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Bioanálisis en la ciencia de las malezas: conceptos importantes y experiencia práctica

Authors:
  • Research and Development in Tropical Agriculture / Investigación y Desarrollo en Agricultura Tropical

Abstract

En este capítulo introductorio se presentan conceptos fundamentales acerca del empleo de bioanálisis y describe en detalle el cómo realizarlos para determinar la respuesta a herbicidas solos o en interacción con otros productos utilizando plantas enteras. En lo posible, procuro incluir elementos prácticos, muchos de mi propia experiencia, de la realización de bioanálisis para quienes tengan interés o necesidad de realizarlos y no cuenten con información recopilada al respecto. In this chapter presents basic concepts related to the herbicide bioassay and describes how to conduct them to determine the dose response of whole plants to herbicides alone or in interaction with other agrochemicals. As much as possible, practical aspects and personal experience are included to those that are interested or required to run bioassays and do not have compiled information available. AVAILABLE ONLY IN SPANISH.
Editado por:
SoeiedadVenezolanapara el Combate de Malezas (SOVECOM)
Compilado por:
Alvaro Anzalone
Universidad Centroeeidental "Lisandro Alvarado"
Deeanato de Agronomia
Aida Ortiz
Universidad Central de Venezuela
Faeultad deAgronomia
El finaneiamiento de estaobra se hizoa traves del aporterealizado por la empresaAGROISLENA Sueesora de
Enrique FragaAfonso c.A. en el mareo de la Ley Organiea de Ciencia, Teenologiae Innovaeion alproyeeto
denominado "Curso de actualizacion enmetodologiaspara la investigaciony el desarrollo tecnologicoen la
ciencia de las malezas y XlII Congreso de la Sociedad Venezolana para el Combate de Malezas
(SOVECOM)", el eual se eneuentraregistradoen el Departamentode GestionTecnologicay Propiedad
Intelectual del Consejo de Desarrollo Cientifieo, Humanistieo y Teenologico de la Universidad
Centroceidental"LisandroAlvarado".
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.Todo p.r. elAgr/cultor!
.. RIF:J-00000643-1
Las opiniones emitidas en 105 articulos publicados en esta edicion de
EI Malezologo son responsabilidad de cada autor
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Bioanálisis en la ciencia de las malezas:
Conceptos importantes y experiencia práctica
Bernal E. Valverde
Investigación y Desarrollo en Agricultura Tropical, S. A. (IDEA Tropical), Costa Rica
Faculty of Life Sciences, The University of Copenhagen, Denmark
E-mail: ideatrop@ice.co.cr y bev@plen.ku.dk
Los herbicidas por su naturaleza biológica se seleccionan buscando una alta eficacia para eliminar
las malezas y el mayor grado posible de selectividad para los cultivos. Varios compuestos químicos
que carecen de selectividad también se han desarrollado y comercializado, incluido el glifosato que
es el herbicida más vendido en el mundo. Tradicionalmente, las compañías productoras de
agroquímicos han basado sus programas de escrutinio de herbicidas en la realización de bioanálisis
con plantas enteras bajo condiciones controladas aunque la tendencia en la actualidad es la de
trabajar con otros sistemas que permiten un escrutinio más rápido, automatizado y en gran escala.
Los bioanálisis iniciales con plantas enteras se realizan utilizando una o dos dosis elevadas
aplicadas sobre varias especies de monocotiledóneas y dicotiledóneas, incluidos varios cultivos.
Para lograr seleccionar un herbicida con potencial comercial, se requiere probar miles de
compuestos químicos con costos sumamente elevados. En la actualidad, se estima que para llevar
un nuevo herbicida al mercado, se debe realizar el escrutinio de unas 100 000 sustancias con una
erogación de 200 millones de dólares. A pesar de todo este esfuerzo, el último modo de acción
descubierto que permitió la comercialización de herbicidas novedosos se introdujo en 1991 con los
inhibidores de la hydroxifenil piruvato dioxigenasa (HPPD) entre los que se encuentran la
sulcotriona y mesotriona (Ruegg et al. 2007). La inhibición de la enzima HPPD provoca la pérdida
de pigmentos protectores lo que resulta en el blanqueamiento de los tejidos foliares jóvenes y en
daño severo por exposición a la luz. En la búsqueda de nuevos herbicidas y modos de acción y
gracias a los avances tecnológicos que permiten la prueba de muchos compuestos a la vez, se
recurre a bioanálisis más elaborados, que requieren menor cantidad de producto para realizarlos y
que se completan en muy poco tiempo con la ayuda de procesos automatizados.
En el uso práctico de los herbicidas, los bioanálisis también tienen mucha importancia y se emplean
con regularidad en investigación y diagnóstico. En años recientes, los bioanálisis se convirtieron en
una herramienta determinante para corroborar casos de resistencia a herbicidas.
En este capítulo introductorio se presentan conceptos fundamentales acerca del empleo de
bioanálisis y describe en detalle el cómo realizarlos para determinar la respuesta a herbicidas solos o
en interacción con otros productos utilizando plantas enteras. En lo posible, procuro incluir
elementos prácticos, muchos de mi propia experiencia, de la realización de bioanálisis para quienes
tengan interés o necesidad de realizarlos y no cuenten con información recopilada al respecto.
Capítulo 4
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Utilidad de los bioanálisis
Los bioanálisis tienen muchos usos como herramienta de investigación y de diagnóstico. Un
bioanálisis puede consistir en algo tan sencillo como determinar a nivel práctico y en el campo, si
un herbicida persistente ya ha perdido su actividad en el suelo para permitir la siembra del cultivo.
Esta es una práctica común cuando se emplean herbicidas persistentes para controlar arroz maleza
en arroz. Transcurrido un tiempo prudencial, se marcan pequeñas áreas en el campo y se distribuye
semilla del cultivo para observar si las plántulas que emergen presentan algún síntoma de toxicidad.
Esta operación se repite hasta que las plántulas muestran desarrollo normal garantizando que puede
procederse con la siembra comercial del cultivo. Un enfoque similar puede emplearse con fines
experimentales para determinar la persistencia de herbicidas y la sensibilidad relativa de posibles
cultivos de rotación (Smith et al. 2005). En este caso, el bioanálisis de campo brinda información
práctica rápida y confiable que ayuda en la toma de decisiones, especialmente cuando no se tiene
los recursos económicos o técnicos para un análisis de laboratorio o cuando no hay un método de
laboratorio validado para cuantificar los residuos y un procedimiento que permita relacionarlo con
la fitotoxicidad.
Entre los usos importantes de los bioanálisis se incluyen la determinación de residuos
biológicamente activos en suelos y aguas usando la curva de dosis-respuesta como estándar de
referencia, la verificación de que un herbicida es causante de un daño al cultivo u otra planta de
interés mediante la reproducción de los síntomas a través de la aplicación controlada del herbicida,
la caracterización de la selectividad de los herbicidas y el diagnóstico de la resistencia a herbicidas.
Además, los bioanálisis son muy útiles para estudiar la interacción entre herbicidas (sinergismo,
antagonismo), la interacción entre herbicidas y otros compuestos (otros plaguicidas, coadyuvantes,
y antídotos o “safeners”) y la eficacia de distintas formulaciones de un mismo compuesto. Sirven
también para determinar la posible presencia de sustancias aleloquímicas y son fundamentales para
identificar sustancias biológicamente activas a través del aislamiento de componentes activos
dirigido por bioanálisis. También pueden ayudar a la identificación del modo de acción de una
sustancia. El estudio de las respuestas a un compuesto novedoso mediante bioanálisis con plantas
enteras puede brindar indicios de los procesos fisiológicos que afecta y ayudar a descubrir nuevos
modos de acción. Este enfoque es muy útil en especial con sustancias de origen natural (Dayan et
al. 2000). Los bioanálisis tienen la ventaja de ser cuantitativos y de registrar realmente la actividad
biológica de las sustancias.
De acuerdo con los objetivos que se persigan, se puede utilizar diversos organismos como
indicadores del efecto de sustancias químicas mediante bioanálisis, incluidos invertebrados, algas, y
plantas superiores. Por ejemplo, las algas se han utilizado como complemento al análisis químico
para determinar el efecto de sustancias tóxicas sobre cuerpos de agua como resultado de la
escorrentía proveniente de áreas agrícolas (Okamura et al. 2002). Daphnia magna es un crustáceo
de amplio uso en bioanálisis ecotoxicológicos.
En este trabajo se enfatiza los procedimientos prácticos a considerar en la conducción de bioanálisis
con plantas enteras, los cuales son también aplicables a pruebas realizadas con otros organismos.
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Pruebas con plantas enteras
Los bioanálisis más frecuentes que se realizan a nivel práctico, fuera de los necesarios para el
desarrollo por parte de las compañías de agroquímicos, son los que estudian el efecto de un
herbicida sobre alguna especie vegetal con fines de diagnóstico (por ejemplo para tratar de
reproducir daños por efecto de residuos del herbicida en el suelo o por deriva), para comparar la
respuesta diferencial entre especies (selectividad) o entre poblaciones de una misma especie
(resistencia), o para dilucidar interacciones de herbicidas entre sí o con otros compuestos. La
mayoría de ellos se realizan con plantas enteras y, aunque en general no se requiere de equipo
especializado para llevarlos a cabo, si es importante considerar muchos factores que determinan su
éxito. La mayor parte de este trabajo se dedica a tratar los elementos más relevantes en la
conducción de bioanálisis con plantas enteras.
Selección del material vegetal
Para lograr los resultados propuestos en un bioanálisis es imperativo contar con material
experimental adecuado y en cantidad suficiente. En la mayoría de los casos en que se trabaja con
plantas enteras, las pruebas se realizan utilizando plantas producidas en condiciones controladas,
por lo común, originadas de semilla. En algunos casos también se recurre a material vegetativo
como fuente de las plantas a tratar con los herbicidas.
