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STRUMENTI
PER LA DIDATTICA E LA RICERCA
– 137 –
Filippo Bussotti, Mohamed Hazem Kalaji,
Rosanna Desotgiu, Martina Pollastrini,
Misurare la vitalità delle piante
per mezzo della fluorescenza
della clorofilla
Firenze University Press
2012
Misurare la vitalità delle piante per mezzo della fluorescenza
della clorofilla / Filippo Bussotti, Mohamed Hazem Kalaji,
Karolina Bosa. – Firenze: Firenze University Press, 2012.
(Strumenti per la didattica e la ricerca ; 137)
http: //digital. casalini. it/9788866552161
ISBN 978-88-6655-215-4 (print)
ISBN 978-88-6655-216-1 (online PDF)
***
Certificazione scientifica delle Opere
-
della casa editrice. Per una descrizione più analitica del processo di referaggio si rimanda ai
Consiglio editoriale Firenze University Press
Punta, A. Dolfi, V. Fargion, S. Ferrone, M. Garzaniti, P. Guarnieri, G. Mari, M. Marini, M.
Verga, A. Zorzi.
© 2012 Firenze University Press
Università degli Studi di Firenze
Firenze University Press
Printed in Italy
Fluorescencja chlorofilu w badaniach stanu fizjologiczne-
go roślin
We are all very ignorant,
but not all ignorant of the same things. . .
Fluorescence is red and beautiful
(Govindjee, 1995)
“Il calabrone entra nella stanza illuminata, va a baere velo-
cemente contro la lampada, le pareti, i mobili. Dopo un pò si
acquaa per riprendere forze. Ricomincia contro la lampada,
le pareti, i vetri, e daccapo la lampada. Inne cade sul tavolo
zampe all’aria, la maina dopo è secco, leggero, morto. Non
ha capito niente, ma non si può dire che non abbia tentato”
(Ennio Flaiano)
capitolo –
nome autore
– sezione
Indice
9
11
1
La fotosintesi 13
2
a 33
3
Pulse Amplitude Modulated) 47
4
transient O-J-I-P 55
5
a 73
6
77
7
81
8
93
9
Applicazioni 107
113
131
Prefazione
Esiste un crescente interesse per i principi e le applicazioni pratiche del-
la fluorescenza della clorofilla a, da parte di studenti e di giovani ricerca-
ecofisiologia vegetale più dinamiche e in costante evoluzione, sia dal punto
-
diche. Si tratta, infatti, di metodiche semplici, veloci, non invasive e relati-
vamente poco costose.
-
dei processi fisiologici che ne costituiscono i fondamenti, possono esse-
re piuttosto complessi e richiedono uno sforzo di studio e comprensione
-
-
nerale, alle tematiche relative alla fluorescenza della clorofilla a per studen-
Gli argomenti sono esposti in maniera ordinata, affrontando progressiva-
mente il funzionamento dei meccanismi fisiologici legati alla cattura della
luce e alla fase luminosa della fotosintesi, i principi della fluorescenza in-
dotta, le diverse tecniche di misura e i parametri ad esse correlati, i concetti
e le relative applicazioni.
10
Misurare la vitalità delle piante per mezzo della uorescenza della clorolla
-
-
esperienze condotte dal gruppo di lavoro italiano, sia nel campo della fluo-
-
nate le esperienze didattiche maturate durante i corsi di aggiornamento
partecipato numerosi giovani che ci hanno trasmesso entusiasmo e voglia
fluorescenza diretta, che con infinita pazienza e lunghe discussioni ci ha
introdotto ai segreti della fluorescenza diretta e del JIP-test.
Ringraziamo inoltre la collega e amica Angeles Calatayud (IVIA, Valen-
-
cativamente il testo in varie parti.
Abbreviazioni
Vengono qui presentate le abbreviazioni di uso comune, e quelle che si rife-
riscono a processi fisiologici generali. Per quanto riguarda le abbreviazioni più
specifiche indicanti i parametri delle diverse tecniche di fluorescenza (fluorescenza
modulata e diretta) si veda ai rispettivi capitoli.
ABS - (Absorption
ADP - adenosin-di-fosfato,
AL - luce attinica,
AM (Area) - area soprastante la curva di induzione della fluorescenza della
clorofilla,
ATP - adenosin-tri-fosfato,
C3 - piante con ciclo fotosintetico di tipo C3,
C4 - piante con ciclo fotosintetico di tipo C4,
CAM - piante con ciclo fotosintetico di tipo CAM (Crassulacean Acid
Metabolism),
Chla, b - clorofilla a e b,
cyt b6f6f,
D1 e D2 - proteine del centro di reazione del PSII,
DCMU - (3-(3, 4-diclorofenil)-1, 1-dimetilurea),
DI
eccitato,
ET (Electron Transport) - trasporto degli elettroni,
ETR (Electron Transport Rate) - efficienza del trasporto degli elettroni,
Fd - ferredossina,
Feo (Pheo) - feofitina,
FL - fluorescenza,
FM
FM
’ - fluorescenza massima in un campione adattato alla luce,
FNR - ferredossina NADP+ riduttasi
F0 -
F0
’- fluorescenza iniziale in un campione adattato alla luce,
Fq’ - differenza di fluorescenza fra FM
e ciascun punto F = FM
– F),
FR (far red) - radiazione luminosa nel rosso lontano,
FS (FT) - fluorescenza stazionaria (steady fluorescence),
FV (FM – F0
FV/F0 -
FV/FM – massima efficienza fotochimica primaria del PSII in un campione
12
Misurare la vitalità delle piante per mezzo della uorescenza della clorolla
GAP - gliceraldeide 3-fosfato,
LHCI
LHCII
ML - luce modulata,
NAD+ - nicotinammide-adenin-dinucleotide, forma ossidata,
NADH - nicotinammide-adenin-dinucleotide, forma ridotta,
NADP+ - nicotinammide-adenin-dinucleotide-fosfato, forma ossidata,
NADPH - nicotinammide-adenin-dinucleotide-fosfato, forma ridotta,
NPQ - quenching non fotochimico
OEC (Oxygen evolving complex-
ciato al PSII,
P680 - centro di reazione del PSII,
P700 - centro di reazione del PSI,
PAR (Photosynthetically Active Radiation) - radiazione fotosinteticamente
attiva,
PC - plastocianina,
PEP (PhosphoEnolPyruvate) - acido fosfoenolpiruvico (fosfoenolpiruvato),
PEPc
PGA - acido 3-fosfoglicerico,
PL - fotosintetsi lorda
PN - fotosintesi netta
PR - fotorespirazione
PPFD (Photosynthetic Photon Flux Density) - densità di flusso fotonico
fotosintetico,
PQ - plastochinone nello stato ossidato,
PQH2 - plastochinone nello stato ridotto (idroplastochinone),
PSI - Fotosistema 1,
PSII - Fotosistema 2,
QA, QB - plastochinone A e B,
qN - quenching non fotochimico,
qP - quenching fotochimico,
RC - centro di reazione,
RFd (fluorescence decrease ratio) - indice di funzionalità del PSII,
Rubisco
RuBP
SL - luce saturante,
TFM - tempo per raggiungere FM,
TD - tioredoxina,
JIP test - sistema di misura dei segnali di cinetica veloce nella curva di in-
duzione di fluorescenza,
Yield
Capitolo 1
La fotosintesi
1.1. Generalità
Questo capitolo illustra e sintetizza i principi ed i principali meccanismi
del processo fotosintetico. Le informazioni contenute provengono dai più
-
-
-
2-
22),
e il processo fotosintetico viene svolto nei tilacoidi e nello stroma. La cattu-
ra della luce, e tutti gli eventi connessi al trasporto degli elettroni, avvengo-
fase luminosa), mentre il ciclo
fase oscura)
avviene nello stroma. La Fig. 1.1 mostra uno schema riassuntivo delle rea-
-
14
Misurare la vitalità delle piante per mezzo della uorescenza della clorolla
termini generali, la fotosintesi può essere descritta per mezzo della seguen-
te reazione semplificata:
6CO2 + 12H2O + energia luminosa C6H12O6 + 6O2 + 6H2O
principali:
1.
2. -
tri di reazione eccitati alla catena di trasporto, attraverso la riduzione
3.
corso di reazioni di ossidoriduzione (redox) e produzione di ATP e
NADPH;
4. la sintesi e la dislocazione dei prodotti finali della fotosintesi.
1.2. Struttura dell’apparato fotosintetico
I cloroplasti (Fig. 1.2) sono organuli di forma lenticolare che, nelle pian-
te, si trovano nelle cellule delle foglie e di tutte le altre parti verdi come,
per esempio, i giovani fusti. I cloroplasti sono delimitati da una doppia
-
-
plessi chiamati antenne) nei fotosistemi (fotosistema 2 - PSII, e fotosistema
1 - PSI). Sono comprese anche le proteine delle catene di trasporto degli
6f), ed il complesso adi-
svolge la fase luminosa della fotosintesi, mentre il ciclo di Calvin-Benson
avviene nello stroma. I cloroplasti contengono DNA e RNA.
