DETECTION OF PATHOGENIC PRION PROTEIN

Abstract

This article gives information about the current methods used in diagnosis of prion
diseases. Prion diseases are neurodegenerative disorders caused by pathogenic prions.
Pathogenic prions are abnormal isoform of prion protein (PrPC), is a host-encoded
molecule. PrPC to PrPSc spontaneous conversion leads to PrPSc accumulation in neurons
and different tissues (such as brain tissue, lymph nodes and tonsils). Most of the
diagnostic methods for prion diseases are dependent on PrPSc detection in neurons and
tissues. High rate PrPSc detection in many different samples is a prerequisite for a
reliable diagnostic method. For this purpose, several methods and cell lines that are
susceptible to prion infection have been developed for detection of PrPSc

Full text

Derleme
© 2012 DEÜ TIP FAKÜLTESİ DERGİSİ CİLT 26, SAYI 2, (AĞUSTOS) 2012, 141 - 149
Patolojik Prion Proteininin Tespiti
DETECTION OF PATHOGENIC PRION PROTEIN
Murat ŞEVİK
Veteriner Kontrol Enstitüsü Müdürlüğü, Moleküler Mikrobiyoloji Laboratuvarı
Murat ŞEVİK
Veteriner Kontrol Enstitüsü
Müdürlüğü
Moleküler Mikrobiyoloji
Laboratuvarı
Tel: (332) 322 47 41
Faks: (332) 320 3798
Gsm: (542) 486 22 35
e-posta: dr_muratank@hotmail.com
ÖZET
Bu makalede, prion hastalıklarının tanısında kullanılan güncel yöntemler hakkında
bilgiler verilmektedir. Prion hastalıkları, patolojik prionların neden olduğu
nörodejeneratif hastalıklardır. Patolojik prionlar (PrPSc), konak tarafından kodlanan
prion proteininin (PrPC), anormal izoformlarıdır. PrPC’nin, PrPSc’e spontan dönüşümü,
nöronlarda ve farklı dokularda (beyin dokusu, lenf bezleri ve tonsiller gibi) PrPSc
birikimine yol açmaktadır. Prion hastalıklarının tanı yöntemlerinin birçoğu, nöronlarda
ve dokulardaki PrPSc’nin tespitine dayanmaktadır. Güvenilir bir tanı metodunun ön
koşulu, birçok örnekte PrPSc’i yüksek oranda tespit etmesidir. Bu amaç doğrultu-
sunda, PrPSc’i tespit etmek için çeşitli yöntemler ve prion enfeksiyonuna duyarlı hücre
hatları geliştirilmiştir.
Anahtar sözcükler: Prion, insan, hayvan, nöron, tanı yöntemleri
SUMMARY
This article gives information about the current methods used in diagnosis of prion
diseases. Prion diseases are neurodegenerative disorders caused by pathogenic prions.
Pathogenic prions are abnormal isoform of prion protein (PrPC), is a host-encoded
molecule. PrPC to PrPSc spontaneous conversion leads to PrPSc accumulation in neurons
and different tissues (such as brain tissue, lymph nodes and tonsils). Most of the
diagnostic methods for prion diseases are dependent on PrPSc detection in neurons and
tissues. High rate PrPSc detection in many different samples is a prerequisite for a
reliable diagnostic method. For this purpose, several methods and cell lines that are
susceptible to prion infection have been developed for detection of PrPSc.
Key words: Prion, humans, animals, neuron, diagnostic methods
BulaşıcıSpongiformEnsefalopatiler(TSE)olarakda
bilinenprionhastalıkları,heminsanlarıhemdehayvan‐
larıetkileyenölümcülnörodejeneratifhastalıklardır.
Patojenikmekanizmalarıfarklılıkgöstermeklebirlikte,
HücreselPrionProteininin(PrPC),Scrapieİzoformuolan
PrionProteinine(PrPSc)konformasyoneldönüşümübütün
prionhastalıklarındaortaketiyolojiközelliktir(1).
PrPC,immunsistemhücrelerindevemerkezisinirsis‐
teminde,yüksekkonsantrasyonlardaekspreseedilen,bir
membranglikoproteindir(2,3).İnsanprionproteini,253
aminoasidesahipbirproteinolarak,kromozom20’inkısa
kolundayeralanPRNPgenindeüretilir(4).PrPC’ninmo‐

Patolojik prion proteininin tespiti
142
leküleryapısı,NveCterminalbölgelerindenoluşmakta‐
dır.Nterminalucu,sondereceesnektirvegenellikleçö‐
zünürproteininin,yapısalolmayanformuolarakşekille‐
nir.Nterminalucunun,PrPSc’ninβtabakasınınyapılan‐
dırmasındagörevaldığıdüşünülmektedir.Cterminalucu
ise,3adetαheliksve2adetkısaanti‐paralelβipliğinden
oluşanglobülerbiralandır(1).PrPC’ninfonksiyonutam
olarakbilinmemeklebirlikte,nöronalsinyaltrans‐
düksiyonsüreçlerindevemetalmetabolizmadafonk‐
siyonlarınınolduğuilerisürülmektedir(5).PrPCvePrPSc
izoformlarınınbirbirindenayırtedilmesindesahipol‐
duklarımoleküleryapılardikkatealınmaktadır.PrPC’nin
%42’siαheliks,%3’üβtabakaiken,PrPSc’nin%30’uα
heliks,%43’üβtabakasıdır(1).AyrıcaPrPC,proteinazK’a
duyarlıiken,PrPScproteinazK’akarşıdirençlidir(3).
PrPC’nin,PrPSc’espontanolarakdönüştüğüveyaPrPC’i
kodlayangende(insanlardaPRNPgeni)meydanagelen
mutasyonlarsonucu,PrPScşekillendiğivarsayılmaktadır.
Fakatmutasyonlarolmadankonformasyoneldeğişiklikle‐
rinnasılgerçekleştiğihenüzbilinmemektedir(4).