Semilla para los bioanálisis. La calidad y representatividad de la semilla a emplear en los
bioanálisis es clave para el éxito de la prueba. La semilla debe de recolectarse o producirse
teniendo en mente los objetivos del bioanálisis. Por ejemplo, si lo que se desea es realizar un
diagnóstico de la posible resistencia de una maleza, la semilla debe de recolectarse en el campo
siguiendo un patrón que asegure que representa la condición del lote donde se sospecha se tiene una
población resistente. Lo más probable es que al realizarse la recolección, la semilla obtenida
provenga de las plantas que efectivamente son resistentes y que lograron sobrevivir a la aplicación
del herbicida en el campo, así como de otras que por distintas circunstancias evadieron al herbicida.
Esta condición de semilla mezclada proveniente de individuos resistentes y susceptibles refleja, a
pesar de los posibles problemas de evaluación en el invernadero y de interpretación de los
resultados, la composición de la población en el campo. Si lo que se desea es realizar estudios más
elaborados, por ejemplo, la determinación del posible mecanismo de resistencia, puede requerirse la
producción de semilla por varias generaciones específicamente para este fin, mediante la selección
de plantas que sobreviven a dosis altas del herbicida (o intermedias, según el objetivo del
experimento y el posible mecanismo de resistencia) después de un bioanálisis preliminar. En
cualquier caso, se ahorrará mucho tiempo en la conducción de los experimentos si se cuenta con
semilla de calidad, con alto porcentaje de germinación y que produzca plántulas uniformes y
vigorosas. En varias publicaciones se dan recomendaciones o se describen procedimientos útiles
sobre la recolección, etiquetado y almacenamiento de la semilla de malezas para el diagnóstico de la
resistencia (Bourgeois & Morrison 1997; Moss 1999; Paterson et al. 2002; Valverde et al. 2000).
En algunos casos es necesario obtener semilla de malezas de otras fuentes para realizar las pruebas
comparativas. Una posibilidad es obtener semilla de poblaciones previamente caracterizadas por
otros investigadores en cuyo caso es importante seguir los procedimientos legales adecuados para
obtenerlas. Además de los certificados sanitarios y requisitos impuestos por las autoridades locales,
es posible que se deba de firmar un Acuerdo de Transferencia de Materiales en el que se especifique
las condiciones para la entrega la semilla y los usos para los cuales puede destinarse. También es
posible comprar semilla de malezas de empresas comerciales, como por ejemplo HerbiSeed del
Reino Unido (www.herbiseed.com) y Azlin Seed Service (Leland, MS – EE.UU).
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En algunas especies predomina la reproducción vegetativa y se requiere establecer las poblaciones a
tratar en el bioanálisis mediante la siembra de rizomas, culmos o tallos enraizados, u otros órganos.
En estos casos, el enraizamiento y brotación pueden ser disparejos por lo que es mejor hacer brotar
o crecer el material en bandejas por separado para luego transplantar a las macetas definitivas. La
reproducción de hijos en gramíneas puede ser provechosa para tratar “la misma” planta con
herbicidas diferentes. Si, por ejemplo, se sospecha de resistencia múltiple a herbicidas en una
población se puede tomar una planta en el campo, separarle sus hijos y sembrarlos por separado
para luego tratarlos con diferentes herbicidas para determinar la respuesta de la misma planta a
varios productos aplicados de manera independiente. De la misma forma, plantas que crecen en el
invernadero, por ejemplo las que sobreviven a dosis elevadas, pueden subdividirse en sus
respectivos hijos y sembrarse por aparte para tratamientos adicionales o incrementar la recolección
de semilla.
Preparación del material vegetal. La mayoría de los bioanálisis convencionales se hacen con
plantas enteras en macetas. También se pueden hacer con plántulas recién emergidas en cajas de
petri o en medio de cultivo sólido o líquido. Para la conducción de los bioanálisis es imperativo
contar con suficientes plantas en el estado de crecimiento adecuado y con la mayor uniformidad
posible. Desafortunadamente, producto de su variabilidad intrínseca, las semillas de las malezas no
germinan de manera uniforme, en muchos casos producto de su latencia diferencial o del efecto de
las condiciones de crecimiento de la plantas madre. Dependiendo de la especie, es muy probable
que se requiera dar a la semilla algún tratamiento para romper la latencia. Lo más recomendable es
buscar literatura pertinente y hacer una prueba de germinación antes de iniciar los bioanálisis. El
tiempo que de se demora realizando estas pruebas se recupera con creces en la realización de los
estudios que realmente son críticos. Una fuente primaria de información sobre cómo hacer
germinar las semillas de las malezas es la “Guía de Andersen” (Buhler & Hoffman 1999).
De acuerdo con mi experiencia de muchos años de realizar bioanálisis en invernadero con plantas
enteras prefiero germinar la semilla en condiciones controladas y transplantar las plántulas recién
emergidas a las macetas definitivas. Esta práctica me ofrece muchas ventajas, entre las que se
puede citar:
Ahorro en la cantidad de semilla utilizada para la conducción de un bioanálisis
Obtención de plántulas requeridas en un espacio limitado
Selección de plántulas uniformes que pueden transplantarse de manera simultánea para
lograr mayor uniformidad de crecimiento
Garantía de que sólo se incorpora al suelo semilla germinada. Esto es muy importante por
cuanto si se siembra la semilla directamente en la maceta definitiva, la que no germine no
puede eliminarse del suelo o medio de crecimiento con total certeza antes de desecharlo. Si
trabajamos con especies perniciosas, esto nos da la tranquilidad de no estarlas diseminando a
sitios no deseados.
La germinación, en la mayoría de los casos, la realizo en cajas de petri con papel de filtro o de
germinación. De rutina, siempre humedezco el papel con una solución de nitrato de potasio al 0.2%
(p/v) para mejorar la germinación y dejo la semilla embeberse así por 24 horas. Luego procedo a
lavarla con agua del tubo utilizando una piseta y la mantengo en los platos con humedad suficiente
hasta que germine. Las cajas de petri pueden cerrarse con “parafilm” para evitar la desecación.
Algunas especies tienen un crecimiento inicial muy lento en condiciones controladas. Si se siembra
todo el material en las macetas definitivas ocupará espacio por mucho tiempo. En estos casos,
puede transplantarse las plántulas en bandejas y luego hacer un segundo transplante a las macetas
definitivas. Estas plantas de lento crecimiento, por ejemplo Paspalum paniculatum también tienden
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a crecer muy desuniformes por lo que el segundo transplante se puede aprovechar para escoger el
material definitivo o agrupar por tamaño las plantas en las macetas para luego seleccionarlas por
bloques.
Llegado el momento de la aplicación, se procede a preparar las macetas para el tratamiento. Debe
escogerse el material más uniforme. Muchos bioanálisis se realizan empleando un arreglo
irrestrictamente al azar por lo que la uniformidad del material es muy importante. También es de
todos sabido que dependiendo del estado de crecimiento las plantas pueden variar en su respuesta al
herbicida. Me sorprendería mucho que al momento de preparar el material para tratarlo, todas las
plantas sean uniformes. Por el contrario, prácticamente en todos los casos, resulta necesario hacer
algún tipo de clasificación (por altura, si todas las plantas tienen el mismo estado de crecimiento, o
por estado de crecimiento propiamente dicho). Aún cuando el análisis de los datos se haga por
regresión, esta clasificación en bloques es muy deseable, sobre todo para la evaluación visual y para
poder valorar si los tratamientos testigo se comportaron de acuerdo con lo previsto. Recordemos
que el efecto de los herbicidas lo medimos en relación con el comportamiento de plantas sin tratar.
Si los testigos no crecen de la manera adecuada podemos perder por completo el bioanálisis o sacar
conclusiones erradas.
Es importante tener un procedimiento sistemático de etiquetado, sobre todo cuando se realizan
bioanálisis de forma rutinaria. Cada investigador puede diseñar su propio esquema de etiquetado.
En mi caso particular, empleo tres dígitos para identificar el material vegetal: (biotipo o población),
repetición y dosis. Por ejemplo, una maceta cuyo código es 314 corresponde al tercer biotipo,
primera repetición y la cuarta dosis. Cuando los bioanálisis requieren mucho material, recurro a
etiquetar con paletas plásticas de diferente color (por ejemplo, uso colores diferentes para herbicidas
distintos, manteniendo la numeración anterior).
Selección del ámbito de dosis
Selección del ámbito de dosis adecuado. La respuesta típica de las plantas a dosis crecientes de
herbicidas tiene forma sigmoidea (Figura 1) de modo que para lograr un ajuste adecuado del modelo
es importante seleccionar un ámbito de dosis apropiado.
Figura 1. Relación de la respuesta de las plantas al incremento de la dosis de herbicida (en
escala logarítmica). Cuatro parámetros definen la curva: D es el nivel superior, C es el nivel
inferior, b es la pendiente y ED50 es la dosis que inhibe la variable de respuesta medida en un
50% (ver sección sobre Análisis de los datos y presentación de los resultados para mayores
detalles).
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Antes de realizar los bioanálisis detallados es conveniente hacer una prueba preliminar. Puede
aprovecharse las pruebas de germinación de semilla para obtener plantas suficientes para el
experimento preliminar en el que sólo se consideran unas pocas dosis (dos o tres) no mayores de la
comercial. Si se observa respuesta diferencial entre las poblaciones tratadas, se puede hacer el
ajuste correspondiente en el ámbito de dosis definitivo. Uno de los errores más frecuentes en la
conducción de bioanálisis de respuesta a dosis crecientes en las que se compara especies o biotipos
con respuesta diferencial a herbicidas es la escogencia de ámbitos de dosis inadecuados. Por
sencillez, en el diagnóstico de la resistencia, muchas veces se una ámbitos comunes para las plantas
resistentes y susceptibles. Las consecuencias son lamentables pues de desaprovecha la oportunidad
de obtener información valiosa y confiable. Como regla general, se debe de tener ámbitos
diferentes para las poblaciones susceptibles y resistentes, de modo que se pueda ajustar los modelos
de regresión y obtener los valores de inhibición media con intervalos de confianza adecuados para
poder calcular índices de resistencia y comparar dichas poblaciones. Las dosis deben seleccionarse
en progresión geométrica, es decir, las dosis aumentan con base en una tasa común. Lo más común
es que las dosis se dupliquen conforme se avanza en la progresión, aunque se puede utilizar otras
tasas incrementales. En la Figura 2 se ilustra la importancia de seleccionar de manera apropiada los
ámbitos de dosis.