-
la plastocianina e la ferredossina) sono idrofile. I lipidi costituiscono il 35 –
circa il 75% di tutti i lipidi presenti. Sono inoltre presenti i fosfolipidi, che
-
15
La fotosintesi
Figura 1.1 – Le due fasi della fotosintesi e la loro interazione all’interno del cloroplasto. Gli
eventi luce-dipendenti (fase luminosa) si vericano nella membrana dei tilacoidi e portano
alla produzione di NADPH e ATP, utilizzati nel ciclo di Calvin, in cui si verica l’organi-
cazione della CO2 con la produzione di zuccheri (composti organici) (da hp://www.cartage.
org.lb/en/themes/sciences/BotanicalSciences/Photosynthesis/Photosynthesis/psoverview.
gif. Ridisegnato da Janusz Golik)
Figura 1.2 – Struura del cloroplasto nelle piante superiori (da: hp://www.plantandsoil.
unl.edu. Ridisegnato da Janusz Golik)
16
Misurare la vitalità delle piante per mezzo della uorescenza della clorolla
inoltre acidi grassi polinsaturi e tracce di steroli che conferiscono alla mem-
La fase luminosa della fotosintesi coinvolge i due fotosistemi PSI e PSII.
-
(chiamate LHCII - Light Harvesting Complex of PSII-
6f)
Oxygen Evolving Complex).
Figura 1.3 – Distribuzione dei complessi proteici nelle membrane dei tilacoidi (da Steen,
2003. Ridisegnato da Janusz Golik). PSI e ATP-sintasi sono distribuiti nella membrana a
contao con lo stroma, mentre il PSII non è a contao con lo stroma e il complesso cyt b6f
è in tue le parti dei tilacoidi.
1.2.1. I pigmenti fotosintetici nelle piante superiori
rappresentati dalle clorofille, che conferiscono il colore verde alle foglie,
e rappresentano circa il 4% del peso secco dei cloroplasti. Le piante ver-
di contengono due tipi di clorofilla: la clororofilla a (Chla), e la clorofilla b
(Chla.
17
La fotosintesi
Figura 1.4 – Formula di struura delle molecole di clorolla a e (da: hp://en.wikipedia.
org/wiki/Chlorophyll. Ridisegnato da Janusz Golik)
-
-
da 4 eterocicli (anelli contenenti anche atomi diversi da C) collegati da pon-
-
3 (nel caso della Chla) o
un gruppo CHO (nel caso della Chl
-
-
rendone un corretto orientamento.
18
Misurare la vitalità delle piante per mezzo della uorescenza della clorolla
Nelle alghe si possono trovare alcune varianti strutturali rispetto alla
forma tipo della clorofilla. Queste varianti sono indicate con lettere conse-
c (Chlc), e la clorofilla d (Chld)
-
Figura 1.5 – Spero di assorbimento dei principali pigmenti fotosintetici (da Szweykowska
1997. Ridisegnato da Janusz Golik)
energia di livello inferiore).
Le soluzioni di clorofilla e solventi organici presentano massimi di as-
a e a 435 nm e 642 nm per
la Chl (Fig. 1.5). Nei complessi pigmento-proteina, che si trovano nei clo-
maggiori.
-
-
19
La fotosintesi
rotenoidi, presenti nelle piante superiori e nella maggior parte delle alghe,
I carotenoidi sono pigmenti di colore giallo-arancio e comprendono il
-
a e
Chl
carotenoide, a 420 – 425 nm, 440 – 450 nm ed a 470 – 480 nm.
lipidi dei cloroplasti dalla fotossidazione, causata da alta intensità di radia-
molecole di clorofilla eccitate impedendo la formazione di singoletti di os-
sigeno e di ROS (Reactive Oxygen Species). Differentemente dalla clorofilla,
1.2.2. I complessi antenna del PSII
Pho-
tosynthetic Active Radiation
pigmenti fotosintetici (clorofilla e carotenoidi) avviene tramite i complessi
Nei complessi antenna i pigmenti fotosintetici sono legati a proteine. I
complessi antenna del PSII possono essere suddivisi in:
• antenne interne, costituite da complessi clorofilla-proteina, in particola-
antenne si trovano a contatto con il centro di reazione, a cui trasmettono
• antenna esterna tripartita, costituita da complessi pigmento-proteina
per la cattura della luce (LHCII) e contenenti clorofilla a (Chla), clorofilla
b (Chl) e xantofille.
a, Chl e le xantofille nel sistema antenna
e la parte centrale del PSII.
I complessi pigmento-proteina del LHCII sono dei trimeri, i cui mo-
nomeri sono costituiti da una catena peptidica di 232 amminoacidi, otto
molecole di Chla, sei molecole di Chl-
-
-
zione del PSII.
20
Misurare la vitalità delle piante per mezzo della uorescenza della clorolla
1.2.3. La struttura del fotosistema 2 (PSII)
-
-
-
-
teina D1 (cui si associa il plastochinone QB
associata al plastochinone QA.
Oxygen Evolving Complex). Esso si trova
-
-
si metallo-ossigeno da parte di agenti come il perossido di idrogeno) che
contiene 4 ioni di manganese in uno stato di ossidazione da +3 a +5, e uno
2 e
-
oggetto di studio.
1.2.4. Il complesso del citocromo (cyt b6f)
6f) rappresenta la connessione tra il PSII
per ridurre il NADP a NADPH, oppure verranno utilizzati per altre rea-
zioni di riduzione. Esso si compone di 4 unità secondarie: il 6, il
citocromo f; una p ed una unità secondaria det-
BH2 trasferisce la propria cop-
pia di elettroni al complesso del citocromo: un elettrone viene donato alla
6. La proteina ferro-
-
6 che lo veicola
B• che, in
rischio ossidativo derivante da QB-
chinone arriva al citocromo, un nuovo elettrone viene trasferito alla protei-
na ferro-zolfo. Al contempo un altro elettrone termina la riduzione della
specie radicalica (QB•) che si era appena formata mettendo a disposizione
una nuova molecola di idrochinone. In altre parole un chinone QB dapprima
viene ridotto a radicale QB• e successivamente viene ridotto a QBH2.
21
La fotosintesi
Figura 1.6 – Schema semplicato del usso energetico di eleroni nell’antenna del fotosiste-
ma 2 (PSII) (da Szweykowska, 1997. Ridisegnato da Janusz Golik).
Figura 1.7 – Struura del fotosistema 2 (PSII). LHCII = complesso antenna (Light Har-
vesting Complex) clorolla-proteine; CP43, CP47 = proteine che legano la clorolla alla
struura centrale dell’antenna del PSII; Feo = feotina; 17, 23 e 33: complessi polipeptidici
dell’OEC (Oxygen Evolving Complex); P680 = centro di reazione del PSII; D1 e D2
proteine del centro di reazione; QA = plastochinone A; H2QB: plastochinone B ridoo e suc-
cessivamente protonato; YD, YZ = tirosina associata rispeivamente alle proteine D1 e D2
(da Steen, 2003. Ridisegnato da Janusz Golik).
22
Misurare la vitalità delle piante per mezzo della uorescenza della clorolla
1.2.5. La struttura del fotosistema 1 (PSI)
stroma. Fa parte del PSI il complesso antenna LHCI, contenente Chla e Chl
da due molecole di Chla
-
-
condario del PSI, una proteina ferro-zolfo, una plastocianina (PC) e una
+ reduttasi (FNR), che cataliz-
za il trasferimento di elettroni da Fd a NADP+ (Fig. 1. 8).
1.2.6. L’ ATP-sintasi
-
so CF1-CF0. Il componente CF0
tilacoide. Esso trasporta protoni dallo stroma allo spazio interno dei tilacoi-
di (lumen) e forma un canale costituito da 6 catene proteiche appartenenti
ad almeno tre differenti tipi. Il componente CF1
-
tuato sul lato esterno del tilacoide a contatto con lo stroma (Fig. 1.9). Esso
contiene il centro catalitico per la formazione di ATP a partire da ADP.
1.3. I processi della fase luminosa della fotosintesi
1.3.1. L’assorbimento della radiazione fotosinteticamente attiva
Quando una molecola di clorofilla o di altri pigmenti fotosintetici si-
-
-
-
fluorescenza (vedi capitolo 2).
-
-
23
La fotosintesi
Figura 1.8 – Struura del PSI. LHCI = complesso antenna (Light Harvesting Complex)
clorolla-proteine, contenente polipeptidi Lhca 1-4; A, B … N = polipeptidi legati all’antenna;
P700 = centro di reazione del PSI; A0 = molecola di clorolla; A1 = llochinone (vitamina K1);
proteine ferro-zolfo FX, FA e FB; PC = plastocianina; Fd = ferredossina; FNR = ferredossina-ridut-
tasi (da hp://www.absoluteastronomy.com/topics/Photosystem. Ridisegnato da Janusz Golik)
Figura 1.9 - Struura dell’ATP-sintasi. CF0 = componente idrofobo, inserito nella membra-
na del cloroplasto; CF1 = componente idrolo, inserito nello stroma, dove avviene l’aività
catalitica. Le leere e i numeri indicano le subunità della struura (da Boyer, 1997. Ridise-
gnato da Janusz Golik).