PRİONHASTALIKLARI
TSEetiyolojisindehorizantal,vertikalbulaşmavege‐
netikpredispozisyonsözkonusudur.Klinikolarakhasta‐
lığınmeydanagelmesindenönceaylarcaveyayıllarca
sürenbirinkübasyonsüresigözlenmektedir(6).Hastalık,
nöronalkayıpvebeyininspongiformdejenerasyonuile
birlikteaktiveolmuşastrositlervemikrogliailekarakteri‐
zedir(7).İnsanvehayvanlardabelirlenenprionhastalık‐
ları,Tablo’dagösterilmektedir(8).
İnsanlardaprionhastalıklarınınensıkgörülenformu,
heryaştakiveetnikgruptaki,kadınveerkeklerietkileyen,
sCJD’dir.PRNPgeninin,metioninvevalinpolimorfik
bölümlerinin,sporadik,iatrojenikvevariantCJDduyarlı‐
lığınıetkilediğitespitedilmiştir.Kafkasnüfusunun%40
ileyapılanbiraraştırmada,sCJDhastalarınyaklaşık
%60’ının,vCJDhastalarının%100’ününmetioninhomo‐
zigotolduğutespitedilmiştir.Budurum,prionhastalık‐
larınınkalıtsalolmayanformlarıarasındagenetikyatkın‐
lıkolabileceğinigöstermektedir.sCJD’nin,genelölüm
oranıheryılyaklaşık1milyoninsanda1‐2vakadır(9).


Tablo. Prion hastalıkları
Hastalık adı Konak Patogenez Mekanizması
Kuru İnsan Törensel yamyamlık ile enfeksiyon
iCJD İnsan Prion ile kontamine HGH, dura mater grefti ile enfeksiyon
vCJD İnsan Sığır prionları ile enfeksiyon
fCJD İnsan PrP geninde germline mutasyonlar
sCJD İnsan Somatik mutasyon veya PrPC’nin, PrPSc’e spontan dönüşümü
GSS İnsan PrP geninde germline mutasyonlar
FFI İnsan PrP geninde germline mutasyonlar
FSI İnsan Somatik mutasyon veya PrPC’nin, PrPSc’e spontan dönüşümü
Scrapie Koyun, Keçi Genetiksel olarak duyarlı hayvanlarda enfeksiyon
BSE Sığır Prion ile kontamine et ve kemik unu ile enfeksiyon
TME Vizon Koyun veya sığır prionları ile enfeksiyon
CWD Katır geyiği, elk Bilinmiyor
FSE Kedi Prion ile kontamine sığır dokuları, et ve kemik unu ile enfeksiyon
EUE İri ceylan, Nyala
Afrika antilobu
Prion ile kontamine et ve kemik unu ile enfeksiyon
iCJD, iatrojenik Creutzfeldt- Jakob hastalığı (CJD); vCJD, varyant CJD; fCJD, familial (ailesel) CJD; sCJD, sporadik CJD; GSS, Gerstmann-
Sträussler-Scheinker hastalığı; FFI, fatal familial insomnia; FSI, fatal sporadik insomnia; BSE, bovine spongiform ensefalopati; TME, transmissible
mink ensefalopati; CWD, chronic wasting disease; FSE, feline spongiform ensefalopati; HGH, human growth hormone (insan büyüme hormonu);
EUE, egzotik toynaklı ensefalopatisi


Patolojik prion proteininin tespiti
143
AileiçindegenetikolarakortayaçıkanfCJDoranının
yaklaşık%10ile%20arasındaolduğuvefCJDvakalarının
PRNPgeninin,kodon200mutasyonlarıileilişkiliolduğu
bildirilmiştir(9,10).AyrıcaBrezilya’dabirailede,PRNP
genininkodon183mutasyonununda,fCJD’enedenol‐
duğutespitedilmiştir.Yapılanaraştırmada,ailede3kuşak
boyunca17kişininhastalıktanetkilenmiş olabileceğibe‐
lirlenmiştir(11).
Britanya’da,1995yılındaBSEilekontaminegıdaların,
insanlartarafındantüketilmesiilevCJDvakalarınınortaya
çıktığıbildirilmiştir.Deneyselçalışmalarsonucueldeedi‐
lenpatolojikvebiyokimyasalkanıtlarilevCJDveBSE’e
aynıprionajanınınnedenolduğudoğrulanmıştır(12).
Özelliklegençinsanlardagörülenhastalığınbuformu,
20’liyaşlarında,200insanınölümünenedenolmuştur(9).
Nadirendeolsa,insandaninsanaprionhastalıklarının
nakli,cerrahialetlerinyanlış dekontaminasyonu,insan
kadavradokularındanalınanbiyolojikürünlerinkulla‐
nımıyadakantransfüzyonuilegerçekleşmektedir(9).Bu
şekildenakledileniCJD,ilkkezDuffyveark.tarafından,
kornealgreftuygulamasından18aysonra,otopsibulgu‐
larıileCJDolduğutespitedilen55yaşındakibirhastada
bildirilmiştir(35).Kornealgreftdonörününde,CJDso‐
nucuöldüğü,otopsisonucuiledoğrulanmıştır.Otarihten
itibaren,korneagreftiileolasıCJDnakliriskibulunan2
vakasırasıyla,AlmanyaveJaponya’dabildirilmiştir.Al‐
manhasta,kornealgreftuygulamasından30yılsonra46
yaşındaölmüştür.JaponhastadadaCJDvarlığı,otopsi
sonucuiledoğrulanmıştır(13).
EpidemikbulaşıcıbirhastalıkolanKuru,1950’lerde
PapuaYeniGine’deki,Forekabilesindetespitedilmiştir.
Hastalığın,ritüelbirceneazetörenisırasındaöleninsanın
beynininkafatasındançıkarılıp,pişirilipyenmesiilein‐
sanlarabulaştığıbelirlenmiştir(14).Kuru,onlarcayılsü‐
ren(50yılakadar)inkübasyonsüresinesahiptir(15).