Figura 2. Selección de ámbitos de dosis. Curvas de dosis-respuesta provienen de bioanálisis preliminares para
determinar la respuesta a imazapir en biotipos de arroz maleza (Oryza sativa). Ámbitos adecuados para identificar un
biotipo resistente por flujo de genes de variedades de arroz resistentes a imidazolinonas (A) y uno susceptible (B).
Nótese la diferencia en la escala de las dosis. (C) Ámbito inadecuado (por escogencia de dosis muy elevadas) para
identificar un biotipo susceptible. (D) Ámbito inadecuado (por selección de dosis muy bajas) para identificar un biotipo
resistente.
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Para poder ajustar un modelo de dosis-respuesta es necesario incluir al menos cuatro dosis (mínimo
requerido por el modelo). Sin embargo, lo más deseable es incluir seis o más. Yo regularmente
empleo ocho dosis más dos testigos sin tratar (por repetición). El número de repeticiones afecta la
precisión con que se determina los parámetros. Debe de usarse tres o más repeticiones (mi
preferencia es de cuatro a seis). Si el material vegetal es limitante, debe de hacerse un balance entre
el número de dosis y el de repeticiones tratando de optimizar el análisis considerando los grados de
libertad asociados con el modelo estadístico.
Es importante tener presente que la respuesta de las plantas a los herbicidas varía con el estado de
crecimiento, lo cual puede hacer necesario realizar ajustes en los ámbitos de dosis a probar. Pero
también puede darse el caso de que la expresión de mecanismos de resistencia dependa del estado
de crecimiento. Este tipo de variaciones en la respuesta a los herbicidas está documentado en la
literatura, por ejemplo, las plantas de E. colona resistentes a propanil tienen niveles de resistencia
superiores conforme se desarrollan más que no se explican por variaciones en la actividad de la
arilacilamidasa responsable de la resistencia (por metabolismo acelerado del herbicida), lo cual
sugiere que otros mecanismos coadyuvan a la resistencia cuando las plantas están más desarrolladas
(Leah et al. 1995). Un caso más dramático se observó con Conyza canadensis resistente a glifosato
(Dinelli et al. 2006). Cuando las plantas se trataron con glifosato en dosis crecientes en el estado de
dos hojas, no se observó diferencia alguna en la respuesta al herbicida entre las plantas
supuestamente resistentes y las susceptibles. Si los autores se hubieran conformado con estos
resultados habrían concluido que C. canadensis no había evolucionado resistencia al glifosato. Sin
embargo, cuando el glifosato se aplicó a plantas en el estado de roseta, los biotipos resistentes
requirieron tres veces más glifosato que los susceptibles para inhibir su crecimiento en un 50%
(Figura 3).
Aplicación de los tratamientos y conducción del bioanálisis
Equipo de aplicación y su calibración. Si la calibración del equipo es importante en las
aplicaciones comerciales en el campo, con mayor razón es fundamental en la ejecución de los
bioanálisis. Lo ideal es aplicar los tratamientos con un equipo diseñado para este propósito de
modo que se garantice que la presión, el volumen y la velocidad de aplicación sean constantes. En
el mercado puede obtenerse cámaras de aspersión de herbicidas con diferentes niveles de
automatización (Figura 4). Algunas de las compañías que ofrecen este tipo de equipo son Devries
Manufacturing (http://www.devriesmfg.com) y su distribuidor R&D Sprayers
(http://www.co2sprayers.com) y Engineering and Design Associates, Inc. (http://www.eda-inc.net).
También se las puede construir según las especificaciones deseadas. En ausencia de una cámara de
aspersión, la siguiente mejor opción es un equipo de aplicación portátil accionado por CO2 que
garantiza una presión constante. R&D Sprayers tiene varios modelos disponibles. Herbiseed tiene
un modelo construido en fibra de carbono que lo hace muy liviano. Si del todo no se cuenta con
equipo especializado, los tratamientos se pueden aplicar con una bomba de mochila procurando el
mayor control de las variables antes mencionadas (presión, volumen de aplicación y velocidad).
Cualquiera que sea el equipo que se utilice, debe de calibrarse antes de realizar la aplicación.
También es una buena práctica corroborar frecuentemente que la presión no varíe. La calibración
se realiza con agua y la mezcla de herbicida a aplicar contiene el herbicida y los demás
componentes que se estén evaluando. No está de más comprobar que la descarga no varía por
efecto de la densidad del material.
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Figura 3. Supervivencia de biotipos de Conyza canadensis resistentes [AR (), DE ( ), OH ( ), y VA
()] y susceptibles a glifosato [RE (•), WA ( )] tratados con dosis crecientes de glifosato en el estado de
dos hojas (A) y de roseta (B). Las líneas describen las respuestas (de supervivencia) predichas de acuerdo
con un modelo sigmoideo. Los datos corresponden a los promedios ± EE de tres repeticiones en las cuales
se trató 25 plantas de cada biotipo con cada dosis. En los recuadros se indica los valores de ED50 (g ea
ha1) e índice de resistencia (IR, valor de ED50 del biotipo de C. canadensis dividido por el valor de ED50
del biotipo susceptible RE). Tomado y traducido libremente al español de (Dinelli et al. 2006).
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Figura 4. Cámara de aspersión fabricada por Devries Manufacturing.
Preparación de las diluciones. Si se trabaja con productos formulados, es importante asegurarse
que se cuenta con los instrumentos básicos de medición de pesos y volúmenes. Las cantidades de
mezcla que se preparan para la aspersión de los tratamientos son bajas (de 50 a 500 mL) por lo que
las cantidades del herbicida formulado que se adicionan también son bajas (en el orden de
microlitros o microgramos). Si las concentraciones a asperjar son muy bajas puede ser necesario
recurrir a la preparación de soluciones madre. Es de vital importancia verificar muy bien los
cálculos puesto que un error en la preparación de dicha solución afectará todas las dosis aplicadas.
Cuando el herbicida se formula como gránulos dispersables en agua es conveniente trabajar con
soluciones madres. Si el tratamiento requiere la adición de un coadyuvante también es conveniente
hacer una solución madre concentrada puesto que resulta muy difícil medir volúmenes bajos del
coadyuvante en virtud de su viscosidad. Si el herbicida que se va a utilizar es un estándar analítico,
verifique con el proveedor el procedimiento para diluirlo y asegúrese de tener los testigos o
tratamientos en blanco necesarios. Es posible que el herbicida deba disolverse en un solvente
orgánico como la acetona antes de prepararlo en agua para su aspersión.
Aspersión del herbicida y manejo de las plantas recién tratadas. Cuando se aplica un mismo
herbicida en dosis crecientes, lo más conveniente es aplicar las dosis en orden ascendente para
evitar el lavado del equipo después de cada tratamiento. Si los herbicidas a probar tienen diferentes
formulaciones, es preferible aplicar de primero los que se formulan como soluciones acuosas
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concentradas o polvos solubles. Los polvos mojables deben dejarse de último y asegurarse de
verificar frecuentemente de que los filtros de las boquillas estén limpios para garantizar que se
asperja el volumen deseado. Aplicado el herbicida, conceda tiempo suficiente a las plantas para que
la aspersión se seque antes de trasladarlas al sitio definitivo y asegúrese de regarlas de la manera
apropiada para evitar el lavado del producto desde el follaje o la contaminación del follaje de
plantas adyacentes por efecto del salpique del agua de riego que se posa sobre las hojas recién
tratadas.
Es importante asegurarse que las plantas se colocan en condiciones lo más homogéneas posibles.
Preferiblemente, las macetas deben colocarse al azar, sin seguir un patrón definido. En la práctica,
es conveniente dejar una repetición con las macetas ordenadas por dosis creciente de modo que sea
más fácil darle seguimiento al desarrollo de los síntomas. Provea riego a la base de las plantas,
preferiblemente con un sistema de goteo, y evite el riego por aspersión. El lavado del herbicida
desde las hojas puede hacer que el producto entre en contacto con plantas vecinas causándoles
efectos no deseados. Es recomendable no hacer aplicaciones de insecticidas o fungicidas
inmediatamente después de la aplicación de los herbicidas. Espere al menos dos días. De la misma
forma, es mejor no aplicar estos productos antes de tratar las plantas con el herbicida para evitar el
riesgo de que ocurran interacciones entre ellos.
Evaluación de los tratamientos y recolección de los datos
Evaluación de los tratamientos y recolección de los datos. En el momento oportuno se procede a
hacer la evaluación del material y recolectar los datos. ¿Pero cuándo es el momento oportuno? No
es posible definir a priori cuándo realizar la evaluación. Mi recomendación es que observe las
plantas regularmente y tome la decisión conforme evolucione el desarrollo de los síntomas. Uno de
los problemas en la evaluación de los bioanálisis es su naturaleza comparativa en relación con un
testigo sin tratar. Si la evaluación se realiza muy pronto, es posible que las plantas no hayan
desarrollado los síntomas completamente y que se subvalore el efecto del herbicida. Si la
evaluación se demora mucho, las plantas testigos pueden crecer demasiado por lo que el efecto del
herbicida se sobredimensiona. El conocimiento del material experimental y del efecto del herbicida
ayuda mucho a determinar el mejor momento para realizar la evaluación. Los herbicidas que tienen
efecto de contacto, pueden evaluarse pocos días después de su aplicación. Por ejemplo, el efecto
del propanil puede evaluarse entre 5 y 7 días después del tratamiento. Los herbicidas sistémicos son
más lentos en ejercer su acción y requieren que transcurra mayor tiempo antes de que pueda
evaluarse su efecto. Un buen indicador de que se ha llegado al momento de hacer la evaluación es
cuando los tejidos de las plantas tratadas con el herbicida en sus dosis más altas se tornan necróticos
y las plantas mueren. La tardanza en la evaluación, sin embargo, puede dar oportunidad a que
plantas que sufren de un daño moderado se recuperen. Las condiciones ambientales (temperatura y
luminosidad) afectan el tiempo necesario para el desarrollo de síntomas lo que obliga a justes en
cuanto al tiempo de evaluación y cosecha.