24
Misurare la vitalità delle piante per mezzo della uorescenza della clorolla
avviene secondo il seguente schema:
P680*Feo P680+ + Feo–
nanosecondi).
A-
clorofilla ossidata P680+
ricevuto dalla tirosina (TyrZ), proveniente dal complesso di ossidazione
+ TyrZ+ P680).
1.3.2. Il trasporto degli elettroni non ciclico e fotofosforilazione
Si definisce lineare, o non ciclico, il meccanismo di trasporto degli elet-
Oxygen Evolving
Complex (OEC) presso il PSII, e si conclude con la riduzione degli accettori
finali oltre il PSI.
I primi eventi connessi al trasporto non ciclico degli elettroni avvengo-
-
-
teina D1, e un gruppo di proteine. Durante la fotolisi, da due molecole di
centro di reazione ossidato del PSII (+P680).
-
smo dello stato S”, e consiste in una serie di 5 stati (da S0 a S4), costituenti
-
ziali fanno avanzare il sistema fino allo stato di ossidazione S4. S4 produ-
ce O2
stato di ossidazione iniziale (S0
-
na tilacoidale, formando in tal modo la forza trainante del processo di
-
+-
sario per la sintesi di ATP) necessari per la riduzione della CO2 e per la
produzione di O2.
Esiste un carrier di elettroni, genericamente indicato come Yz, che opera
-
feofitina (Feo), che li trasmette ai due plastochinoni PQA e PQB.
25
La fotosintesi
Figura 1.10 - Schema rappresentante l’ossidazione del manganese nel processo di disso-
ciazione dell’acqua (stati di ossidazione del complesso del manganese, S0, S1, … S4, produ-
zione di idrogeno H+ e rilascio dell‘ossigeno (da: hp://upload.wikimedia.org/wikipedia/en/
thumb/e/e7/Oxygen_evolving. Ridisegnato da Janusz Golik)
A
–
-
chiuso (close center). La trasmissione degli elettroni da PQA a PQB (PQA
– PQB
PQA PQB
–-
-
da PQB viene formata una molecola di plastoidrochinone (PQB
2+
PQH2). Questa molecola si separa dalla proteina D1 ed entra nella porzio-
-
6
6f interagisce
così con il pool del plastochinone agendo come una pompa protonica. Ciò
-
26
Misurare la vitalità delle piante per mezzo della uorescenza della clorolla
Gli elettroni provenienti dal complesso del citocromo sono convogliati
-
forma ossidata (Cu++) ad una forma ridotta (Cu+). Questa proprietà permet-
te alla plastocianina di trasferire gli elettroni al centro di reazione ossidato
++ da parte
della PC avviene in un tempo che varia da 20 a 200 microsecondi.
elettroni tra trasportatori successivi, aumentando il loro potenziale di ossi-
doriduzione. La trasmissione di elettroni ad alta energia, lungo una catena
di trasporto situata fra i complessi PSII e PSI, e la successiva riduzione degli
pigmenti nelle antenne del PSI viene trasferita al centro di reazione P700 in
causa una separazione di carica fra il P700+ ossidato e gli elettroni eccitati.
Il centro di reazione ossidato del PSI (P700+
PC–-
rito ad una molecola di clorofilla (A0) che funge da accettore iniziale, ridu-
cendola ad A0
–
nel P700. Gli elettroni ad alta energia, nei successivi 50 picosecondi, ven-
gono trasferiti lungo una catena di trasportatori, che comprende A1 (fillo-
chinone, proteina K1) ed una serie di proteine ferro-zolfo, fino a ridurre la
-
-
sina NADP+ riduttasi (FNR), che catalizza il trasferimento di elettroni da
Fd a NADP+ per produrre NADPH, prelevando un protone dallo stroma. Il
-
di. La reazione di riduzione del NADP+ può essere riassunta in:
NADP+ + 2e– H+ + NADPH
Durante il trasporto non ciclico degli elettroni, si verifica un gradiente
-
-
guente produzione di ATP, proporzionalmente alla intensità e alla velocità
del trasporto degli elettroni. Un gradiente protonico troppo elevato può
6
il loro trasporto al PSI.
-
+ sono sintetizzati in un diagram-
27
La fotosintesi
ma noto come “Schema Z” (Fig. 1.11). Il trasporto degli elettroni avviene
da sinistra a destra nel grafico tramite la riduzione di accettori successivi,
-
te rappresenta la perdita del potenziale di ossidoriduzione (potenziale re-
eccitati dalla luce. Le frecce verticali rappresentano i centri di reazione ec-
citati P680 e P700.
Figura 1.11 – “Schema Z”, rappresentazione schematica delle fasi e dei processi del tra-
sporto fotosintetico degli eleroni (da hp://www.life.illinois.edu/govindjee/, Govindjee and
Wilbert Veit 2010). Tyr: tirosina. Chl P680, Chl P700: centri di reazione rispeivamente
dei fotosistemi PSII e PSI. Chl P680* e Chl P700*: centri di reazione dei due fotosistemi allo
stato eccitato. Pheo: feotina. QA e QB: molecole di plastochinone A e B. PQ: pool dei plasto-
chinoni. Cytf: citocromo f; Cytb6: citocromo b6 nella forma ad alta (H) e bassa (L) energia.
PC: plastocianina. A0: molecola di clorolla, acceore primario di PSI. A1: vitamina K. FX,
FA e FB: proteine ferro-zolfo. FD: ferredossina. FNR: ferredossina NADP+ riduasi per la
formazione di NADP+ (Spiegazione dei processi nel testo).
1.3.3. Il trasporto ciclico di elettroni
trasporto ciclico e dalla fotofosforilazione associata. Il trasporto ciclico si
+
in condizioni di eccessiva radiazione luminosa. Questa via alternativa in-
28
Misurare la vitalità delle piante per mezzo della uorescenza della clorolla
6f e la plastocianina. Anziché ridurre il NADP+,
6f consentendo il trasferimento
nuovamente al centro di reazione P700+.
Questo processo può essere ripetuto, aumentando ogni volta il gradien-
te protonico fra il lumen dei tilacoidi e lo stroma. Ciò permette la sintesi di
ATP da parte del complesso ATP-sintasi (fotofosforilazione ciclica).
Tramite il trasporto di elettroni non ciclico vengono sintetizzati
Figura 1.12 – Trasporto e trasformazione dell’energia luminosa nei cloroplasti. PSII e PSI:
fotosistema I (centro di reazione P680) e II (centro di reazione P700). OEC: oxygen evolving
complex. QA e QB: sito del plastochinone A sulla proteina D2, e del plastochinone B sulla
proteina D1. PQ e PQH2–: plastochinone e plastochinolo (forma ridoa del plastochinone).
PC: plastocianina. Fd: ferredossina. Td(ox) e Td(red): forma ossidata e ridoa della tiore-
dossina. LHCII e LHCI: Light Harvesting Complex al PSII e al PSI. SOD: superossido
dismutasi. Aa: acido ascorbico. Apox: ascorbato perossidasi. MDHA: monodeidro-ascorbato.
Fch: uorescenza della clorolla. RH: potenziale interno di riduzione.
1.3.4. Il trasporto pseudociclico di elettroni e fosforilazione
pseudociclica
La fosforilazione pseudociclica e il trasporto pseudociclico degli elet-
PSI non vanno a ridurre il NADP+, ma riducono delle molecole di ossige-
29
La fotosintesi
– + 2O2 2O2
–
noto anche come reazione di Mehler, e comporta la formazione di anioni
2O2
– (radicale perossido) e, in una fase successiva, di H2O2. Queste sostanze
chimiche fanno parte delle cosiddette ROS (Reactive Oxygen Species), e sono
2.
Una sintesi complessiva delle reazioni che si verificano nella fase lumi-
1.4. Il ciclo di Calvin-Benson e la ssazione di CO2 (la "fase oscura
della fotosintesi")
viene utilizzata per la sintesi di ATP e NADPH. Questi due prodotti del-
la fase luminosa sono utilizzati per la sintesi degli zuccheri, a partire da
CO2 e H2O, nel ciclo di Calvin-Benson. Il ciclo di Calvin-Benson (detto an-
che “fase oscura” perché consiste di reazioni enzimatiche non dipendenti
2) e la sintesi
-
-
-
-
-
sintesi degli zuccheri e, al termine del ciclo stesso, viene ricostituito il pro-
dotto di partenza (RuBP).
molecole vengono ridotte ottenendo 6 molecole di gliceraldeide-3-fosfato
una molecola di glucosio occorrono 6 molecole di PGA), mentre le altre 5
vanno a riformare il RuBP per la cattura di una successiva molecola di CO2.