EnyaygınaileselTSE,GSS’dir.Genelliklehayatın
üçüncüveyadördüncüonyılındameydanagelir.GSS’e
nedenolanmutasyon(P102L)ilkkez1989yılındaHsiao
tarafındanbelirlenmiştir.Dahasonraprionproteingeni‐
ninfarklıkodonlarında(kodon102,105,117,145,198)
meydanagelenbirçokmutasyonunda,GSS’enedenol‐
duğutespitedilmiştir(11,15).
FFIismiilkkez,1986yılındaLugaresiveark.tarafın‐
dan,progresifinsomni,otonomikdisfonksiyon,dizartri,
tremorvemiyoklonusuolan52yaşındakibirhastada
kullanılmıştır.Hastanınbeş kuşakboyuncakiakrabaları
arasındayapılanaraştırmada,7kişininnöropatolojikin‐
celemesonucuFFIolduğu,22kişininisemuhtemelen
FFI’danöldüğütespitedilmiştir(11).Kalıtsalbirprion
hastalığıolanFFI,PRNPgenininkodon178’indeki
missensemutasyonlarileilişkilendirilmektedir.Bununla
birlikte,PRNPgenindemutasyonşekillenmedendegeli‐
şen,sporadikFFIvakalarıbildirilmiştir(16).
HASTALIĞINTANISI
Virüsvebakterilertarafındanmeydanagetirilenhas‐
talıklardanfarklıolarakprionhastalıklarının,serolojik
veyahücrekültüranalizlerivePCRgibiyöntemlerile
tanımlanmasıgüçtür.Çünküenfeksiyözajanolan
prionun,nükleikasitbileşeniyokturvenormalkonak
prionproteinininanormalbiçimiolarakmeydanagel‐
mektedir.Enfekteorganizmatarafındanyabancıbirorga‐
nizmaolaraktanımlanmadığıiçin,immünolojikyanıt
gözlenmemektedir.Prionhastalıkları,genelliklekliniksel
olaraktanımlanmaktavebeyindokusununpost‐mortem
histopatolojikanaliziiledoğrulanmaktadır.Prionhasta‐
lıklarınıntespitindeşuantekgüvenilirmolekülerbelirle‐
yici,PrPSc’dir.Hastalığıntanısında,PrPSc’ninmerkezisinir
sistemindevelenforetikülerdokulardavarlığıaraştırıl‐
maktadır(6).
TanıiçinKullanılanMetotlar
1.”WesternBlot”:İmmünolojikbiryöntemolan“wes‐
ternblot”tekniği,beyinvediğerdokulardakiproteinazK
dirençli,PrPfragmentlerinintespitinedayanmaktadır.
Testinprensibi,monoklonalantikorlarınpatolojikprion‐
laraselektifolarakbağlanmasıvetakibenrenkreaksiyonu
vermesidir.Testprosedürünegörebeyinyadaomurilik
parçalarıhomojenizeedilerek,proteinazKileparça‐
lanmaktavepoliakrilamidjeleaktarılmaktadır.Örnek
elektroforetifolarakayrımındansonrabirmembrana
transferedilmektevemonoklonalantikorlarkullanılarak
kemilüminesansyardımıylapatojenprionproteinleri
saptanmaktadır.Patolojikprionproteinleri,proteinazK
ileparçalanmadıklarından,proteinbantlarıimmünolojik
olarakişaretlenmekteveboyanmaktadır(6,17).

Patolojik prion proteininin tespiti
144
“Westernblot”testindeoluşanbantlarınyoğunluğu,
proteinglikolizasyonununmiktarınıgösterenbirdeğerdir
(6,18).Collingevemeslektaşları,bantyoğunluğunun
sporadik,iatrojenikveyenivariantCJD(nvCJD)’inayrı‐
mındakullanılabileceğinibildirmiştirler(36).Yaptıkları
analizlerde,4tipbantoluşumunutespitetmişlerdir.
Bovinespongiformensefalopati(BSE)ilenvCJD’ninaynı
bantörneğini(tip–4),sCJD’nintip‐1vetip‐2,iCJD’ninise
tip‐3bandınıgösterdiklerinibildirmişlerdir(11).“Western
blot”tekniği,sodyumfosfotungstikasitilePrPSc’nin
presipitasyonugibiekstraksiyonmetotlarıilegenişletile‐
bilmektedir.Hamsterbeyinhomojenatında,insansereb‐
rospinalsıvısında,beyindokusundaveidrarındamevcut
olandüşükveyayüksekkonsantrasyonlardaki,PrPSc’lerin
sensitivitesinin,streptomisinpresipitasyonuiledikkat
çekicişekildearttığıtespitedilmiştir(19).
2.ELISA:Buyöntemde,monoklonalantikorlakaplı
pleytleredilüeedilmiş örnekuygulanmaktaveantikora
bağlıbirdeteksiyonsistemiilePrPScmiktarıbelirlenmek‐
tedir(18).Proteinazilemuameleişleminiiçerenörnek
hazırlamaaşamasını,presipitasyonveanalitizenginleş‐
tirmekiçingerçekleştirilensantrifüjadımlarıtakipeder.
Renkdönüştürücüenzimilebirleşmişantikorunkullanıl‐
dığısandviçELISAiletanımlamayapılır.Tanımlama
kemilüminesansilegerçekleşir.Kemilüminesansileta‐
nımlamada,“cut‐off”değerlerikullanılır(6).
SandviçELISAyöntemiile1LD50(öldürücüetkilidoz)
BSEenfektivitesindendahaazorandaPrPSciçerenörnek‐
lerdekivekliniksemptombaşlangıcındanönce,BSE’li
sığırbeyinlerindekiPrPScvarlığıtespitedilebilmektedir
(18).ELISAtestleri,yükseksensivitevespesifitiyesahip
olupscrapie,BSEveCWD’insürveyansprogramlarındaki
çoksayıdakinumunenintaranmasıiçinkullanılmaktadır
(12).