Es importante tener una mentalidad abierta y valorar modificaciones en la conducción y evaluación
de los bioanálisis cuando sea necesario, a pesar de que se tenga amplia experiencia y que
supuestamente se conozca el material experimental. Por ejemplo, en un estudio del autor todavía en
ejecución, la evaluación preliminar de la respuesta de poblaciones de P. paniculatum supuestamente
resistentes a glifosato arrojó resultados inconsistentes y resultó muy difícil corroborar la resistencia,
a pesar de que las poblaciones muestreadas no se lograban controlar en el campo con dicho
herbicida. Parte de las dificultades para obtener datos confiables y reproducibles puede achacarse a
la posible falta de uniformidad intrínseca de las plantas al momento de tratarlas a pesar de los
esfuerzos por seleccionar material semejante, mezcla de individuos susceptibles y resistentes en la
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muestra, y al nivel bajo de resistencia al herbicida y lento desarrollo de síntomas producto de un
probable mecanismo de resistencia no asociado con una modificación en el sitio de acción del
herbicida. Las evaluaciones visuales y por peso fresco no mostraron mayor diferencia entre las
poblaciones supuestamente resistentes y las susceptibles de referencia. Sin embardo, una espera
mayor para realizar la evaluación permitió verificar que las plantas resistentes tenían la capacidad
de rebrotar aun cuando en la evaluación visual aparentaran estar completamente muertas (Figura 5).
Figura 5. Evolución de síntomas de toxicidad en un biotipo de Paspalum paniculatum resistente a
glifosato. (A) Síntomas iniciales observados a los 5 días después de la aplicación (DDA) del
herbicida en dosis crecientes (ámbito parcial); (B) Síntomas avanzados a los 35 DDA; (C) Detalle de
síntomas a los 35 DDA en planta tratada con la dosis más elevada (en esta fecha la planta se transfiere
a maceta de mayor tamaño para darle seguimiento); (D) Rebrote de la planta tratada con la dosis más
alta a los 77 DDA; (E) Crecimiento de la planta tratada con la dosis más alta a los 150 DDA.
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Otra decisión que enfrentamos es definir cómo realizar la evaluación. Las compañías de
agroquímicos cuando realizan escrutinios de productos en gran escala usando plantas enteras,
evalúan el efecto de los productos mediante una valoración visual del daño. La evaluación visual
también es muy utilizada en el diagnóstico de la resistencia. Este tipo de evaluación por ser
subjetiva depende de la agudeza visual y experiencia del evaluador. Un evaluador bien entrenado
puede apreciar diferencias y plasmarlas en un set de datos confiables. La escala utilizada más
frecuentemente es la que asigna porcentajes de daño (grado de afectación de los tejidos) en
comparación con el tratamiento testigo, cuyas plantas no han sufrido daño alguno.
Una valoración cuantitativa se obtiene mediante el peso (fresco o seco) de las plantas. Si el material
tratado fue bien seleccionado en cuanto a uniformidad en el estado de crecimiento y condición de
las plantas, los resultados de peso fresco y seco son fundamentalmente equivalentes, con algunas
excepciones. Plantas tratadas con los herbicidas hormonales que tienen un crecimiento anormal por
la obstrucción que dichos herbicidas causan al sistema vascular y las deformaciones que producen
en los tejidos pueden acumular mucha agua y peso fresco a pesar de estar severamente afectadas en
su crecimiento y desarrollo. En este caso particular, la evaluación visual puede ser incluso más
informativa que la de peso fresco. El peso fresco puede ser más válido que el peso seco porque
plantas que se han necrosado o muerto recientemente pueden tener el mismo peso seco que plantas
que se notan verdes y saludables (Santelmann 1977).
Por razones de conveniencia, espacio y costo energético, yo me inclino en mis bioanálisis por el
peso fresco (casi siempre basta evaluar en peso del follaje y no el del sistema radical). Antes de
cosechar las plantas, procedo a hacer una evaluación visual detallada y a documentar
fotográficamente las respuestas observadas. Confío más en estas herramientas que en mi memoria.
Estas observaciones son muy útiles cuando se analiza los datos. La evaluación visual se puede
detectar claramente valores atípicos (los denominados “outliers”) y proporcionar un criterio menos
sesgado en caso de que se deba de eliminar el dato del análisis. También es oportuna por cuanto en
algunas ocasiones las plantas en alguno de los tratamientos testigo crecen de manera anormal y se
debe considerar su eliminación del set de datos a analizar (por eso la conveniencia de incluir dos
testigos en cada repetición). Por último, no escapa a la realidad el hecho de que alguna planta sufra
daño mecánico o que la devore un insecto. En la evaluación visual se constata la situación y se
procede, sin pérdida de rigor científico, a eliminar el dato. Un asistente de investigación o
estudiante bien entrenado detecta este tipo de problemas y consulta; un ayudante que diligentemente
sigue la directriz de cosechar y pesar, recolecta un dato incierto y con él genera incertidumbre en
toda la repetición o en el bioanálisis.
Algunos autores prefieren evaluar el efecto de los tratamientos determinando la mortalidad de las
plantas. La validez de este tipo de evaluación depende del número de individuos que componen
cada tratamiento. En el sentido estricto, una planta puede estar viva o muerta, no medio muerta ni
medio viva. En mi experiencia la respuesta de las plantas a las dosis crecientes de herbicidas no
está definida en blanco y negro sino en tonos de gris. Por ello, le veo mucha ventaja a la
determinación de peso fresco. Además, el peso es una variable continua, mientras que la mortalidad
(o supervivencia) corresponde a una variable de respuesta binomial, la cual debe ser sujeto de un
análisis de probits.
El efecto de los herbicidas se puede valorar utilizando otras mediciones, dependiendo de los
objetivos del experimento y del equipo y recursos disponibles. Entre ellas incluye altura de planta,
longitud de raíz, área foliar (o índice de área foliar), rendimiento en grano o fruto, tasa de
crecimiento relativo, tasa de asimilación neta, tasa fotosintética, fluorescencia de la clorofila,
64
producción de algún metabolito específico. Se puede medir el consumo diario de agua por las
plantas como un indicador del efecto del herbicida siempre y cuando las condiciones ambientales
sean homogéneas para todas las plantas (Santelmann et al. 1971).
Aunque resulte obvio, es importante registrar los datos y almacenarlos de manera segura. Si se
registran en papel, hágalo con lápiz, no con bolígrafo. En caso de que el papel se humedezca, los
registros no se dañarán. Con los medios disponibles en la actualidad, cada vez es más común el
registro electrónico de los datos. No olvide realizar los respaldos necesarios.
Análisis de los datos y presentación de los resultados
Análisis preliminar de los datos y ajuste de un modelo estadístico. Una vez obtenidos los datos,
debe de procederse a su análisis, el cual, idealmente, debió haber sido planeado desde que se diseñó
el experimento para así garantizar que se logrará cumplir con sus objetivos. Me gusta recordar a
mis estudiantes que la estadística es una herramienta y no la razón de ser del bioanálisis. Sin
embargo, un buen set de datos mal analizado priva al investigador y al lector de información útil.
Con este criterio, mi primer encuentro con los datos recolectados siempre es la elaboración de un
gráfico con los datos “crudos” de peso fresco (o la variable medida) vs dosis. La dispersión de los
datos y la forma en que se distribuyen me dan una primera impresión de la calidad del bioanálisis.
Este ejercicio puede hacerse en una hoja de Excel o cualquier programa similar. Procuro ser el
crítico más riguroso de mí mismo. Son muchas las ocasiones en que al llegar a este punto confirmo
que el estudio fue un fracaso y que lo único que puede hacerse es repetir el experimento. Si hay
valores atípicos (“outliers”), este es el momento de valorarlos y de tomar decisiones respecto de
ellos. La gráfica también es útil para proporcionar los valores estimados de los parámetros del
modelo de regresión que requiere la mayoría de los programas de cómputo para iniciar sus
iteraciones para el ajuste definitivo del modelo. El módulo “drc” (dose response curve) empleado
con el programa de uso libre “R” (http://www.r-project.org) preparado por Streibig
(www.bioassay.dk) no requiere proporcionar tales estimados para iniciar el análisis.
El análisis de la respuesta a dosis crecientes de herbicidas requiere ajustar un modelo adecuado y
que tenga significado biológico. Las respuestas obtenidas con plantas tratadas con dosis crecientes
de herbicidas son de tipo sigmoideo. No tiene sentido alguno tratar de ajustar un modelo polinomial
de quinto orden que puede ajustarse muy bien a los datos si sus parámetros no tienen el mínimo
sentido biológico. También carece de sentido cuando se determina la respuesta de plantas a dosis
crecientes de herbicidas hacer comparaciones de medias empleando pruebas de rango múltiple
como las de Duncan, Tukey o DMS. La intención al momento de diseñar el experimento no era la
de comparar el efecto de dosis discretas del producto sino el comportamiento de las plantas
conforme aumenta la dosis del herbicida. Tampoco es de interés presentar ambos análisis (el de
regresión y el de rango múltiple).
Conforme lo mencionado anteriormente, cuando se grafica el peso de las plantas u otra variable de
respuesta contra el logaritmo de la dosis de herbicida, se obtiene una relación sigmoidea (en forma
de “S”), similar a la observada en la Figura 1. Esta respuesta está descrita por un modelo logístico:
Y = C + {DC / 1 + exp[b(log x – log ED50)]}
Como se observa, el modelo está definido por cuatro parámetros, donde
65
Y denota la respuesta de crecimiento (peso, longitud de la raíz o del tallo, tasa fotosintética) a
la concentración x del herbicida:
D corresponde al límite superior, es decir, representa la respuesta del testigo sin tratar
C denota el límite inferior, el cual, se aproxima a cero cuando las dosis del herbicida son
muy altas (o el peso de las plantas al momento de ser tratadas).
b es la pendiente de la curva cerca de la ED50. Cuanto mayor sea el valor de b, más
pronunciada es la pendiente
ED50 es la dosis del herbicida que reduce el crecimiento (o el valor de la variable de
respuesta) en un 50%.