30
Misurare la vitalità delle piante per mezzo della uorescenza della clorolla
Gli zuccheri prodotti possono essere utilizzati per la sintesi di saccaro-
sio, amido, e molti altri composti organici. Nella maggior parte delle piante
i primi prodotti della incorporazione di CO2 nel ciclo di Calvin-Benson so-
-
Questo prodotto alimenta il processo della fotorespirazione, con un consu-
respiratorio, dipendente dalla luce. Attraverso vari passaggi, partendo da 2
molecole di fosfoglicolato, viene formato acido glicerico e CO2 con dispen-
-
ha una duplice funzione: (i) consente di mantenere una elevata concentra-
zione di CO2
2-
Reactive Oxygen Spe-
cies
Alle condizioni standard (temperatura di 25 °C, con 21% di O2 e 0, 039%
di CO2
più elevata per la CO22
intracellulare di CO2
Per effetto della maggiore concentrazione atmosferica di O2 rispetto alla
CO2-
-
-
lazione diminuisce per effetto della rallentata rigenerazione di RuBP.
1.4.1. La fotosintesi C4
la fissazione della CO2
-
2 avviene nelle cellule
-
31
La fotosintesi
nelle piante C4, hanno una particolare anatomia, detta anatomia Kranz. In
-
guente rilascio di CO2.
Ci sono tre differenti meccanismi usati dalle piante C4 per trasporta-
la PEPC. Queste vie sono note come NAD-ME, NADP-ME e PEPCK, a se-
-
La CO2
-
lule la concentrazione di O2
fotosintetica. La fotosintesi netta (PNL– PR), dove PL-
tosintesi lorda e PR
meglio la CO2-
2 vie-
-
tal modo le piante C4 sono in grado di fotosintetizzare anche in condizioni
Crassulacean
Acid MetabolismCrassulaceae. Allo scopo di li-
-
vacuoli. Durante il giorno, in modo simile alle piante C4, il malato viene
2
Capitolo 2
La fluorescenza della clorofilla a
2.1. Cosa è la uorescenza
La luce raggiunge la superficie delle foglie (o di altri recettori fotosin-
-
menti fotosintetici, e soprattutto dalla clorofilla. Questi pigmenti sono or-
fotosistemi (PSII e PSI), e utilizzata per alimentare le reazioni fotochimiche.
-
-
gendo il centro di reazione, viene riemessa sotto forma di fluorescenza. La
Energia assorbita = attività fotochimica + perdita per calore + perdita per
fluorescenza
-
-
livello superiore di eccitazione energetica formando un singoletto. Il livello
-
-
so. La clorofilla può passare da uno stato di eccitazione superiore ad uno
34
Misurare la vitalità delle piante per mezzo della uorescenza della clorolla
stato inferiore, con un trasferimento interno di energia. Questa transizione
–15s). In un tempo appe-
na più lungo (10–13
clorofilla tende a tornare rapidamente (circa 10–9-
max = 685 nm).
fotochimiche).
La fluorescenza deriva sempre da una perdita di energia allo stato inferio-
-
-
renza si chiama “Stokes shift”. Il picco massimo di emissione di fluorescenza
-
tro di fluorescenza si estende fino a 800 nm (Krause e Weis, 1984).
Mediamente nella foglia la Chla.
molecole di Chla
della clorofilla a viene trasferita alla clorofilla b
Gli studi sulla fluorescenza della clorofilla hanno utilizzato diversi ini-
-
-
care il trasporto degli elettroni oltre il QA, e tramite il congelamento alla
-
fotosistemi (Strasser et al., 2004). Alla temperatura di 77 K ci sono tre mas-
simi nello spettro di emissione della fluorescenza: a 685, a 695 e a circa 735
nm. I primi due provengono da PSII, mentre il picco a 735 nm proviene dal
yieldF
come il rapporto fra il numero di fotoni di fluorescenza emessa e il nume-
formula:
Dove:
Fyield) della fluorescenza della clorofilla,
f
35
La uorescenza della clorolla a
Figura 2.1 – Ripartizione della luce assorbita dalla foglia. PAR: radiazione fotosinteticamen-
te aiva. UV: radiazione ultra-violea. FR: radiazione rosso lontana (far red). IR: radiazione
infrarossa.
Figura 2.2 – Cambiamenti dei livelli energetici in una molecola di clorolla dopo aver
assorbito la luce, e ritorno allo stato energetico di base (da: hp://en.wikipedia.org/wiki/
Image:Pistates.jpg. Ridisegnato da Janusz Golik).
36
Misurare la vitalità delle piante per mezzo della uorescenza della clorolla
p
d
-
valutare lo stato fisiologico dei campioni fotosintetici esaminati. La fluo-
rescenza può essere usata anche come metodo indiretto per stimare il
-
-
tensità e composizione note, di un campione fotosintetico precedentemente
emessa spontaneamente da un campione fotosintetico nelle condizioni re-
metodi di fluorescenza attiva, largamente impiegati nelle indagini terrestri.
La fluorescenza passiva viene invece usata nelle indagini di remote sensing.
La fluorescenza attiva della clorofilla viene misurata con tecniche sem-
plici, non invasive e veloci (a seconda della metodologia usata una misu-
risposte consente lo studio delle reazioni della fase luminosa e le loro inte-
razioni con le reazioni enzimatiche del ciclo di Calvin-Benson. Il sincroni-
del processo fotosintetico (Van der Tol et al., 2009).
Figura 2.3 – Spero di emissione della uorescenza della clorolla (da Krause e Weiss, 1984.
Ridisegnato da Janusz Golik)
37
La uorescenza della clorolla a
-
rettamente o indirettamente, informazioni su tutti i momenti della fase lu-
-
-
2.2. L’induzione della uorescenza nella clorolla a
-
zione luminosa si osserva un forte incremento della fluorescenza fino ad
un picco massimo, dopo di che la fluorescenza decresce lentamente fino a
-
studioso che per primo lo ha descritto. La fluorescenza massima viene rag-
giunta in meno di 1s e indica la riduzione del pool dei plastochinoni (chiu-
reazioni enzimatiche necessarie alla sintesi di ATP, NADPH e la riduzione
della CO2
-
-
-
–2
s–1) inizia, nel corso di alcuni ns, la prima fase della fluorescenza indotta.
determina la fluorescenza iniziale (F0-
0 e FP-
namento dei donatori e accettori di elettroni nel PSII, e la efficiente connes-
Conseguentemente alla eccitazione del centro di reazione PSII, un elet-
trone ad alta energia riduce una molecola di feofitina (Feo–). Successivamen-
A (il plastochinone connesso alla proteina D2),
A
–-
38
Misurare la vitalità delle piante per mezzo della uorescenza della clorolla
termine si osserva un leggero declino della fluorescenza stessa da I a D, ri-
flettendo la parziale riossidazione di QA-
ne verso QB
(accettore secondario associato alla proteina D1). Ciò consente
il trasferimento consecutivo di elettroni eccitati dalla Feo al QA (Fig. 2.5). Le
-
6f, accettori del PSI) vengono successivamente ridot-
ti fino a che, attraverso molteplici turn-over, tutti i centri di reazione sono
di tutti i centri di reazione (che avviene in un tempo compreso fra 0,5 e 1 s),
-
complessivo del plstochinone del PSII (Krause e Weis, 1991).
rapido trasferimento di energia dal PSII al PSI, mentre aumenta il gradien-
Figura 2.4 – Eeo Kautsky. L’esposizione del campione ad una luce saturante, dopo un
periodo di adaamento al buio, provoca l’aumento dell’intensità della uorescenza da un
livello basale (F0) ad un livello massimo (FM). Nel corso di un tempo variabile da alcuni
secondi a pochi minuti, l’intensità della uorescenza si stabilizza su un livello S (o T, FS
o FT). Nel contempo l’aività fotosintetica (misurata come PN, fotosintesi nea) raggiunge
gradualmente un livello in equilibrio con FS. FD = FM – FS; RFd =
decrease, vedi testo (modicato da Buschmann, 2004).
39
La uorescenza della clorolla a
stroma. Ciò consente alla fotofosforilazione di operare velocemente, e di at-
della FNR (ferredossina riduttasi NADP+) e il conseguente rallentamento
della produzione di NADP+-
nerazione di FNR (e il conseguente aumento di produzione di NADPH+)
-
steady, chiamato T o S) nel corso di
livello di emissione della fluorescenza (FS-
ni fotochimiche della fase luminosa, la produzione di energia (NADPH e
2.3. I principali parametri della uorescenza
F0 - uorescenza basale di campioni adattati al buio
Il parametro F0 (oppure: Fopen, Fzero o Fground) indica la perdita di ener-
0 rappresenta il primo punto di induzione di
Figura 2.5. Curva di induzione di uorescenza della clorolla (con permesso di Murkowski,
2002). Le varie fasi sono marcate sulla curva con le leere O, I, D, P e T.