3.İmmunhistokimya(IHC):Amiloidplakbirikimi,
astrogliosisvenöralhücrelerinkaybolmasıgibiprion
hastalıklarıiçintipikolanözellikler,beyinkesitlerinin,
IHCanaliziiletespitedilebilmektedir(17).IHC,formalin
ilefiskeedilmiş,dondurulmuş veparafinegömülüdoku
örneklerindeki,PrPSc’nininsitubelirlenmesineveprion
hastalıklarındaoluşanamiloidplakların,Alzheimergibi
nörodejeneratifhastalıklardaoluşannöritikplaklardan
ayrımına,imkânsağlamaktadır(6,20).Beyindeki,PrP
immunpozitifamiloidplaklar,bazıprionhastalıklarıiçin
sonderecespesifikbirtanıözelliğidir.BütünGerstmann‐
Sträussler‐ScheinkerhastalarındavebazıCJDhastala‐
rında,PrPimmunpozitifamiloidplaklarbulunmaktadır.
vCJD’despongiformvakuollerileçevrelenmiş florid
plaklar,diğerinsanprionhastalıklarındabulunmamakta‐
dır.Buplaklar,vCJD’idiğerprionhastalıklarındanayıran
birpatogenezdir.Benzerfloridplakların,BSEileenfekte
maymunlardabulunması,vCJDveBSE’eaynıpriontürü‐
nünnedenolduğuhipotezininortayaçıkmasınaneden
olmuştur(6).
IHC,sadecePrPSc’ninvarlığınıtespitetmez.Aynıza‐
mandaPrPSc’ninbeyinvelenfoiddokulardakidağılımını
daortayaçıkarır.AstrositikmarkerproteinolanGlial
FibrillerAsidikProteine(GFAP),karşıantikorlarkullana‐
rakyapılanimmunhistokimyasalboyamaileastrositik
glikozun,beyindokusundakiderecesibelirlenebilmekte‐
dir.Bazıpriontürlerinin(vCJD,scrapieveCWD),yoğun
lenfotropizmesahipolmasınedeniyle,immunhistokim‐
yanınTSE’lerinprekliniktanısındakullanılmasıöneril‐
mektedir.Yakıngeçmişteyapılanbirçalışmada,IHCile
oralolarakCWDprionlarınamaruzkalanbirgeyiğin,
lenfoiddokularında,42günsonrapatolojikPrPproteini
saptanmıştır.Yapılandiğerbirçalışmadabirsığır,100gr
BSE’libeyinileoralolarakenfekteedilmiş vefarklıza‐
manlardaanalizleryapılmıştır.Klinikolarakbelirtilerin
görülmesindençokkısabirsüreöncehistolojikolarakpo‐
zitifsonuçeldeedilmiş iken,immunhistokimyasaltek‐
niklerile6ayönceden,PrPScbirikimitespitedilmiştir(6).
4.“Bioassay”:Deneyselolarakhayvanlarınenfekte
edilerek,diagnostikvearaştırmauygulamalarıileprion
türününtanımlanmasınıamaçlayanbirmetottur.Bume‐
totiledokulardakiPrPScenfektivitesihakkındaönemli
bilgilereldeedilmiştir.“Biyoassay”analizleriuzunsür‐
mekte(BSE’nin,RIIIfaresindekiinkübasyonu408gündür)
veyoğunişgücügerektirmektedir.Sonuçlarıyorumlamak
herzamankolaydeğildir.Homologtürlerarasındayapı‐
lan,“bioassay”çalışmalarıenduyarlıyöntemdir.Örneğin,
BSEiçindana“bioassay”leri,fare“bioassay”lerindendaha
duyarlıdır.Deneyselolarakenfekteedilebilecektürçeşi‐
dininsınırlıolmasıinsan,koyun,geyik,elkvebüyükbaş
PrPgenlerinitaşıyan,transgenikfarelerinüretilmesini

Patolojik prion proteininin tespiti
145
sağlamıştır(7).Transgenikfareler,BSEprionlarıile
enfekteolmayakarşı,sığırlardan10kat,RIIIfarelerden
1000katdahaduyarlısığırPrP’leriekspreseederler(6).
Ayrıca,doğalkonağagenetikyakınlıklarındandolayı
inkübasyonsürelerikısalmıştır(7).Buözellikleritrans‐
genikfareleri,insanvesığırprionlarıntanımlanmasında
önemlikılmaktadır(6).
5.HücreKültürTeknikleri:Hücrekültürmodelleri,
prionenfeksiyonçalışmalarındaPrPScoluşumununmole‐
külermekanizmasınınvehücreotonommodelinde
PrPC’nin,PrPSc’edönüşümünde,PrP’ninaminoasitdizile‐
rininveyapısalkısımlarınındahaiyianlaşılmasınısağla‐
makiçintasarlanmaktadır.Prionenfeksiyonmekanizması
çalışmalarında,farklıduyarlıhücreler(N2a;farenöro‐
blastoma,PC12;ratfeokromositomagibi)kullanılmak‐
tadır.NörohipotalmikhücreolanGT1,yüksekseviye‐
lerdekiPrPCekspresyonlarıgösterirveprionhastalıkla‐
rına,diğerhücrelerdendahaduyarlıdır.Prionahassas
farklıhücrelerinbulunması,prionenfeksiyonlarınınaraş‐
tırılabileceğiyenihücrekültürmodelleriningeliştirilme‐
sinikolaylaştırmaktadır.Prionenfektebeyinlerdenelde
edilenprimerkültürler,devamlıpasajlananhücreleriko‐
laylıklasağlamaktadır.Örneğin,ScHB(scrapieileenfekte
hamsterbeyinhücresi)veSMB(scrapieileenfektefare
beyinhücresi)prionileenfektehayvanlardanüretilmiştir.
Günümüzdeinsanembriyonikkökhücreleri,prionhasta‐
lıklarınınenfeksiyonmekanizmalarınınaydınlatılmasında
kullanılmayabaşlamıştır(17).