Una vez ajustado el modelo, fácilmente puede obtenerse el valor de respuesta a otro nivel, por
ejemplo la ED25 o ED75, con base en la siguiente expresión dada en función de los parámetros, b y
ED50:
ED50 = EDx / (x / 100 –x)1/b
donde x es cualquier nivel de respuesta. De tal forma, si se desea calcular la ED25, entonces el valor
de x es 25.
Comparación de respuestas. Cuando comparamos la respuesta de biotipos a un mismo herbicida
para determinar si son resistentes o susceptibles, en realidad estamos determinando cuál dosis del
herbicida tiene el mismo efecto sobre las poblaciones, es decir, se hace una comparación de tipo
horizontal, que contesta la pregunta ¿Cuánto herbicida se requiere para inhibir el crecimiento en un
50% (o en otra magnitud previamente definida)? En sentido biológico, esto equivale a una
comparación de tasas de cambio a niveles de respuesta predeterminados (Streibig 1988). La
comparación más rigurosa se hace cuando las dos curvas de respuesta son similares en todos sus
parámetros, excepto la ED50, en cuyo caso se pueden definir como paralelas (Figura 6). La
magnitud del desplazamiento de estas curvas en el sentido horizontal está dada por un factor
constante que se denomina la “potencia relativa” (Seefeldt et al. 1995) y que corresponde con el
índice de resistencia. Cuando se tiene curvas paralelas la potencia relativa es independiente del
nivel de respuesta que se seleccione (ED10, ED50, ED90 o cualquier otro) para hacer la comparación.
La comparación de los valores de ED50 se realiza con un procedimiento que es básicamente una
prueba de t: se verifica que no haya traslape en los intervalos de confianza de las dos curvas que se
comparan a un nivel de probabilidad previamente establecido.
Figura 6. Comparación horizontal (A) y vertical (B) de curvas dosis-respuesta de dos herbicidas.
Adaptado de (Streibig 1988).
66
Desafortunadamente, las curvas de dosis-respuesta rara vez son paralelas o muy similares. Esto
obliga a que los modelos de dosis-respuesta deban probarse estadísticamente para determinar si son
similares antes de poder hacer las comparaciones de potencia relativa (Ritz et al. 2006). Estos
análisis (como el de la prueba de F por falta de ajuste o “lack of fit”), aunque son complicados
desde el punto de vista estadístico y metodológico, se convierten en rutina porque están
contemplados en los programas estadísticos de uso común. Si la prueba de F para falta de ajuste es
no-significativa, puede inferirse que el modelo se ajusta de manera aceptable.
El otro tipo de comparación de curvas de respuesta es la vertical, es decir, se compara la respuesta
de las plantas o poblaciones a dosis preseleccionadas del herbicida (Figura 6). En la representación
gráfica es muy evidente que cuando las comparaciones se hacen cerca del límite inferior o superior,
las diferencias por efecto del tratamiento son mucho menores que si se hacen cerca del punto medio
(cercano al valor de ED50). En otras palabras, los herbicidas afectan a las plantas de manera
diferente conforme se varía la dosis. Por este motivo, cuando se hace un análisis de varianza se
revela que existe una interacción significativa.
Al comparar la respuesta de poblaciones o biotipos a herbicidas, es importante usar
consistentemente una misma metodología. Los datos pueden no ser comparables si se emplean
métodos diferentes. Por ejemplo, en principio no debe de compararse los resultados obtenidos con
una prueba realizada en papel de filtro con otra hecha en medio de cultivo preparado con agar. Si
alguno de los métodos se va a emplear como herramienta de diagnóstico es aconsejable relacionar
los resultados obtenidos con los de bioanálisis con plantas enteras (Cutulle et al. 2009; Yang et al.
2007).
Desigualdad de límites superiores e inferiores entre curvas a comparar. Como se mencionó
previamente, las plantas a veces crecen de manera diferente, sin razón aparente, en un mismo
bioanálisis. Por esta razón es posible que el límite superior o inferior o ambos de los curvas a
comparar sean distintos (de ahí la tendencia a expresar los datos como porcentaje). En estos casos,
la potencia relativa no es constante a través de todos los niveles de respuesta y la transformación a
porcentaje del testigo puede inducir a error por cuanto permite la comparación como si las curvas
fueran paralelas. En este caso, lo más prudente es hacer las comparaciones a un nivel de respuesta
que sí sea respaldado por los datos experimentales y utilizando las curvas ajustadas a los datos de
peso (no porcentuales) originales de modo que se obtengan errores estándar válidos (Knezevic et al.
2007; Ritz and Streibig 2005). Para la presentación gráfica, se puede usar el valor relativo de
biomasa (o de la variable de respuesta) en relación con el testigo para facilitarle al lector la
comprensión del mensaje.
Es posible que al planear y realizar un bioanálisis que incluye a varias especies o biotipos, los
ámbitos de dosis escogidos no nos permitan obtener curvas de respuesta completas. Si algún
material es muy tolerante o resistente, la dosis mayor incluida en el ámbito puede ser insuficiente
para poder estimar el límite inferior C (Figura 7). En este caso, el modelo de cuatro parámetros
debe de modificarse para eliminar el parámetro C, por lo que la respuesta debe ahora ser ajustada
con el modelo:
Y = D / 1 + exp[b(log x – log ED50)]
Puesto que, en la mayoría de los casos de nuestro interés realizamos comparaciones de ED50s los
valores estimados con el modelo de tres parámetros pueden compararse con los obtenidos para las
otras plantas o biotipos que sí permitieron la estimación de todos los parámetros, siempre teniendo
en consideración los correspondientes intervalos de confianza asociados con los valores de ED50. Si
67
la comparación de interés fuera a niveles mucho mayores, por ejemplo ED90, no sería posible
realizarla a no ser que se repitiera el experimento.
Figura 7. Curva de dosis-respuesta a un herbicida usando un ámbito de dosis insuficiente para
alcanzar el límite inferior.
Hormesis. Con alguna frecuencia y dependiendo del ámbito de dosis empleado, puede observarse
un aumento en la respuesta medida (crecimiento) cuando las plantas se tratan con dosis muy bajas
(Figura 8). A este estímulo del crecimiento se le denomina hormesis y se observa no sólo con
herbicidas en plantas sino con gran cantidad de compuestos tóxicos en muchas especies (Calabrese
& Blain 2009). Se presenta con herbicidas de distintos modos de acción y se ha tratado de explicar
en relación con los efectos filológicos de cada producto. Cuando hay hormesis, la relación
sigmoidea se altera. Si el objetivo del bioanálisis no es el estudio de los efectos subtóxicos del
herbicida se puede obviar esta parte de la curva y ajustar el modelo simétrico de curva sigmoidea
(Streibig 1988). Si hay interés en estudiar el efecto de dosis subletales, existen modelos apropiados
que consideran la hormesis (Brain & Cousens 1989; Cedergreen et al. 2005).
Comparación de múltiples curvas de respuesta obtenidas en bioanálisis independientes. Cuando se
tiene muchas poblaciones o especies a comparar en estudios de dosis-respuesta no es posible
ejecutar todos los bioanálisis en forma simultánea. Sin embargo, el objetivo final es poder
diferenciar entre todas ellas la manera en que responden al herbicida (por ejemplo, cuáles
poblaciones son resistentes). La pregunta que salta a la vista es ¿puedo hacer una comparación de
todas las curvas a pesar de que se generaran en distintos momentos? En la práctica, hay dos
aspectos que son de interés. El primero es cuán confiables desde el punto de vista biológico pueden
ser las comparaciones, especialmente si los experimentos se realizan en condiciones donde no hay
control de las variables ambientales, las cuales son homogéneas dentro de cada grupo de bioanálisis
pero heterogéneas entre grupos. Me enfrento con esta encrucijada con mucha frecuencia. Para mi
propia tranquilidad, recurro a una herramienta sencilla que me da la suficiente confianza en mis
datos. Cada vez que hago los bioanálisis, incluyo un biotipo bien caracterizado que considero de
referencia (por ejemplo, el susceptible en las pruebas de diagnóstico de resistencia).
68
Figura 8. Curva de dosis-respuesta a un herbicida usando en la que se nota la hormesis (estimulo del
crecimiento cuando las plantas se tratan con dosis muy bajas).
El otro aspecto relevante, es cómo realizar la comparación estadística de modo que tenga validez.
Una forma de proceder en estos casos es hacer los análisis estadísticos conforme se van
completando los bioanálisis, lo cual de por sí es una práctica deseable para conocer mejor el
material y poder determinar si hay problemas con los datos y deba repetirse algún experimento. De
esta manera se obtienen los modelos de dosis-respuesta y sus parámetros con sus respectivos errores
estándar e intervalos de confianza. Acumular datos y tratar de correr todos los análisis de regresión
de una sola vez es contraproducente. Un número elevado de curvas para ajustarse de una sola vez
no permite aplicar un modelo no-lineal mixto pues el número de parámetros sería tan grande que
limitaría la convergencia del proceso. Si algunos los bioanálisis no aportan respuestas adecuadas, la
comparación puede arrojar resultados incongruentes. Una vez obtenidos los parámetros de las
regresiones dentro de cada grupo, se puede realizar una comparación de las ED50s utilizando un
modelo lineal mixto balanceado en el cual la variación entre las corridas de bioanálisis (grupos)
corresponde con un efecto aleatorio. Las desviaciones estándar de los distintos parámetros de
regresión analizados se emplearan como balance del análisis de varianza (J.C. Streibig, 2009.
Universidad de Copenhague, comunicación personal).
Procedimientos estadísticos en mayor detalle. El fundamento teórico y los procedimientos
específicos para realizar los análisis estadísticos de los datos obtenidos en los bioanálisis rebasan el
objetivo de este trabajo. Quienes tengan interés en ahondar más en este tema pueden referirse
diversas publicaciones especializadas (Brain & Cousens 1989; Cedergreen et al. 2005; Knezevic et
al. 2007; Nielsen et al. 2004; Ritz et al. 2006; Ritz & Streibig 2005; Seefeldt et al. 1995; Streibig
1988; Streibig & Kudsk 1993).