40
Misurare la vitalità delle piante per mezzo della uorescenza della clorolla
-
lecole eccitate di clorofilla nella antenna del PSII, mentre il QA-
mente ossidato e tutti i centri di reazione del PSII sono aperti in attesa di
ricevere elettroni, e in assenza del decadimento (quenching) non fotochimi-
-
gia da LHCII al sito attivo del PSII. Secondo Lichtenthaler et al. (2004), F0
–2s–1. Alti valori
di F0
dalla dissociazione del LHCII dal nucleo di PSII (Havaux, 1993), indicando
valori di F0-
di F0 (fino al 30%).
FM - uorescenza massima di campioni adattati al buio
La fluorescenza massima (FM) si osserva, in un tempo generalmente in-
–2s–1, fino
–2s–1 nei fluorimetri di tipo PAM). Quando viene raggiun-
to FM tutti gli accettori di elettroni del PSII (plastochinoni) sono ridotti ed
-
soluto di FM0, dipende anche dal contenuto di cloro-
come proxy del contenuto di clorofilla. La diminuzione di FM
di stress, dal momento che registra una perdita di capacità nella riduzione
degli accettori del PSII.
Il rapporto fra i due estremi (FM/F0
in fisiologia. Nelle foglie sane esso ha un valore oscillante fra 4 e 5, ma vari
0 e/o la diminuzione di FM)
possono ridurre significativamente tale valore.
TFM - tempo per raggiungere il livello massimo di uorescenza della
clorolla (FM)
TFM indica il tempo, in ms, con cui il valore della fluorescenza cresce da
F0 a FM
TFM-
tori di stress possono aumentare il valore di TFM perché il trasporto degli
elettroni viene rallentato (Reigosa e Weiss, 2001).
41
La uorescenza della clorolla a
FV = (FM – F0) - uorescenza variabile di campioni adattati al buio
FV (o FM e F0 di campioni adattati al
V
-
FV/F0 - efcienza massima di scissione dell’acqua da parte del
donatore del PSII
-
-
-
reira et al., 2000). Teoricamente il valore di FV/F0 può variare da 0 a 1.
FV/FM - massima efcienza fotochimica primaria del PSII in un
campione adattato al buio
Il parametro FV/FM = [(FM – F0)/FM]
del PSII (maximum quantum yield of primary photochemistry in the dark adap-
ted state
-
V/FM può essere espressa concettualmente come rap-
P = costante di de-
N = costante di de-eccitazione non fotochimica,
Paillottin, 1976):
FV/FMPNP)
Teoricamente il valore di FV/FM può variare da 0 a 1, ma il valore ottima-
indica un danno o una ridotta efficienza del centro di reazione del PSII.
La riduzione di FV/FM-
degradazione della proteina D1 nel centro di reazione del PSII (Ohira et al.,
2005). La riduzione di FV/FMdown-
regulation
elettroni nella catena di trasporto (ETC) in presenza di una domanda li-
42
Misurare la vitalità delle piante per mezzo della uorescenza della clorolla
mitata di elettroni da parte del ciclo di Calvin (per es. eccesso di elettroni
-
in condizioni che determinano la chiusura stomatica), un flusso di elettroni
-
duzione dei ROS (Reactive Oxygen Species), (Hald et al., 2008).
-
non-photochemical quenching
turnover della
-
mento antenna eccitato. La fotoprotezione viene ripristinata dissipando (o
scavenger) dei ROS stessi, e soprattutto attraverso il ciclo delle
xantofille (Demmig-Adams e Adams III, 1996). In condizioni naturali di for-
-
-
-
tenna. La riduzione del valore di FV/FM
EPS = (A + Z)/(V + A + Z)
Badger, 2011).
AM (Area) - area soprastante la curva di induzione della uorescenza
della clorolla
Il valore del parametro AM
pool degli accettori di elettroni nel PSII (plastochinoni). Quanto più rapido
MM
accettori di elettroni implicati nel processo. Nel caso che il trasporto di elet-
M
ridotto (aumento di F0, e/o diminuzione di FM).
43
La uorescenza della clorolla a
FS (FT) - uorescenza stazionaria (steady uorescence)
Il parametro FS (o FT-
M, lo stato stazionario (FS) della
NADPH) da parte delle reazioni fotochimiche, e il suo impiego nelle rea-
zioni enzimatiche della fase oscura.
-
-
S indica una perdita di efficienza
Figura 2.6 – Esempio di curve di uorescenza in campioni a dierente stato siologico. Il
campione sano, rispeo a quello stressato, ha un livello di FM più basso e una uorescenza
stazionaria (Ft) più alta. Il campione deperiente ha un livello di uorescenza sempre più
basso (modicato da Rose e Haase, 2002).
44
Misurare la vitalità delle piante per mezzo della uorescenza della clorolla
FS/F0 - rapporto tra uorescenza stazionaria e uorescenza basale
-
Unità di misura
0, FM, FS
-
de dei fluorimetri utilizzati e dalle condizioni di illuminazione), o in mV.
Gli yield
range molto più ristretto. In genera-
rapporti adimensionali.
2.4. La misura della uorescenza
La fluorescenza della clorofilla viene misurata per mezzo di fluorime-
fluorimetri, che permettono di misurare la fluorescenza della clorofilla in
1. le misure sono effettuate in vivo e sono non invasive;
2.
3. possono essere applicati su tutte le parti verdi della piante (foglia, fusto,
frutti e semi immaturi);
4. possono essere applicati su piante mature, piantine appena germogliate
e su colture di tessuti;
5.
6. -
In commercio si possono trovare due tipi principali di fluorimetri, a
fluorescenza diretta e modulata. I fluorimetri a fluorescenza diretta lavora-
dark adapted-
lata sono in grado di lavorare in condizioni di luce (light adapted).
2.5. Adattamento al buio del campione fotosintetico
foglia o anche una sospensione di cloroplasti, ha lo scopo di ottenere la
45
La uorescenza della clorolla a
-
-
-
-
-
me altri meccanismi di fotoprotezione, vengono disattivati in pochi minuti
-
zione ad alte intensità luminose, vengono rimossi dopo 20 – 30 minuti di
-
stress prolungati) comincia ad essere rimossa dopo 40 minuti e vengono
impiegate da 30 a 60 ore per la sua rimozione completa (Lichtenthaler e
-
razione della proteina D1.
-
li le misure vengono condotte nel corso del giorno, venga rimossa solo la
-
ste una notevole differenza fra misure effettuate sulla stessa pianta prima
-
• uso di clip, che vengono utilizzate in tutte le condizioni di misura (cam-
-
struttiva (non invasiva) della fluorescenza;
• misurazioni effettuate di notte (metodo non distruttivo);
• trasferimento di piante coltivate in vaso in locali oscurati (metodo non
distruttivo);
•
-
li fino a 2 – 3 giorni dalla raccolta.
-
tosintesi nelle piante.
Capitolo 3
La fluorescenza modulata
(PAM: Pulse Amplitude Modulated)
3.1. Generalità
“Pulse Amplitude Modulated
la chiamarono “light addition technique
-
distinguere il concetto di “intensitàyield (o
assoluto che dipende dalle condizioni di illuminazione e può variare di
molti ordini di grandezza. Lo yield
riemessi. Nella fluorimetria PAM la sorgente di luce usata per misurare la
misura avviene solo sulla parte di fluorescenza generata dagli impulsi mo-
dulati. Perciò lo yield di fluorescenza relativo a tali impulsi può essere mi-
surato anche in presenza di una illuminazione di fondo, come per esempio
in condizioni di luce solare.
-
-
-
a fluorescenza modulata misura tre tipi di segnali:
48
Misurare la vitalità delle piante per mezzo della uorescenza della clorolla
1.
2. il segnale di fluorescenza indotto dalla luce attinica;
3. il segnale di fluorescenza indotta da impulsi di luce modulata. Il se-
altri segnali non indotti dagli impulsi luminosi.
La tecnica PAM consente una misurazione accurata della fluorescenza
0-
modulated light–2s–1), ma in grado di causare
max = 650 nm).
e la fluorescenza della clorofilla proviene principalmente dalla perdita di
0.
Prima della misura di F0
nel rosso lontano (far red, FR).
Successivamente viene somministrato un impulso di saturazione (SP =
saturation pulse) per un tempo di circa 0,8s. Si tratta di un impulso con in-
–2s–1max = 665 nm), che causa
-
-
scenza fino a raggiungere il valore massimo (FM).
0, viene
nuovamente somministrata una luce attinica con PPFD (Photosynthetic Pho-
ton Flux Density–2s–1max = 665 nm). Questa luce
provoca un aumento di fluorescenza fino a FP (picco di fluorescenza). Nei
minuti successivi la fluorescenza diminuisce nuovamente fino al livello co-
S (steady state fluorescence).