Enfektiviteveöldürücüetkilidozuntespitçalışmala‐
rında,hücrekültürleridekullanılmaktadır.Prionile
enfektehayvanlarınbeyinhomojenatları,pasajlanmadan
1‐2günöncekültürortamınaeklenir.Herhücrenin
enfektivitesiveyaPrPScüretimi,prionileenfeksiyonora‐
nınagörebelirlenir.Enfektivite,hücrelerintraserebral
inokülasyoniledeneyhayvanlarınınbeyinlerineenjekte
edildiktensonraölçülür.Deneyhayvanlarıbeynineen‐
jekteedilmedenöncehücreler,tekraredendonma‐erime
çevrimiilelizeedilir.1yılboyuncaPrPSctespitedilenhüc‐
relervehayvanlar“westernblot”ilekontroledilir.Yapı‐
langözlemlerdensonraLD50dozu,lizatenjekteedilen
hayvanlarınhayattakalmaeğrisindeneldeedilir(17).
6.HistoBlot:Buyöntemileanatomikdokukorunarak,
dokulardakiduyarlıproteinlerbelirlenir.Buyönteminbir
dezavantajı,fikseedilmemiş materyaleihtiyaçduyulma‐
sıdır.Beyindekiküçükmiktarlardaki,PrPSc’nintanımlan‐
masıiçinkullanışlıbirmetottur.Taze,fikseedilmemiş
beyindokuları,nitroselülozmembranüzerindekurutulur
vePrPC‘ielimineetmekiçinproteinazKilemuameleedi‐
lir.GuanidinhidrokloridileproteinazdirençliPrPSc
denatüreedilirveimmunhistokimyasalyöntemle,PrPSc
belirlenir(21,22).
7.CellBlot:Lamelüzerindegelişenhücrelerin,nitro‐
selülozmembranatransferedilerek,proteinazKdirençli
PrP’lerin,“westernblot”ilebelirlenmesinikapsayanbir
yöntemdir(17).Çoklubağımsızhücrekültürlerindekipri‐
onenfeksiyonlarınınbelirlenmesindevePrPScseviyeleri‐
ninkarşılaştırılmasındaduyarlıvehızlıbiryöntemdir(23).
8.SlotBlot:Buyöntemde,nitroselülozmembrandan
hücrelizatıfiltreedilir,anti‐PrPantikorlarkullanarak,
proteinazKdirençliPrPbelirlenir(17).Slotblotanali‐
zinde,amiloidreaksiyonusırasındabölünenoligomerler
ileortamdaartanoluşumlarınbelirlenmesiiçinspesifik
prionaptameriolanSAF–93kullanılır(24).
9.PetBlot:İnkübasyonsüresininerkenevrelerinde,
PrPScvarlığınınbelirlenebildiğioldukçaduyarlıvespesi‐
fikbiryöntemdir.Deneyselolarakenfekteedilenfarede,
intraserebralinokülasyondan30günsonra,klinikbelirti‐
lerortayaçıkmadan145günöncebeyindekiPrPScvarlığı,
PETblotyöntemiiletespitedilmiştir.Buyöntemde
formalinlefikseedilmiş,parafinbloklardasaklanandoku,
yoğunbiçimdeproteinazKilemuameleedilirvedaha
sonradirektolaraknitroselülozmembranataşınır.
MembrandakiPrPSc,yüksekderecededuyarlıkgösteren,
spesifikantikorlarkullanılarakbelirlenir(21).
10.ProteinMisfoldingSiklikAmplifikasyon(PMCA):
KonseptolarakDNA’nınpolimerzincirreaksiyonuile
amplifikasyonunabenzemektedir(17).PMCAteknolojisi,
invivoPrPScreplikasyonununhızlandırılmış sikluslarını
içerenbirmetotdur.Hersiklus,2aşamadan(inkübasyon
vesonikasyon)oluşmaktadır.İlkaşamadadüşükoranda
PrPScveyüksekorandaPrPCiçerenörnek,PrPScpolimer‐
leriningelişmesiniteşviketmesiiçininkübeedilir.İkinci
aşamadaisepolimerleriyıkmakiçinörneğeultrasonuy‐
gulanarak,konvertörünitelerinsayısıartırılır.Bu2aşama,

Patolojik prion proteininin tespiti
146
hersiklustauygulanarak,eldeedilenPrPScmiktarıartırılır
(25).Siklikamplifikasyondansonraörnekteyenişekillen‐
dirilenproteinlerin,%97’sindenfazlasıPrPScolduğutespit
edilmiştir(26).
Dokulardakivebiyolojiksıvılardakibelirlenemeyen,
prionproteinleriileenfektepresemptomatikhamsterların
kanındakiprionbuyöntemiletespitedilmiştir(17).Ay‐
rıcasütveidrargibiçeşitlisekresyonlardakivehayvanlar
tarafındankontamineedildiğivarsayılantoprakvesudaki
PrPSc,PMCAyöntemiilebelirlenebilmektedir(12).
11.KonformasyonBağlıİmmunassay(CDI):Buyön‐
teminde,PrPSc‘iselektifolarakçökeltmekiçin,doku
homojenatlarısodyumfosfotungstikasitileinkübeedilir.
PrPCvePrPSc’ibirbirindenayırmakiçindenatürasyon,
proteinazKyerineguanidinhidrokloridileyapılmaktadır
(27).Tespitediciantikor,enfekteolmamışformda(PrPC)
herzamangörülenamaenfeksiyozformun(PrPSc)sadece
denatürasyonsırasındagörülen,konformasyonbağımlı
epitopu(antijenmolekülündekikimyasaluçyapılar)be‐
lirlemekiçinkullanılır.Antikorbağlanmamiktarı,
denatürePrPScvedoğalPrPScarasındakisinyalfarklılıkla‐
rınabağlıolarakdeğişir.Sinyalfarklılıkları,dokuhomo‐
jenatlarındakiPrPSc’nintanımlayıcıbirkriteriolarakkul‐
lanılır(6).
