
Imm
-t--
Imm
--t
La pipeta de dilución está arbitrariamente calibrada en 0,1 unidades desde la punta.
Para usarla en suspensiones de esporas, la pipeta se llena hasta la marca 1,O Y luego
se diluye hasta la marca 11. Debido a que virtualmente toda la muestra se vierte en el
bulbo por el fluido de dilución, dejando la sección de la punta que contiene 1,0 del fluido
de dilución, la dilución de la suspensión se calcula en base a la dilución de 1,0 a 10,0, o
sea que el factor de dilución es 10. Para números extremadamente grandes de esporas
se toma una muestra de 0,5 unidades, siendo así el factor de dilucido 20.
PROCEDIMIENTO
1. Para preparar la muestra a contar se toma el tubo que contiene el hongo al cual
se le adiciona 10 mi de agua destilada esterilizada y se agita durante dos
minutos mediante movimientos circulares.
2. Luego se decanta la suspensión en un tubo de vidrio estéril. Adicione cuatro
gotas de lactofenol, Agite el tubo de nuevo y déjelo quieto durante 5 mino Agite
de nuevo el tubo durante 2 mino Luego colecte 2 mi de la suspensión en una
pipeta y transfiéralo a un vial.
3. Tome la pipeta de dilución, sosténgala en una posición horizontal y coloque su
punta en la suspensión. Mueva la pipeta hacia una posición vertical a medida
que el fluido alcanza el nivel deseado.
4. No intente aspirar la muestra en la pipeta, deje obrar la capilaridad de la pipeta.
Mucho cuidado se debe ejercer en obtener una medida exacta de la muestra, ya
que cualquier error aquí introduce un error muy grande en el valor final contado.
5. Después de colectar la muestra, limpie la punta de la pipeta con el fluido de
dilucido hasta la marca encima del bulbo. Sostenga la pipeta a lo largo entre los
dedos indice y pulgar y agítela durante dos minutos para obtener una mejor
dispersión de las conidias.
6. Luego descarte tres gotas y coloque la cuarta en el borde del cubreobjetos del
hemocitómetro en tal posición que sea succionado hacia la cámara de conteo.
7. Evite que la cámara se inunde ya que introduce error en la cuenta. Después de
llenar satisfactoriamente el área de contaje, (ambos lados), se debe limpiar
inmediatamente la pipeta descartando el resto del fluido y lavarla con clorox
agua destilada, alcohol y éter y luego secarla con papel de lentes.
8. Después de llenar el área de contaje, se deja quieta durante 1 a 2 min, con el fin
de que las conidias se sedimenten en la base del hemocitómetro.
9. Luego se observa al microscopio usando el objetivo 10X. Se ajusta la luz con el
fin de que las líneas sean completamente visibles.
10.Se cuentan todas las conidias en todas las áreas de los custro milímetros
cuadrados de las esquinas y del centro.
11.En el caso de que resulten conidias sobre las líneas límites, se cuentan aquellas
que están depositadas sobre los límites de abajo y los de la derecha, pero no en
los de arriba y de la izquierda. Registre el número de células en cada milímetro
cuadrado.
12.Haga un conteo en cada uno de los dos lugares de conteo del hemocitómetro.
13.Cuando termine la cuenta, limpie el cubreobjetos y el hemocitómetro con clorox
agua destilada, alcohol y éter y con papel de lentes seque todas las áreas.
Para el cálculo de las cuentas se usa la siguiente fórmula:
Número total de células =(No. de células x dilución x 104)
I
No. áreas mm2contadas
Este cálculo estima el número
I
mi de suspensión. Luego, multiplique éste resultado por
el número de mililitros usados en cualquier prueba para su cuantificación.