S
raggiunto FP), viene somministrato il secondo impulso che riduce nuo-
vamente gli accettori di elettroni del PSII. Questo impulso provoca un
nuovo aumento di fluorescenza fino al livello FM
a FM. La differenza tra FM e FM
di energia.
Successivamente, un impulso di luce nel rosso lontano (far red, FR) (30
–2s–1 a 720 – 730 nm), in assenza di luce attinica (van Ko-
0
, che
sono aperti in una foglia adattata alla luce. Si assume che in tal modo
preferenzialmente il PSI rispetto al PSII, rimuovendo così gli elettroni
dal sito degli accettori del PSII (ossidazione del pool dei plastochinoni
49
La uorescenza modulata (PAM: Pulse Amplitude Modulated)
Alternativamente F0
La Figura 3.1 mostra un tracciato di analisi di un campione fotosinte-
tico effettuata con fluorescenza modulata. La fluorescenza modulata con-
quenching
della fluorescenza stessa. Questa estinzione può avvenire a causa del tra-
-
“estinzione fotochimica” (photochemical quenching-
-
zione non-fotochimica” (non photochemical quenching, NPQ). Normalmente
circa 15 – 20 minuti, prima che si raggiunga lo stato di emissione costante
di fluorescenza (FS).
Figura 3.1 – Esempio di cinetica di uorescenza modulata (da Murkowski, 2002. Ridise-
gnato da Janusz Golik). ML: luce modulata; SP: impulso saturante; AL: luce ainica; FR:
impulso nel rosso lontano (far red); FP: uorescenza massima della clorolla soo impulso
di luce ainica; F0: uorescenza basale del campione adaato al buio; F0
’: uorescenza basale
del campione adaato alla luce; FM: uorescenza massima del campione adaato al buio; FM
’:
uorescenza massima del campione adaato alla luce; FT (o FS) uorescenza stazionaria del
campione adaato alla luce; ΔE = FM – FM
’; ΔF: FM
’ – FT.
50
Misurare la vitalità delle piante per mezzo della uorescenza della clorolla
3.2. I parametri della uorescenza modulata in foglie adattate alla luce
FM
’- uorescenza massima in un campione adattato alla luce
Questo parametro indica la fluorescenza massima indotta da un lampo
di luce saturante su un campione adattato ad una luce attinica di intensità
costante. Il valore di FM
M, perché in condizione di adattamen-
M
vengono determinati altri valori utili per il calcolo dei principali parametri.
M = FM – FM
- Indica la perdita di fluorescenza dovuta a eventi non
fotochimici
M
– FS
fotochimiche
F0
’ - uorescenza iniziale in un campione adattato alla luce
-
tamento alla luce attinica, la luce attinica stessa viene tolta e viene som-
ministrato un impulso di luce nel rosso lontano (far red
aperti. F0
0.
FV
’
= FM
’ – F0
’ - uorescenza variabile in un campione adattato alla luce
FV-
pione adattato alla luce attinica.
RFd = (FM – FS)/FS - uorescence decrease ratio, Indice di funzionalità del
PSII
Il parametro RFd fluorescence decrease ratio
fra le reazioni fotochimiche della fase luminosa e le reazioni enzimatiche del
-
-
lacoidi, e la velocità delle reazioni enzimatiche nello stroma dei cloroplasti
Fd mi-
sura il potenziale di attività fotosintetica. Lichtenthaler et al. (2005), utilizzan-
do le misurazioni RFd
Fd attorno a 2,5 o superiori indicano
una elevata attività fotosintetica, mentre valori inferiori a 1 indicano danni al
processo di assimilazione della CO2-
51
La uorescenza modulata (PAM: Pulse Amplitude Modulated)
voca in generale un aumento di FS cosicché, anche con un FM relativamente
costante, la differenza FM – FS si riduce, e di conseguenza anche il valore RFd.
Stress Adaptation Index), che indica come
le foglie riorganizzano il loro apparato fotosintetico durante lo stress.
Ap = 1 – (1 + RFd730) / (1 + RFd690)
Ap viene determinato mediante la misura di RFd simultaneamente a due
-
no una elevata attività fotosintetica, mentre con valori di 0. 1 – 0. 2 significa
-
le, 1988; Strasser, 1988).
3.2.1. Parametri relativi ai processi fotochimici
ΦPSII = (FM
’ – FS)/FM
’ = ΔF/FM
’ = Fq’/FM
’ - effective quantum yield
Questo parametro, detto anche semplicemente Yield (Y), consente di va-
-
glie adattate alla luce (Genty et al., 1989).
effective quantum yield
-
-
malmente NADP+PSII decresce in condizioni di limitato consumo
2
Lo Yield fornisce una misura del trasporto lineare degli elettroni e dà
PSIICO2
di fissazione di CO2 in assenza di fotorespirazione, Fig. 3.2). Tuttavia una
PSIICO2 può avvenire in certe condizioni di stress e può
determinare alterazioni nella fotorespirazione e nel trasporto pseudocicli-
co di elettroni (reazione di Mehler, Fryer et al., 1998).
-
ri FM
e FS
PSII-
tensità della luce, sono necessarie delle precauzioni durante la misura in
condizioni di illuminazione.
ETR= PSII*0. 50*0. 84*PPFD - Electron Transport Rate (μmol di elettroni
m–2 s–1)
ETR, o Linear Electron Transport Rate (J), indica la capacità fotosintetica
complessiva in vivo (Genty et al., 1989) e deriva dal parametro precedente
52
Misurare la vitalità delle piante per mezzo della uorescenza della clorolla
PSII). ETR misura la velocità del trasporto degli elettroni ad una
data intensità luminosa (Photosynthetic Photon Flux Density, PPFD, misurata
–2s–1
PSII
PSIICO2 (Valentini et al., 1995).
sopra indicata diventa:
PSII*PPFD*0,84*0,5
ETR viene usato come proxy per la fotosintesi in indagini di campo. Il
rapporto fra Electron Transport Rate e Assimilazione (ETR/A) indica la ri-
chiesta di elettroni per unità di CO2 assimilata.
Figura 3.2 - Relazione lineare fra ΦPSII () e ΦCO2 (resa quantica
di ssazione di CO2, in assenza di fotorespirazione) (da Genty et al., 1989. Ridisegnato da
Janusz Golik).
53
La uorescenza modulata (PAM: Pulse Amplitude Modulated)
EXC = FV
’/FM
’ = (FM
’ – F0
’)/FM
’ – massima resa quantica del PSII in un cam-
pione adattato alla luce
centri di reazione del PSII sono aperti (QA ossidato). La riduzione del valo-
-
ne delle xantofille.
qP = (FM
’
– FS)/(FM
’
– F0
’) - Quenching fotochimico (photochemical quenching)
Il photochemical quenching
QA
pertanto esprime il decadimento (quenching) della fluorescenza causato dal
-
ne chiusi (ridotti).
3.2.2. Parametri relativi ai processi non fotochimici
NPQ = (FM – FM
’)/FM
’ - Quenching non fotochimico (non photochemical
quenching)
-
mici, in particolare la dissipazione di energia sotto forma di calore.
-
si di dissipazione termica. Il quenching non fotochimico della fluorescenza
-
di NPQ consiste nel fatto che esso dimostra come il livello di eccitazione
potere riducente della catena di trasporto degli elettroni.
-
ne intercellulare di CO2-
M – FM
)/(FM – F0) = (FM – FM
)/FV
3.3. Realizzare un protocollo di uorescenza modulata
La misura dei parametri di fluorescenza modulata necessita la sommi-
nistrazione di impulsi luminosi di varia natura, intensità e durata. Alcuni
54
Misurare la vitalità delle piante per mezzo della uorescenza della clorolla
degli aspetti più delicati nel progettare un protocollo di misura, consistono
nella corretta scelta della lunghezza del tempo di illuminazione necessa-
rio per raggiungere il livello steady (FS) di fluorescenza, e del numero ed
M
. Nei moderni fluorime-
-
Si riporta a titolo di esempio un protocollo utilizzato per la misura di
parametri di fluorescenza modulata in foglie pioppo (Desotgiu, 2012, Tesi
1. -
ne di una clip fogliare;
2.
saturante (SP = saturation pulse) per un tempo di 0. 8 sec allo scopo di
-
scenza fino ad un livello FM;
3. dopo un tempo sufficientemente lungo da permettere alla fluorescenza
di tornare su livelli simili a F0 (t = 60 secondi, stimato in seguito a diver-
-
ta una luce attinica (LA) con PPFD (Photosynthetic Photon Flux Density)
= 300 mmol m–2 s–1;
4. dopo, ancora, un tempo sufficientemente lungo da permettere alla fluo-
S (t stimato di
-
te in modo da rilevare il nuovo livello di fluorescenza massimo (espres-
M
) stavolta riferito a foglie adattate alle condizioni di
luce attinica;
5.