12.Genişletilmiş DisosiyasyonLanthanideFloresan
İmmunassay(DELFIA):Buyöntemde,guanidinhidro‐
klorürilePrPScekstraksiyonugerçekleştirilir(17).PrP’i
çözündürmekiçinguanidinhidroklorür,ikifarklı
konsantrasyondauygulanır.SerbestPrP,monoklonalan‐
tikorileyakalanır.MonoklonalantikorvePrPkompleksi,
europiumileişaretlenmiş olanantikorlarilebelirlenir.
Zamanayrımlıfloresanskullanarak,ikifarklıkonsantras‐
yonda(çözünenveçözünmeyen)hazırlananörneğin
kantitasyonuyapılır(28).ÇözünmeyenPrP’nin,totalPrP
konsantrasyonunaoranıbuyöntemiçinbelirleyicibir
kriterdir(17).Buyöntemile10pikogramakadarPrPbe‐
lirlenebilmektedir(28).
13.KapillerJelElektroforez:Floresanişaretlisentetik
PrPpeptidiledokuörneklerindemevcutolanPrP’nin,
antikorabağlanmakiçinyaptıklarımücadeleyibelirle‐
meyedayananbiryaklaşımdır.Serbestpeptidveantikor
peptidpikleri,kapillerelektroforezilebirbirlerindenayırt
edilmektedir(17).Ultrasantrifügasyonyöntemleriilebe‐
yindenekstrakteedilenprionproteini,sodyumlauroyl
sarkozinveproteinazKilemuameleedilir.Sonsantrifüj‐
densonraeldeedilenpelet,süspanseedilerek,sodyum
dodesilsülfatve2‐merkaptoetanolilemuameleedilirve
kaynatılırarak,elektroforezişleminetabitutulur.Schmerr
veark.yaptıklarıçalışmadabuyöntemin,scrapieteşhisi
için“westernblot”yönteminegöreyaklaşık100katdaha
azörnekmiktarınaihtiyaçduyduğunubildirmişlerdir(29).
14.FloresanKorelasyonSpektroskopi(FCS):Solüsyon
içindelazerışınlarıarasındangeçen,floresanişaretlimo‐
lekülleribelirlemeyedayananbirmetottur.Analizsolüs‐
yonu,PrPScagregatlarınakuvvetlibirşekildebağlanan,
flüoroforileişaretlianti‐PrPantikorlarınıiçermektedir.
Anti‐PrPantikoruveyarekombinantPrPileişaretlenmiş
PrPSc,rölatiffloresanyoğunluğunagöretespitedilir(17,
18).Anti‐PrPantikorlarıbağlananPrPSc,monomerik
PrPC’ninarkaplanındakolaycagörülebilmektedir.Bu
metodun,“westernblot”metodundanyaklaşık20kat
dahaduyarlıolduğubildirilmiştir.CJDhastalarının
%20’sininserebrospinalsıvısındailkkezbuyöntemile
PrPSctespitedilmiştir(18).
15.MultispektralUltraviyoleFloresanSpektroskopi
(MUFS):Buyöntemdeproteinler,ultraviyoleradyasyon
ileuyarılarak,spesifikfloresanemisyontarzlarınagöre
belirlenirler.Buşekildehücreselprionproteinini,patolojik
prionproteinindenvefarklıPrPScformlarındanayırmak
mümkünolmaktadır(18).
16.Aptamer:Aptamer,spesifikbiçimdehedefproteine
bağlananDNAveyaRNAmolekülleridir(17).PrPC
ve/veyaPrPSc’ninde,kimyasalolaraksentezlenen,stabi‐
lizevemobilizeedilenspesifiknükleikasitaptamerlerinin
olduğubildirilmiştir(30).Weissveark.(1997)yaptıkları
çalışmada,GkuartetmotiflerinesahipRNAaptamer‐
lerinin,PrP’ninaminoucunabağlandığınıtespitetmiş‐
lerdir(31).İnvitroprionanalizlerinde,PrPSc’ninspesifik
bağlanmaaptamerinin,PrP’ninproteinazdirençliform‐
larınınbirarayagelmesiniengellediğibelirlenmiştir(17).
Butespitedayanarak,RNA,DNAvepeptidaptamerle‐
rinin,prionhastalıklarınıntanısındavetedavisindeyararlı
olabileceğidüşünülmektedir(30).
17.FourierTransformİnfrared(FT‐IR)Spektroskopi:

Patolojik prion proteininin tespiti
147
Kanvenöronoldokudakipatolojikprionproteinin,belir‐
lenmesiiçinumutverenbirbiyofizikselyöntemdir(32).
Buyöntem,infraredspektrumundakiçokdeğişkenliana‐
lizlerinbirleşmişolduğutanımlayıcıbirmetottur(17).FT‐
IRileprionproteinlerininüçboyutluyapısıbelirlenmek‐
tedir.Panveark.buyöntemleyaptıklarıçalışmada,
PrPC’nin,%42’sininαheliks,%3’ününβ‐sheetformunda
ikenPrPSc’nin%30’ununαheliks,%43’ününβ‐sheetfor‐
mundaolduğunutespitetmişlerdir(37).Gassetveark.
PrPSc’nin,proteinazdirençliçekirdeğiolanPrP27‐30’un,
%54’ününβ‐sheet,%25’ininαheliksyapısındaolduğunu
bildirmişlerdir(38).FT‐IRilePrPScvePrP27‐30karak‐
terizasyonununyapılabilmesi,antikorlardanbağımsız
olarak,memelitürüvespesifikTSEkısıtlamalarıolmadan,
molekülersuş tiplemesininbuyönteminleyapılmasına
imkanvermektedir(32).
18.“FlowMicrobeadImmunoassay”(FMI):Mikro‐
boncuklarakovalentolarakbağlanmışanti‐PrPantikorla‐
rınınkullanıldığıbirmetottur(17).Mikro‐boncuklarile
bloklananörneklerin,floresanyoğunluğu,“flow
cytometer”ilebelirlenir.Floresanyoğunluğu,PrPSckon‐
santrasyonuiledoğruorantılıolarakartışgösterir(33).Bu
metotilesığıretindeki7pmol/7nmolvekemikunun‐
daki%0,3’dendahayüksekkonsantrasyondakirekombi‐
nantPrP/PrPScbelirlenebilmektedir(17).