Presentación de resultados. La forma más ilustrativa de presentar los datos es mediante gráficos
que reflejen la respuesta del material evaluado. En el gráfico debe de incluirse los datos originales
y la curva ajustada. De esta manera, el lector puede valorar la calidad de nuestro experimento. En
69
un cuadro por separado, debe de proporcionarse los parámetros del modelo con sus respectivos
intervalos de confianza. Si hay diferencias en el crecimiento de los biotipos o poblaciones (límite
superior e inferior) los gráficos pueden resultar poco atractivos a la vista. En lugar de hacer una
transformación a porcentaje del testigo, la cual es inadecuada (ver (Ritz et al. 2006) para detalles
específicos), es preferible ajustar el gráfico de modo que el peso de los testigos sin tratar (límite
superior) corresponda visualmente. La información relevante estará de todos modos en el cuadro
que acompaña al gráfico. Proporcionar la información completa sobre la ecuación de regresión
también permite al lector calcular otros valores de inhibición que pueden ser de su interés (Ej.
ED10).
La presentación de los datos provenientes de una curva-respuesta basada en una progresión
geométrica usando una escala lineal provoca que los datos se agrupen hacia el extremo inferior del
gráfico lo que dificulta visualizar el valor de la ED50 y tener una idea clara de la forma en que la
planta responde al herbicida (Figura 9).
Pruebas rápidas
La conducción de bioanálisis con plantas enteras requiere de mucho tiempo, sobre todo si se toma
en cuenta la recolección y preparación de la semilla y crecer las plantas hasta el estado adecuado
para someterlas a los tratamientos. Cuando es necesario tener información en poco tiempo, puede
recurrirse a pruebas rápidas diseñadas según el objetivo perseguido.
En la determinación de residuos de un herbicida en el agua, puede hacerse una prueba con Lemna
spp. que permite obtener resultados en cinco o siete días. Si se desea corroborar la resistencia de
una maleza a un herbicida, puede recolectarse plántulas en el campo y tratarlas en medio adecuado
para caracterizarlas en un período de horas o unos pocos días, como en el caso de la respuesta de E.
colona a propanil y otros herbicidas (Kim et al. 2000). De manera similar, se ha desarrollado
pruebas con plántulas para diagnosticar resistencia a herbicidas inhibidores de ACCasa mediante la
medición de la longitud del coleoptilo de Sorghum halepense (Burke et al. 2006).
0
10
20
30
40
50
0 50 100 150 200 250 300
A
Fluazifop-p-butilo (g e.a. ha
-1
)
Peso fresco en gramos
0
10
20
30
40
50
0.1 1 10 100 1000
Testigo
B
Fluazifop-p-butilo (g e.a. ha
-1
)
Peso fresco en gramos
Figura 9. Respuesta de un biotipo de Eleusine indica proveniente de Malasia (MY21A) al herbicida fluazifop-p-
butilo. Se compara la presentación de los datos utilizando una escala lineal (A) y logarítmica (B) para las dosis del
herbicida. Parámetros (valor [intervalo de confianza]) de la ecuación (según modelo logístico): D = 30.27 [23.93 -
36.62], C = 1.75 [1.37 - 2.13], b = 1.56 [1.12 - 2.01], ED50 = 5,05 [2,96 - 7,14]. Bioanálisis realizado por IDEA
Tropical, S. A. en Costa Rica. Datos no publicados previamente.
70
También es posible realizar bioanálisis no destructivos empleando partes de órganos o tejidos.
Koger et al. (2005) desarrollaron métodos simples para diferenciar biotipos de C. canadensis
resistentes y susceptibles a glifosato. Uno de los métodos consiste en sumergir hojas en diluciones
del herbicida por tres días y evaluar el daño visualmente. El otro, en incubar discos de hojas en
diluciones del herbicida por 16 horas y medir los niveles de shikimato en un espectrofotómetro. La
acumulación de shikimato dependiente de la dosis de glifosato en plantas susceptibles al herbicida
es un método estándar para diferenciarlas de las resistentes (por sitio de acción) en las cuales no se
acumula el shikimato.
Determinación de la presencia y comportamiento de herbicidas en el suelo
Los bioanálisis pueden ser muy útiles para estudiar el comportamiento de los herbicidas en el suelo
o sustratos de siembra. La presencia de residuos de triasulfurón y sulfosulfurón en el suelo fue
determinada experimentalmente midiendo la longitud de la raíz de plantas de girasol con precisión
de partes por millardo (Hernandez-Sevillano et al. 2001). El movimiento del herbicida
pendimetalina a través de una capa de corteza de pino utilizada como medio de cultivo en viveros se
cuantificó utilizando Digitaria sanguinalis como planta indicadora (Simmons & Derr 2007). La
presencia de residuos de un herbicida auxínico (clopiralid) en composta fue analizada empleando
arvejas y trébol como plantas indicadoras. El nivel de salinidad del medio afectó los resultados
impidiendo la detección del herbicida a niveles bajos cuando la salinidad fue muy elevada (Brinton
et al. 2006).
Los bioanálisis pueden ayudar a identificar una sustancia que causa un daño fitotóxico a una planta
de importancia comercial. Por ejemplo, es posible que se atienda un caso en el que se supone que
se aplicó un herbicida no selectivo por error, que el agua empleada en el riego venía contaminada
con un herbicida, o que productos persistentes empleados en el pasado tengan actividad biológica y
afecten negativamente al cultivo sembrado. En estos casos, el bioanálisis pretende reproducir los
síntomas de toxicidad. Para ello, pueden tratarse plantas con los herbicidas sospechosos de causar
el daño en dosis que asemejen las que pudieron emplearse por error o presentes en el agua de riego
para reproducir los síntomas y determinar cuál herbicida produjo el daño. También puede hacerse
crecer plantas sensibles en suelo contaminado y comparar sus respuestas con las de plantas
sembradas en suelo sin residuos o con contenidos conocidos del contaminante de interés. En este
tipo de estudios hay dos premisas claves: la especie indicadora mostrará una respuesta que es
proporcional a la concentración del herbicida y que las respuestas obtenidas sean reproducibles
(Santelmann 1977).
Mediante el empleo de plantas indicadoras se puede determinar la movilidad de los herbicidas en
asocio con experimentos en los que columnas de suelo se tratan con cantidades conocidas de un
herbicida en forma superficial y se agrega cantidades conocidas de agua para propiciar su
lixiviación. El movimiento del herbicida se determina sembrando plantas muy sensibles
(indicadoras) y comparando el daño contra una curva estándar preparada con base en dosis
conocidas del producto (Van Wyk & Reinhardt 2001).
Aislamiento de componentes activos dirigido por bioanálisis
Los bioanálisis sirven como un complemento indispensable para el descubrimiento de sustancias
activas, principalmente de origen natural, bajo un esquema de aislamiento dirigido por bioanálisis.
Este es un proceso iterativo en el que los compuestos de un organismo se separan en distintas
71
fracciones, las cuales se someten a un bioanálisis para determinar la actividad biológica de interés.
Las fracciones que muestran actividad se fraccionan aun más y se prueban nuevamente en los
bioanálisis hasta que se encuentra y purifica el compuesto biológicamente activo. Este esquema de
determinación de las sustancias activas se facilita mucho cuando se puede emplear bioanálisis
rápidos en miniatura (Dayan & Duke 2006).
Interacción de herbicidas entre sí y con otras sustancias
Las aplicaciones de herbicidas en el campo muy frecuentemente incluyen dos o más ingredientes
activos en mezcla. En la mayoría de los casos el objetivo de realizar estas mezclas es el de ampliar
el espectro de acción sobre las malezas, aunque también puede procurarse aprovechar posibles
sinergismos (o antagonismos) entre los componentes de la mezcla. Los bioanálisis ayudan a
determinar los tipos de interacciones que pueden presentarse y a identificar los posibles mecanismos
de tales interacciones.
Aunque el tema excede los objetivos de este trabajo, es importante indicar muy brevemente algunos
aspectos que deben considerarse en el diseño y ejecución de pruebas de interacciones de herbicidas
entre sí o con otros compuestos. Estos temas son tratados en amplio detalle en publicaciones
especializadas (Streibig et al. 1998; Streibig & Kudsk 1993).
Existen dos modelos de referencia principales para estudiar la acción conjunta de herbicidas (u otras
sustancias químicas con acción biocida). El modelo de dosis aditivas (MDA) supone que los dos
compuestos en interacción tienen modos de acción similares en la planta tratada y que pueden
sustituirse el uno por el otro sobre la base de su potencia relativa (término que se definió en la
sección sobre comparación de respuestas). Las desviaciones que se presentan de este modelo se
caracterizan como sinergismo o antagonismo, cuando el efecto de la mezcla es superior o inferior al
del herbicida individual, respectivamente (Streibig et al. 1998). Si determinamos
experimentalmente que el herbicida A en una dosis de 600 g ha-1 proporciona un control del 50% y
que del herbicida B se requiere 10 g ha-1 para lograr el mismo efecto; entonces la potencia relativa
es de (600/10) = 60. Si quisiéramos por alguna razón agronómica o económica usar solo 400 g ha-1
del herbicida A, entonces requeriríamos adicionar 3,33 g ha-1 del herbicida B para alcanzar el 50%
de control. Es decir, aplicando un total de 403,33 g de la mezcla según el modelo, permitiría lograr
un control del 50%.
El modelo de supervivencia multiplicativa (MSM) que supone que las dos sustancias ejercen su
efecto independientemente en la planta. Este modelo es el que sirve de base a las comparaciones
según el criterio de Colby (Colby 1967) que son muy populares en la ciencia de las malezas por su
simpleza, facilidad de cálculo e interpretación. Para una prueba de Colby basta con aplicar cada
uno de los herbicidas por separado y luego en mezcla a las mismas dosis que los tratamientos
individuales para determinar el tipo de interacción. El siguiente ejemplo ilustrativo puede aclarar
conceptos. Para determinar la interacción entre los herbicidas glifosato o glufosinato con MSMA se
realizó un experimento de campo en el que se aplicaron los herbicidas solos y en mezcla sobre
varias malezas, entre ellas Sesbania exaltata (hoja ancha) y Sorghum halepense (gramínea)
proveniente de semilla (Koger et al. 2007). Las dosis a que se aplicaron los herbicidas y los
resultados de la evaluación visual de daño se presentan en el Cuadro 1.