(far red–2s–1 a 720 – 730 nm) in assenza di luce
attinica che ha consentito di rilevare il livello di fluorescenza F0
Capitolo 4
La fluorescenza diretta e l’analisi
del transient O-J-I-P
4.1. Generalità
La tecnica della “fluorescenza diretta” consiste nella misura diretta del
da 0 a P. Questa fase prende il nome di “transient fluorescente” (fluorescence
transient
misura del transient-
680 nm a 760 nm. Dalla traiettoria della curva di induzione della fluore-
fotosintetico del campione. Un tipico sistema di misurazione della fluore-
conti-
nuous excitation type chlorophyll fluorescence system). Si tratta di una sorgente
–2 s–1
650 nm e un rivelatore dotato di un filtro, che permette solo la registrazione
della clorofilla trasmettendo un segnale amplificato e un microprocessore
Nel primo secondo (400 – 800 ms) di illuminazione del campione, la
0) ad un livello massimo (FP). La
transient fluorescente (FT) co-
56
Misurare la vitalità delle piante per mezzo della uorescenza della clorolla
sì rappresentato mostra un andamento polifasico (Fig. 4.2). In particolare,
nella curva sono evidenti due punti di flesso principali. Il primo appare a
transient da il
nome al JIP-test, e descrive gli eventi fotochimici di riduzione e successiva
ri-ossidazione degli accettori di elettroni (Fig. 4.3).
transient (da un centinaio
Figura 4.1 – Rappresentazione della struura della lampada del uorimetro HandyPEA
(Hansatech Instruments Ltd, UK).
Figura 4.2 – Transient di uorescenza della clorolla (cinetica veloce), con indicazione delle
diverse fasi (Hansatech Instruments Ltd, UK).
57
La uorescenza diretta e l’analisi del transient O-J-I-P
-
-
di sono utilizzate per il calcolo dei vari parametri di fluorescenza, e sono
0LK), 2 ms (F4, o FJ),
30 ms (F5, o FI) e alla massima intensità (FP
, o FM).
dei tilacoidi (Strasser 1978, 1981). Questa teoria permette di ricavare sem-
-
-
pigmenti fotosintetici nel PSII (Strasser et al., 2004).
-
porto tra struttura e funzione degli apparati fotosintetici, e permette di va-
Figura 4.3 – Rappresentazione del transient di uorescenza (cinetica veloce), da R. J. Stras-
ser. Sono illustrati gli stati di riduzione del plastochinone nei vari step del transient.
58
Misurare la vitalità delle piante per mezzo della uorescenza della clorolla
-
4.2. Il transient uorescente
Il transient OJIP contiene tre fasi distinte (Fig. 4.4): O-J, J-I e I-P, che de-
scrivono tre differenti processi. La crescita del segnale di fluorescenza nella
-
-
me single turnover regionA
La fase J-I rappresenta la riduzione del pool dei plastochinoni, fino al
punto I che indica la completa riduzione di QB, cui segue la reossidazione
6f). (Joliot and Joliot
fase I-P rappresenta la riduzione degli accettori finali di elettroni (NADP e
Figura 4.4 – Relazione fra le diverse fasi della curva O-J-I-P e lo stato di ossidoriduzione
dei trasportatori di eleroni (modicato da Ceppi, 2009, tesi di doorato dell’Università di
Ginevra, CH).
59
La uorescenza diretta e l’analisi del transient O-J-I-P
NADP+ transient e
-
minata dai molteplici turnover di reazioni redox per giungere alla completa
chiusura dei centri di reazione (multiple turnover region).
transient e la linea superiore definita
da FM (S
catena di trasporto degli elettroni. N (numero di turnover) indica il numero
di volte che QA
massima di fluorescenza FM.
transient fluorescente permette di descrivere i processi e le
-
ni dalla eccitazione della clorofilla fino alla riduzione degli accettori finali
-
un transient proveniente da un trattamento rispetto ad un transient di con-
transient vengono normalizzati fra F0
e FM (F0 = 0, FM = 1), calcolando per ciascun punto t fra gli estremi 0 e P delle
t):
Vt = (Ft – F0)/(FM – F0)
Ad ogni punto delle curve normalizzate fra F0 e FM-
-
trattato – Vcontrollo
Si può seguire lo stesso procedimento effettuando la normalizzazione
solo su settori parziali della curva (per esempio, fra F0 e FJ). In tal caso il
segmento di curva considerato viene indicato in pedice:
(0-J) = V(0-J)trattato – V(0-J)controllo
fra F0 e FM
al punto t [Vt = (Ft – F0)/(FM – F0-
JI) indicano un rallentamento
60
Misurare la vitalità delle piante per mezzo della uorescenza della clorolla
4.3. La regione del turnover singolo (single-turnover region)
La regione del turnover
transient compresa fra i punti O e J (da 0,005 a 2 ms) e descrive il primo ci-
A
-
Figura 4.5 - Esempi di normalizzazione e sorazione di transient di uorescenza (FT). Nel
riquadro A sono presentati 3 FT, di cui uno rappresenta il controllo (C ), mentre gli altri 2
derivano da traamenti con diserbanti, che sono indicati in maniera generica come “traa-
mento A” e “traamento B”. Gli step O-J-I-P sono indicati sulle curve. Si può vedere che
i traamenti inducono l’aumento del valore di F0 e la diminuzione di FM. Ciò comporta la
diminuzione di FV/FM.
Nel riquadro C sono presentate le curve (V) normalizzate fra F0 e FJ, in cui ogni punto (Vt)
indica la uorescenza variabile relativa al punto t [V(0-J)t = (Ft – F0)/(FJ – F0)]. Le curve ΔV(0-J)
sono prodoe per sorazione “traato – controllo”, cioè: [(V(0-J)a, b) – V(0-J)c]. Il picco al punto
K (ΔV(0-J)K) rappresenta la Banda K, che indica la inaivazione del OEC (oxygen evolving
complex).
Nel riquadro D sono presentate le curve V(0-K) normalizzate fra fra F0 e FK, in cui ogni punto
[V(0-K)t] indica la uorescenza variabile relativa al punto t [V(0-K)t = (Ft – F0)/(FK – F0)]. Le
curve Δ V(0-K) sono prodoe per sorazione “traato – controllo”, cioè: [(V(0-K)a, b – V(0-K)c].
Il picco al punto L (Δv(0-K)L) rappresenta la Banda L, che indica la perdita di conneività del
complesso tripartito antenna principale - LHC - centro di reazione.
61
La uorescenza diretta e l’analisi del transient O-J-I-P
come VJ-
elettroni da QA a QBA-
dotto una sola volta fra F0 e FM
FMA
– a seguito del successivo trasporto di
elettroni. Perciò (1 – VJ
di elettroni.
-
tensità della fluorescenza, espressa graficamente con una depressione
indicata dalla lettera D (“dip”). La depressione D indica una parziale rios-
sidazione di QA
Figura 4.6 – Transient uorescente in fo-
glie traate con l’erbicida DCMU ((3-(3,4
diclorofenil)-1,1dimetilurea, Diuron, curve
in rosso), che blocca il trasporto degli elet-
troni da parte degli acceori del PSII. La
uorescenza massima viene registrata al
punto J. Le curve in verde rappresentano i
campioni non traati (R.J. Strasser).
Fig. 4.7 – Punto D (dip, o depressione) che
si manifesta talvolta dopo il punto J.
4.3.1 La banda K e la limitazione dell’Oxygen Evolving Complex
(OEC)
A seguito di uno stress da calore somministrato su dischi fogliari di Pi-
sum sativum, Srivastava et al. (1997) hanno mostrato che, oltre agli effet-
ti principali sul transient
transient diven-
-
Oxygen Evolving
Complex
62
Misurare la vitalità delle piante per mezzo della uorescenza della clorolla
-
mento della fluorescenza, dovuto alla riduzione del QA, continua la rios-
sidazione di QA
– a QA a causa del trasferimento di elettroni verso QB ma,
per la mancanza di elettroni da parte del donatore (OEC), la fluorescenza
si riduce formando il punto K. Il punto K nel transient fluorescente indica
lo stato del centro di reazione del PSII, e può essere considerato un indice
centro di reazione.
Il valore di K può essere determinato aritmeticamente con la sottrazione
transient normalizzato fra F0 e FJ (Fig. 4.5 C),
come di seguito riportato:
V(0-J)K = (F – F0)/(FJ – F0)
Si osserva che K non appare ad un tempo preciso (piuttosto che di picco
determinazione, un metodo grafico.