19.Biomarkerlar:PrPSc,TSE’ninpost‐mortemtanısı
içinuygunbirişarettir.Çünküenfekteinsanlarınvehay‐
vanlarınSantralSinirSistemlerinde(SSS)yüksekkonsant‐
rasyonda,PrPScbulunmaktadır.Bununlabirlikte,PrPSc
prekliniktanıdasınırlıolarakkullanılabilmektedir.Çünkü
PrPSc,SSSdışında,özelliklevücutsıvılarında(kan,idrar
gibi),oldukçadüşükkonsantrasyondabulunmaktadır.
Prionileenfekteinsanlarınvehayvanlarınidrarlarında,
proteinazdirençliPrPkökenlimoleküllerbelirlenmiştir.
Fakatgüvenilirrutinbirtesthenüzgeliştirilememiştir(6).
FarklıRNAgörüntülemeteknolojilerikullanılarak,
yenibirtranskriptineritroidfarklılaşmafaktörünükodla‐
dığı(EDRF)vebufaktörekspresyonununscrapieile
enfektefarede,hastalığıngelişimisırasındaaşamalıolarak
azaldığıbelirlenmiştir.BSEileenfektebüyükbaşserumla‐
rındabelirlenennükleikasitlerin,hastalığıngelişimiile
beraberortayaçıktığıileilgilibenzeryaklaşımlarbulun‐
maktadır(6).
20.Elektrokardiyografi(EKG):TSE’lerintanısındaki
diğerbirinvazifolmayantest,yüksekçözünürlükteki
elektrokardiyografidir.EKGileenfeksiyonunerkensaf‐
halarındakalphızındabelirgindeğişimlerinolupolma‐
dığıaraştırılmıştır.EKG,deneyselolarakBSEajanıile
enfekteedilen150sığırdadenenmişve8aysonraölen2
hayvandaSolunumSinüsAritmi(SSA)seviyelerininart‐
masınabağlıolarak,hastalıktespitedilmiştir(6).
21.Elektroensefalogram(EEG):EEGuygulamasıya‐
pılanCJDhastalarının%75‐85’inde,hastalığınileriaşa‐
malarındatipiktanısalbulgulareldeedilmiştir.Tipik
EEGbulgusuperiyodik,bifazikveyatrifazik,senkronize
keskindalgakompleksleridir(11).Hastalığınerkenevre‐
sinde,EEGileyaygındüzensiztetavedeltadalgalarıile
birliktebilateralalfavearalıklıyüksekamplitüdlüritmik
deltaaktivitesinintespitedilebileceğibildirilmiştir(10).
22.ManyetikRezonansGörüntüleme(MRI):CJDtanı‐
sında,difüzyonağırlıklıMRIgörüntülemeninenduyarlı
teknikolduğudüşünülmektedir.T2ağırlıklıMRIilebazal
ganglionanormallikleribelirlenebilmektedir.vCJD’li
hastalarda,MRIiletalamusunpulvinarçekirdeğinde,
bilateralsinyalartışıtesptitedilmiştir.Bubulgu,vCJDiçin
%78oranındaduyarlıve%100oranındaözgülbirbulgu
olarakdeğerlendirilmektedir(34).
SONUÇ
Mevcuttanıyöntemleri,PrPCvePrPScproteinleriara‐
sındakifizikokimyasalfarklılıklaradayanmaktadır.Tanı
yöntemleriarasındakitemelfaklılık,saptamaseviyelerin‐
denkaynaklanmaktadır.,Hastalığınprekliniksafhasında
PrPScbirikiminindüşükbirkinetiğesahipolması,tanı
yöntemlerinininkübasyonperiyodununerkensafhala‐
rındakullanılmasınısınırlandırmaktadır.Bukısıltlamalar
dikkatealınarak,yenidiagnostiktekniklerde,PrPSc’nin
tanımlanmasıiçinvücutsıvılarındakiduyarlılığınve
spesifiteninartırılmasıvePrPScvarlığınıtemsiledenyeni
göstergelerinbelirlenmesihedeflenmektedir(6).
KAYNAKLAR
1. Ji HF, Zhang HY. Beta-sheet constitution of prion pro-
teins. Trends Biochem Sci 2010; 35: 129-134.
2. Edgeworth JA, Farmer M, Sicilia A, et al. Detection of
prion infection in variant Creutzfeldt-Jakob disease: a

Patolojik prion proteininin tespiti
148
blood-based assay. Lancet 2011; 377: 487-493.
3. Velayos JL, Irujo A, Cuadrado-Tejedor M, Paternain
B, Moleres FJ, Ferrer V. Cellular prion protein in the
central nervous system of mammals. Anatomoclinical as-
sociations. Neurologia 2010; 25: 228-233.
4. Mastrianni JA. Prion diseases. Clin Neurosci Res 2004; 3:
469-480.
5. Van der Kamp MW, Daggett V. Pathogenic mutations in
the hydrophobic core of the human prion protein can
promote structural instability and misfolding. J Mol Biol
2010; 404: 732-748.
6. Kübler E, Oesch B, Raeber AJ. Diagnosis of prion dise-
ases. Br Med Bull 2003; 66: 267-279.
7. Gavier-Widén D, Stack MJ, Baron T, Balachandran A,
Simmons M. Diagnosis of transmissible spongiform en-
cephalopathies in animals: a review. J Vet Diagn Invest
2005; 17: 509-527.
8. Prusiner SB. Prions. Proc Natl Acad Sci 1998; 95: 13363-
13383.
9. Pocchiari M, Poleggi A, Principe S, Graziano S, Cardone
F. Genomic and post-genomic analyses of human prion
diseases. Genome Med 2009; 1: 63.