72
Cuadro 1. Control visual (observado y esperado) de Sesbania exaltata (SEBEX) y Sorghum
halepense (SORHA) dos semanas después del tratamiento con glifosato, glufosinato, y MSMA en
mezcla de tanque (Adaptado de (Koger et al. 2007)).
SEBEX SORHA
Herbicida Dosis
Observado (Esperado) Observado (Esperado)
Glifosato 0,84 kg e.a. ha-1 41 99
Glufosinato 0,5 kg i.a. ha-1 95 92
MSMA 2,2 kg i.a. ha-1 21 68
Glifosato + MSMA 0,84 + 2,2 47 (56)1 95 (99)
Glufosinato + MSMA 0,5 + 2,2 92 (99) 91 (97)
DMS (0,05)2 6 5
1Valores esperados calculados por autores originales de acuerdo con Colby (1967).
2Diferencia mínima significativa.
El glifosato solo a la dosis empleada controló al S. halepense en un 99% y a S. exaltata en un 41%.
Estos valores provienen de evaluaciones visuales realizadas en cuatro repeticiones dos semanas
después de la aplicación en una de las dos localidades (Louisiana, EE.UU.) donde se realizaron los
experimentos. La valoración visual se basó en una escala de 0% (ausencia de control) a 100%
(muerte de la planta) considerando, de acuerdo con los autores, clorosis, necrosis y reducción del
crecimiento. El MSMA también fue más eficaz para controlar S. halepense que S. exaltata. Cuando
se aplicaron en mezcla de tanque, se consideró que el MSMA actuó como un antagonista del
glifosato (comparar los valores de control esperados y observados). El valor esperado para la
mezcla de glifosato más MSMA en S. exaltata corresponde a E = 41 + [(100 - 41)*0,21)] = 53,4% y
en S. halepense a E = 99 + [(100-99)*0,68] = 99.7%(autores indican 56% y 99%, respectivamente,
posiblemente por efecto de redondeo). Una situación similar se presentó con el glufosinato, aunque
este herbicida aplicado solo igualmente controló ambas especies. Si los valores esperados se
calculan de la misma manera se obtiene 96.1% y 97.4%, respectivamente (no es posible saber si las
diferencias se pueden atribuir a errores de cálculo o redondeo). En este caso, se está comparando
herbicidas en mezcla que tienen modos de acción diferentes. En el caso del glifosato, la dosis es lo
suficientemente elevada como para llevar la respuesta de la planta a su límite inferior en la curva
dosis-respuesta dejando “poco margen” para que el herbicida complementario ejerza su efecto. En
la publicación no se da intervalos de confianza para los valores observados y el lector puede
preguntarse cuál es la diferencia en una evaluación visual entre 100% y 99% como promedios de
daño.
De acuerdo con lo que se ha discutido, sin embargo, es más adecuado planificar y evaluar el
experimento haciendo las mezclas con base en la potencia de cada herbicida aplicado
individualmente y decidiendo cuál modelo usar con base en nuestro conocimiento sobre el modo de
acción de los herbicidas. Inderjit et al. (2002) presentan un ejemplo de cómo se calcularon las dosis
para probar mezclas en un experimento de isobolas con compuestos fenólicos de naturaleza
alelopática.
Los resultados de los experimentos de mezclas por lo general se presentan gráficamente de forma de
isobolas (líneas de igual efecto) con base en un nivel de efecto preseleccionado (casi siempre la
ED50). En este gráfico las desviaciones que muestren los valores experimentales obtenidos con las
muestras que indiquen un efecto superior al de la isobola de referencia designan como sinérgicos;
73
en el caso opuesto, representan una mezcla antagónica. En la Figura 10 se ilustran las posibles
isobolas.
Figura 10. Ilustración del modelo de isobolas. La línea recta corresponde al modelo de dosis aditivas
y las líneas punteadas al antagonismo y sinergismo.
Existen procedimientos estadísticos para determinar si la isobola correspondiente a las mezclas se
ajusta a los datos experimentales así como para determinar la significancia de la desviación, es
decir, para respaldar estadísticamente si en efecto existe el sinergismo o antagonismo (Kudsk &
Streibig 1993).
El mismo concepto de isobolas se puede emplear para estudiar el efecto de sustancias
biológicamente inactivas sobre la acción del un herbicida. Tal es el caso del efecto de coadyuvantes
o “surfactantes” que, en principio, en las dosis de uso normal no afectan el crecimiento de las
plantas. Las isobolas de referencia para estos casos se ilustran en la Figura 11.
74
Figura 11. Ilustración esquemática de las tres posibles situaciones que pueden presentarse cuando se
incrementa la dosis de un coadyuvante en interacción con un herbicida. I denota aditividad, II
antagonismo, y III sinergismo. Adaptado de (Kudsk & Streibig 1993)
Si la curva de dosis-respuesta del herbicida no es alterada por la adición del coadyuvante, la isobola
tendrá la forma lineal (I) de la Figura 11, es decir, la adición del coadyuvante no varia la dosis del
herbicida necesaria para lograr producir un efecto determinado. Si el coadyuvante reduce la
eficacia del herbicida, la isobola correspondiente se elevará como en II porque ocurre un
antagonismo. La otra posibilidad (III) es que el adyuvante mejore la eficacia por lo que la dosis
necesaria del herbicida para lograr el mismo efecto se reduce, es decir, se presenta sinergismo.
Comentarios finales
Los bioanálisis constituyen una herramienta muy valiosa en el diagnóstico fitosanitario y en la
investigación sobre la acción de los herbicidas. La gama de posibilidades de utilizar organismos
vivos para detectar la presencia y concentración de herbicidas en el ambiente o para evaluar la
respuesta biológica y fisiológica de las plantas a estos productos es muy amplia y permite adaptar
métodos y técnicas según sean los objetivos perseguidos. En este trabajo se describe algunas de las
oportunidades que ofrecen los bioanálisis así como los procedimientos fundamentales que deben de
tomarse en cuenta en su planeamiento, ejecución e interpretación. Se ha puesto énfasis en los
estudios que utilizan plantas enteras pero los fundamentos discutidos tienen aplicación
independientemente del organismo indicador que se emplee. En la medida de lo posible, la
información se ha presentado de la manera más sencilla y con el objetivo de ayudar a quienes
requieren realizar bioanálisis en su práctica profesional, aportando experiencia propia y referencias
selectas de la literatura científica. Por su naturaleza introductoria, se espera que este trabajo
estimule al lector a ahondar más en el tema y le sirva como base para planear trabajos que requieran
el empleo de bioanálisis.
Literatura Citada
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Nota: La diagramación de esta publicación, que incluye figuras en color, es ligeramente diferente a la utilizada
en la impresión original de El Malezológo. El contenido, sin embargo, es idéntico.
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experiencia práctica. Capítulo 4. Curso de actualización en metodologías de investigación y
el desarrollo tecnológico en el manejo de malezas. El Malezólogo. Sociedad Venezolana para
el Combate de Malezas (SOVECOM), Venezuela, p. 52-76.
... Se comparan las respuestas de las plantas que se desarrollan en un suelo tratado (que contiene concentraciones conocidas de herbicidas) con las plantas que crecen en el suelo sin tratar. La especie utilizada debe ser lo suficientemente sensible para detectar concentraciones muy bajas de herbicidas y debe mostrar un aumento gradual en la susceptibilidad con el aumento de la concentración del herbicida (Valverde, 2009). ...
... Los bioensayos se pueden utilizar para estudiar la actividad, la persistencia, y el movimiento de los herbicidas en los suelos, los efectos de diferentes propiedades del suelo y las condiciones ambientales en la fitotoxicidad de los herbicidas, y la absorción, circulación y degradación de los herbicidas en las plantas. Muchos investigadores prefieren utilizar especies cultivadas como plantas indicadoras por la baja variabilidad genética y la disponibilidad del material vegetal para posteriores aplicaciones del método (Valverde, 2009). Es una técnica muy útil por su sencillez, bajo costo, precisión y sentido biológico. ...
Article
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This research was conducted to evaluate the behavior of species Phaseolus vulgaris and Zea mays as bioindicators of the presence of imidazolinone herbicides in the soil. Two experiments were conducted under a completely randomized design with eight treatments and ten replications. The objectives were to identify the species that best behaved as an indicator (experiment 1), and to validate the use of selected species, characterized through the use of dose curves-response using a log-logistic model (experiment 2). The plants were grown in pots with soil supplemented with eight different concentrations of a mixture of imidazolinone (imazethapyr and imazapyr). In the second experiment, a concentration control was added to corroborate the model and to evaluate its predictive capacity. In both experiments, the aerial dry biomass of plants was determined. Corn was the species that best behaved as bioindicator. The obtained dose-response curves were asymptotic and asymmetric with a rapid decrease of biomass with the increase of herbicide concentration in soil. The concentration estimated by models that reduced by 10 % corn biomass corresponded to 8.3 and 13.6 % of the applied commercial rate (200 g·ha -1) for experiments 1 and 2, respectively, thus suggesting a high sensitivity of the species to the herbicide. As for the predictive ability of the model, the estimated herbicide concentration in soil deviated only 10.9 % of real value.
Article
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The objective of this study was to investigate the resistance level of Japanese foxtail to haloxyfop, an acetyl coenzyme A carboxylase (ACCase; EC 6.4.1.2)-inhibiting herbicide. Eleven biotypes were collected from oilseed rape fields in different areas in Jiangsu and Anhui provinces where haloxyfop had been continuously applied for various periods. Biotypes were assessed by two different methods, a seed bioassay and whole-plant assay, to identify the most resistant and susceptible biotypes for further studies on the activity of the target enzyme ACCase. A good correlation was obtained between the two different bioassay methods. The Jurong and Chuzhou biotypes were the most resistant and susceptible biotypes, respectively, whereas the other nine biotypes showed variable and relatively low degrees of haloxyfop resistance. Furthermore, target-site enzyme sensitivity results confirmed that the Jurong biotype was resistant to haloxyfop with a concentration of herbicide causing 50% inhibition of ACCase activity (IC50) of 9.19 μM, whereas the IC50 of the susceptible biotype (Chuzhou) was 0.76 μM, giving a resistance index of 12.