10. Zerr I. Clinical and therapeutic aspects of prion disease.
Handb Clin Neurol 2008; 89: 737-764.
11. Belay ED. Transmissible Spongiform Encephalopathies
In Humans. Annu Rev Microbiol. 1999; 53: 283-314.
12. Cook RW, Richards RB, Middleton DJ. Transmissible
Spongiform Encephalopathies. Australian and New
Zealand Standard Diagnostic Procedure 2010; 16.
13. Belay ED, Schonberger LB. The Public Health Impact
of Prion Diseases. Annu Rev Public Health 2005; 26:
191–212.
14. Kalikiri PC, Sachan RG. Prions- Proteinaceous Infec-
tious Particles, JIACM 2003; 4: 334-336.
15. McKintosh E, Tabrizi SJ, Collinge J. Prion diseases. J.
Neurovirol 2003; 9: 183–193.
16. Wadsworth JDF, Collinge J. Update on human prion
disease. Biochimica et Biophysica Acta 2007; 1772: 598–
609.
17. Sakudo A, Nakamura I, Ikuta K, Onodera T. Recent
developments in prion disease research: diagnostic tools
and in vitro cell culture models. J Vet Med Sci 2007; 69:
329-337.
18. Ingrosso L, Vetrugno V, Cardone F, Pocchiari M.
Molecular diagnostics of transmissible spongiform en-
cephalopathies. Trends Mol Med 2002; 8: 273-280.
19. Dong CF, Huang YX, An R, et al. Sensitive Detection of
PrP (Sc) by Western Blot Assay Based on Streptomycin
Sulphate Precipitation. Zoonoses Public Health, 2007;
54: 328-336.
20. Kretzschmar HA, Ironside JW, DeArmond SJ, Tateishi
J. Diagnostic criteria for sporadic Creutzfeldt-Jakob dise-
ase. Arch Neurol 1996; 53: 913-920.
21. Schulz-Schaeffer WJ, Tschöke S, Kranefuss N, et al. The
paraffin-embedded tissue blot detects PrPSc early in the
incubation time in prion diseases. Am J Pathol 2000;
156: 51-56.
22. Taraboulos A, Jendroska K, Serban D, Yang S-L, DeAr-
mond SJ, Prusiner SB. Regional mapping of prion pro-
teins in brain. Proc Natl Acad Sci 1992; 89: 7620-7624.
23. Bosque PJ, Prusiner SB. Cultured cell sublines highly
susceptible to prion infection. J Virol 2000; 74: 4377-
4386.
24. Tahiri-Alaoui A, Sim VL, Caughey B, James W. Molecu-
lar heterosis of prion protein beta-oligomers. A potential
mechanism of human resistance to disease. J Biol Chem
2006; 281: 34171–34178.
25. Soto C, Saborio GP, Anderes L. Cyclic amplification of
protein misfolding: application to prion-related disorders
and beyond. Trends Neurosci 2002; 25: 390-394.
26. Saborio GP, Permanne B, Soto C. Sensitive detection of
pathological prion protein by cyclic amplification of pro-
teinmisfolding. Nature 2001; 411: 810-813.
27. McCutcheon S, Hunter N, Houston F. Use of a new
immunoassay to measure PrP Sc levels in scrapie-in-
fected sheep brains reveals PrP genotype-specific differ-
ences. J Immunol Methods 2005; 298: 119-128.
28. Dabaghian RH, Barnard G, McConnell I, Clewley JP. An
immunoassay for the pathological form of the prion pro-
tein based on denaturation and time resolved fluorome-
try. J Virol Methods 2006; 132: 85-91.
29. Schmerr MJ, Jenny A, Cutlip RC. Use of capillary so-
dium dodecyl sulfate gel electrophoresis to detect the
prion protein extracted from scrapie-infected sheep. J
Chrom B Biomed Sci Appl 1997; 697: 223-229.
30. Gilch S, Schätzl HM. Aptamers against prion proteins

Patolojik prion proteininin tespiti
149
and prions. Cell Mol Life Sci 2009; 66: 2445-2455.
31. Weiss S, Proske D, Neumann M, et al. RNA Aptamers
Specifically Interact with the Prion Protein PrP. J Virol
1997; 71: 8790–8797.
32. Beekes M, Lasch P, Naumann D. Analyti-
cal applications of Fourier transform-infrared (FT IR)
spectroscopy in microbiology and prion research. Vet
Microbiol 2007; 123: 305-319.
33. Murayama Y, Yoshioka M, Horii H, Takata M, Miura
K, Shinagawa M. Specific detection of prion antigenic
determinants retained in bovine meat and bone meal by
flow microbead immunoassay. J Appl Microbiol
2006; 101: 369-376.
34. Kallenberg K, Schulz-Schaeffer WJ, Jastrow U, et al.
Creutzfeldt-Jakob disease: Comparative Analysis of MR
Imaging Sequences. ANJR Am J Neuroradiol 2006; 27:
1459-1462.
35. Duffy P, Wolf J, Collins G, DeVoe AG, Streeten B,
Cowen D. Possible person-to-person transmission of
Creutzfeldt-Jakob disease. N Engl J Med 1974; 290: 692-
693.
36. Collinge J, Sidle KC, Meads J, Ironside J, Hill AF.
Molecular analysis of prion strain variation and the
aetiology of ‘new variant’ CJD. Nature 1996; 383: 685-
690.
37. Pan KM, Baldwin M, Nguyen J, Gasset M, Serban A,
Groth D, Mehlhorn I, Huang Z, Fletterick RJ, Cohen
FE, Prusiner SB. Conversion of -helices into ß-sheets
features in the formation of the scrapie prion proteins.
Proc Natl Acad Sci USA 1993; 90: 10962-10966.
38. Gasset M, Baldwin MA, Fletterick RJ, Prusiner SB.
Perturbation of the secondary structure of the scrapie
prion protein under conditions that alter infectivity.
Proc Natl Acad Sci USA 1993; 90: 1-5.