Article
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This article discusses the concept of relative potency of herbicides in bioassays where individual dose-response curves can be similar or nonsimilar, often denoted parallel and nonparallel curves, and have different upper and lower limits. The relative potency is constant for similar dose-response curves and measures the relative horizontal displacement of curves of a similar shape along the dose axis on a logarithmic scale. The concept of similar dose-response curves has been used extensively to assess results from herbicide experiments, for example, with the purpose of adjusting herbicide doses to environmental conditions, formulations, and adjuvants. However, deeming dose-response curves similar when they are not may greatly affect the calculation of the relative potency at response levels such as effective dosage (ED)90, which is relevant for effective weed control, or ED10, which is used in crop tolerance studies. We present a method for calculating relative potencies between nonsimilar dose-response curves at any response level. It also is demonstrated that if the upper, lower, or both limits among response curves are substantially different, then the ED50 or any other ED level cannot be used indiscriminately to compute the relative potency. Rather, the relative potency should be viewed as a function of the response level.
Article
A survey was conducted in a township near Treherne, Manitoba to determine the frequency of Group 1 resistant wild oat in 30 randomly selected cereal fields. On average, 61% of the 30 fields were sprayed annually with ACCase inhibitor (Group 1) herbicides from 1983 to 1993. Wild oat were sampled at 80-m intervals on a predefined grid pattern across whole fields. Wild oat densities were recorded and seeds were collected from 0.25 m-2 quadrats. Seeds were also collected from conspicuous wild oat patches occurring outside the spaced quadrats. Plants were determined to be susceptible or resistant to fenoxaprop-P and/or sethoxydim using a seed bioassay procedure. Results from the structured survey indicated that resistant wild oat occurred in nine fields. Densities in quadrats containing resistant wild oat were generally higher than in quadrats with susceptible wild oat. By combining the results of the structured survey with the patch collection, resistance was detected in 20 out of the 30 fields. While resistant weeds generally occurred in small patches, in two of the fields, resistant plants occurred over much larger areas. The evidence suggests that as many as two fields in three may harbour Group I resistant wild oat in high risk townships in Manitoba.
Article
A cooperative study to evaluate the accuracy and precision of bioassays was carried out among investigators at several locations for 3 years. Oats ( Avena sativa L., var. Cimarron) seedlings were used as indicator plants for soil-applied 2,4-bis-(isopropylamino)-6-methylthio- s -triazine [prometryne]. Assay results varied a great deal initially, and ranged from 147% below to 234% above the prometryne actually applied. The adoption of uniform conditions and procedures greatly increased the uniformity of the determinations between locations to a range of from 37% low to 0% high in prometryne applied. Chemical analyses of the soils ranged from 13% low to 20% high. Measurements of herbicidal activity included dry and fresh plant weights, plant height, visual injury ratings, and plant water use. The average concentration of prometryne in the soil as estimated with several types of measurements gave a much better measure of prometryne content than any one measurement alone. Prometryne rapidly and greatly affected the utilization of water by oats seedlings and careful measurement of water use showed potential of being a good early indicator of prometryne activity.
Article
Dose-response studies are an important tool in weed science. The use of such studies has become especially prevalent following the widespread development of herbicide resistant weeds. In the past, analyses of dose-response studies have utilized various types of transformations and equations which can be validated with several statistical techniques. Most dose-response analysis methods 1) do not accurately describe data at the extremes of doses and 2) do not provide a proper statistical test for the difference(s) between two or more dose-response curves. Consequently, results of dose-response studies are analyzed and reported in a great variety of ways, and comparison of results among various researchers is not possible. The objective of this paper is to review the principles involved in dose-response research and explain the log-logistic analysis of herbicide dose-response relationships. In this paper the log-logistic model is illustrated using a nonlinear computer analysis of experimental data. The log-logistic model is an appropriate method for analyzing most dose-response studies. This model has been used widely and successfully in weed science for many years in Europe. The log-logistic model possesses several clear advantages over other analysis methods and the authors suggest that it should be widely adopted as a standard herbicide dose-response analysis method.
Article
The responses of herbicides applied singly are used in calculating the "expected" response when they are combined. The expected response for a combination is obtained by taking the product of the percent-of-control values for herbicides applied alone and dividing by (100)ⁿ⁻¹ where n is the number of herbicides in the combination.
Article
Dinitroaniline-resistant annual bluegrass (Poa annua L.) has been reported in several states; however, there are no standardized screening methods for detecting resistance. Research was conducted to evaluate screening techniques (Murashige and Skoog [MS] media, filter paper, hydroponics, and soil based) to detect herbicide resistance to dithiopyr, prodiamine, and pendimethalin in a suspected resistant ecotype of annual bluegrass from Chattanooga, TN (Chattanooga). A senstitive ecotype from Fresno, CA (Control) was also tested. All the bioassays were able to diagnose the ecotype from Chattanooga as resistant to prodiamine and pendimethalin. However, the degree of resistance was highly variable between bioassays. In hydroponics, the amount of prodiamine required to inhibit Chattanooga growth by 50% was 26 times more than Control. Comparatively, in MS media the amount of prodiamine required to inhibit Chattanooga growth by 50% was 80 times more than Control. Minor dithiopyr resistance from the Chattanooga ecotype was detected by the hydroponics, filter-paper and soil-based bioassays. Hydroponics provided the most rapid diagnosis of resistance, accessing resistance for a mature plant in 10 d. The MS-media bioassay had the least amount of confounding variables. These findings highlight the potential variation in results that can occur in mitotic-inhibiting herbicide resistance detection simply on the basis of how plant samples are assayed.
Article
Uptake and metabolism of propanil were measured in both susceptible (S) and resistant (R) biotypes of Jungle-rice, Echinochloa colona (L.) link at different growth stages. Results showed that there was no significant difference in uptake between S and R biotypes of E. colona at any given growth stage, but that uptake was significantly reduced at older plant growth stages in all biotypes studied. Metabolism of propanil was more rapid in R biotypes than in S biotypes at all growth stages studied. Specific and total aryl acylamidase activity, responsible for the first stage of propanil metabolism, was higher in R biotypes than in S at all growth stages, but declined to about 50% of the maximum at older growth stages, confirming the importance of this enzyme in conferring resistance to this herbicide. The area of necrosis that developed around a single drop of propanil deposited on the adaxial leaf surface was used to assess the degree of propanil resistance; it was found that resistance increased at older E. colona growth stages in contrast to the rate of propanil metabolism and amidase activity. Treatment of leaves with the amidase inhibitors, carbaryl or piperophos, simultaneously with propanil, caused a decrease in resistance at growth stages where amidase activity was greatest. This treatment was less effective at older growth stages. These results show that, in E. colona, propanil metabolism is important for conferring resistance in younger plants (four-six-leaf stage). It is suggested that restricted uptake confers resistance in older plants.
Article
Excessive persistence of imazethapyr has been responsible for injury to corn grown after soybean. Factors implicated in corn injury reported from certain parts of the main corn-producing region in South Africa were: leaching of herbicide to deep soil layers during the season of application, followed in the next season by capillary movement to the root zone of corn, and increased bioactivity of herbicide residues following liming of fields. Bioassays were employed to determine to what extent imazethapyr leached in a soil that typically contains less than 10% total clay and 0.1% organic C in the 0- to 300-mm zone and to assess the role of pH and liming in the bioactivity of the herbicide. Undisturbed soil columns were collected in polyvinyl chloride pipe for the leaching experiment. In the greenhouse, the equivalent of 40 g ai/ha imazethapyr was applied on the column surface, followed by leaching with simulated rain of 25 or 50 mm. Leaf area measurements of the test species rapeseed showed that the herbicide was readily leached to at least 30 cm at both water regimes and that it subsequently moved upward in the soil, with evaporation as the driving force. In the other bioassay, the soil was ameliorated with different amounts of Ca(OH)(2) or CaCO3 to adjust pH levels to between 5.7 and 7.1 These soil samples were each treated with imazethapyr at rates equivalent to 1.8, 3.75, 7.5, 15, and 30 g ai/ha. The growth response of the test species indicated that where Ca(OH)2 was applied, the bioactivity of imazethapyr in most instances was significantly greater than where CaCO3 was used. At all the imazethapyr rates, the activity of the herbicide increased significantly with an increase in pH from 5.6 to 6.5 where Ca(OH)(2) was used, but with CaCO3 activity was significant only at 15 and 30 g ai/ha. Changes in imazethapyr adsorption and in the organic matter in the soil were not monitored, but it is suggested that the increase in herbicide activity caused by Ca(OH), may be due to the degradation of organic matter in the soil or to desorption of the herbicide, which would render the herbicide more available for uptake. These effects, if they do occur, are likely to be of significance for herbicide adsorption only in soil with very low organic matter content. Results indicate that imazethapyr could leach easily in coarse-textured soils low in clay and organic matter content and that the type of lime used on those soils may influence the bioactivity of the herbicide.
Article
Advances in statistical software allow statistical methods for nonlinear regression analysis of dose-response curves to be carried out conveniently by non-statisticians. One such statistical software is the program R with the drc extension package. The drc package can: (1) simultaneously fit multiple dose-response curves; (2) compare curve parameters for significant differences; (3) calculate any point along the curve at the response level of interest, commonly known as an effective dose (e.g., ED30, ED50, ED90), and determine its significance; and (4) generate graphs for publications or presentations. We believe that the drc package has advantages that include: the ability to relatively simply and quickly compare multiple curves and select ED-levels easily along the curve with relevant statistics; the package is free of charge and does not require licensing fees, and the size of the package is only 70 MB. Therefore, our objectives are to: (1) provide a review of a few common issues in dose-response-curve fitting, and (2) facilitate the use of up-to-date statistical techniques for analysis of dose-response curves with this software. The methods described can be utilized to evaluate chemical and non-chemical weed control options. Benefits to the practitioners and academics are also presented.