4.3.2 La banda L e la connettività
La struttura del PSII può essere descritta per mezzo di un modello tri-
connessa ad esso (core) e Light Harvesting Complex (LHC) (Srivastava et al.,
tran-
sient
la forma iniziale del transient-
2004):
C = (WE – W100)/W100(1 – WEVJ)
dove:
W100 = (F – F)/(F2ms – F)
W = 1 – [(F2ms – F]1/5
W100transient fluorescente norma-
lizzato fra O e J. WEtransient fluo-
rescente simulato, corrispondente al campione in assenza di connettività
63
La uorescenza diretta e l’analisi del transient O-J-I-P
grouping probability (P2G
di comunicazione energetica delle componenti dei fotosistemi. La connes-
grouping probability (P2G) (Strasser,
P2G = C(F0/FV)
-
la trasformazione della cinetica del transient da sigmoidale a esponen-
connettività.
transient normalizzati
fra F0 e F (Fig. 4. 5 D), e può essere espressa come:
V(0K)100 = (F – F)/(F300ms – F)
nel complesso tripartito del PSII.
4.3.3. La regione dei turnover multipli(multiple-turnover region)
La regione dei turnover
fra i punti J e P e riflette le reazioni multiple di ossidoriduzione attraver-
-
elettroni si crea una sorta di “ingorgo” che si traduce in un picco allo step I
Gli eventi fotochimici attorno al PSI possono essere espressi con il para-
I-P
(I-P) = (FM – FI)/(FM – F0) = 1 – VI
(I-P), dove
V(I-P) = (F(I-P) – FI)/(FM – FI)
64
Misurare la vitalità delle piante per mezzo della uorescenza della clorolla
con la formazione di PQB
2– da PQB
–-
ne del PQB
2– a plastoidrochinone (Tsimilli-Michael e Strasser, 2008). Queste
transient fra
4.4. Parametri del JIP-test
(ABS= ABsorption; TR= TRapping capacity; DI = DIssipation; ET = Electron
Transport; RE = Reduction of End acceptors).
I flussi possono essere espressi come yield
-
mentare un determinato flusso) o come probabilità.
Inoltre si hanno i flussi specifici (per centro di reazione, RC) e i flussi fe-
nomenologici per sezione trasversale del campione (per cross section, CS). La
indici di
vitalità. I flussi di energia e le relazioni fra i parametri sono schematizzati
nella Figura 4.8.
4.4.1. Parametri tecnici misurati e calcolati sul transient di
uorescenza
Valori originari del transient
F0 ≅ F50μs (F20μs)
FT -
FL ≡ F100μs-
ma tripartito LHCII-antenna-RC);
FK ≡ F300μsOxygen
Evolving System);
FJ ≡ F2ms - Fluorescenza a 2 ms (indica la riduzione del QA);
FI ≡ F30ms - Fluorescenza a 30 ms indica la riduzione del pool dei plastochi-
noni - QA e QB);
FM (FP = FM) - Fluorescenza massima (P, picco);
tFM - Tempo (in ms) necessario per raggiungere la fluorescenza massima;
AM - Area sopra la curva di induzione di fluorescenza.
Valori derivati e rapporti
FV ≡ Ft – F0 -
FV ≡ (FM – F0)
FV/F0 -
Vt = (Ft – F0)/(FM – F0) -
VJ = (FJ – F0)/(FM – F0)
65
La uorescenza diretta e l’analisi del transient O-J-I-P
VI = (FI – F0)/(FM – F0)
M0 ≡0 = 4(F300μs – F0)/(FM – F0) - Pendenza iniziale, calcolata rispetto
a F300 (in ms–1) del transient di fluorescenza normalizzato sulla fluorescenza
MG ≡ dVG/dt = 20(F100 – F0)/(FM – F0) - Pendenza iniziale calcolata rispetto
a F100 (in ms–1) del transient di fluorescenza normalizzato sulla fluorescenza
SS ≡ VJ/M0 - Area normalizzata sopra la fase O-J del transient (single turnover
events di riduzione del QA). Il valore minimo di SS-
no QA
V(0-J)300 = (F300μs – F50μs)/(F2ms – F50μs) -
nella fase F0-FJ.
V(0-K)100 = (F100μs – F50μs)/(F300ms – F50μs) -
0-FK
P2G = C (F0/FV) - Overall grouping probability (Strasser, 1978), maggiori parti-
colari nel paragrafo 4.3.
SM ≡ (AM)/(FM – F0) = AM/FV = EC/RC - Area normalizzata sopra la curva
OJIP (riflette multiple turnover events di riduzione del QA). Misura il con-
tenuto totale di trasportatori di elettroni (EC= Electron Carriers) per RC.
Questo parametro determina il numero di accettori di elettroni nel PSII, ri-
et al., 1996).
N ≡ (SM/SS) = SM M0 (1/VJ) -
riduzione del QA fra il tempo 0 e TFM,
V
AV = 1 – (SM/tFM) - FM,
SM/TFM - -
tervallo temporale da 0 a P;
ΔVI-P = (FM – FI)/(FM – F0) = (1 – VI) - Ampiezza della fase I-P.
4.4.2. Yield e probabilità (misurati al tempo 0, t=0)
P0 ≡ TRO/ABS = [1 – (F0/FM)] = FV/FM -
-
Pt ≡ FVt/FM - transient;
D0 ≡ DI0/ABS = 1 – P0 = (F0/FM)-
0 ≡ ET0/TR0 = (1 – VJ) - -
tro di reazione sia trasferito oltre il QA
–;
E0 ≡ ET0/ABS= [1 – (F0/FM)] 0 = P00 -
sporto degli elettroni;
Ro ≡ RE0/ET0 = (1 – VI)/(1 – VJ) = (FM – FI)/(FM – FJ)-
trone proveniente dalla catena di trasporto sia trasferito oltre il PSI per ri-
durre un accettore finale;
66
Misurare la vitalità delle piante per mezzo della uorescenza della clorolla
R0 ≡ RE0/ABS = [1 – (F0/FM)] (1 – VI) = 1 – FI/FM -
la riduzione di accettori finali oltre il PSI;
PAV = φP0 (1 – V
AV) = φP0 (SM/TFM)-
chimiche primarie.
4.4.3. Flussi di energia specica per centro di reazione (in unità
arbitrarie)
ABS/RC = M0 (1/VJ) (1/P0)-
RC/ABS = ChlRC/(ChlAntenna) = [1 – (F0/FM)]/(M0/VJ) = P0 (VJ/M0) - Centri di
-
proco di ABS/RC);
TR0/RC = M0 (1/VJ) - Flusso di energia (che riduce QA) catturato da un cen-
tro di reazione attivo (RC) (t = 0);
ET0/RC = M0 (1/VJ) ψ0 - Trasporto di elettroni oltre QA
– per RC (t=0);
DI0/RC = [(ABS/RC) – (TR0/RC)] - Dissipazione di energia totale per RC
(calore, fluorescenza e trasferimento ad altri sistemi), a t = 0;
RE0/RC = [M0 (1/VJ) (1 – VI)] - Flusso di elettroni destinati alla riduzione
degli accettori finali oltre il PSI, per RC (t=0).
4.4.4. Flussi fenomenologici (per sezione trasversale) (in unità
arbitrarie)
(ABS) di energia per sezione trasversale (Cross Section = CS).
ABS/CS-
1997; Strasser et al., 2000):
NP) Chl
PN = costante non fotochimica
-
0 e/o
a FM, per cui si usano le espressioni: ABS/CS0 (≈F0) e ABS/CSM (≈FM)-
spressione ABS/CSchl-
to con una misura di riflettenza della clorofilla. Più in generale, possiamo
X (dove CSX = CS0 o CSM o CSchl).
TR0/CSX = φP0 (ABS/CSX) - flusso di energia trattenuto per CS (t = 0);
ET0/CSX = φE0 (ABS/CSX) - trasporto degli elettroni per CS (t = 0);
DI0/CSX = [(ABS/CSX) – (TR0/CSX)] - flusso di dissipazione termica di ener-
gia per CS (t = 0);
67La uorescenza diretta e l’analisi del transient O-J-I-P
RE0/CSX = R0 (ABS/CSX) - riduzione degli accettori finali per CS (t = 0).
4.4.5. Densità dei centri di reazione (in unità arbitrarie)
RC/CSX = [P0 (VJ/M0) (ABS/CSX)] -
PSII (QA). Bassi valori indicano, al contrario, la presenza di centri di reazio-
ne inattivi, che non riducono il QA
centri di reazione inattivi sono definiti anche “silent centers
no alla dissipazione di energia sotto forma di calore. Si tratta di un mecca-
nismo di down-regulation
4.4.6. Indici di vitalità (in unità arbitrarie)
Structure Function Index (SFI)
SFIP ≡ (ChlRC/ChlTOT) φP0 0 - Gli indici struttura-funzione sono 2. Il primo,
SFIP
trasporto degli elettroni. Il secondo, SFIN
persa durante il trasporto fotosintetico degli elettroni.
SFIN ≡ [1 – (ChlRC/ChlTOT)] (1 – P0) (1 – 0)
P / SFIN.
Performance Index (PI)
0) e la conversione di tale
energia in trasporto di elettroni (ET0). Strasser et al. (2000) hanno introdotto
ABS) esprime la capacità
PI ABS =
RC) rispetto alla
clorofilla totale (ChlRC+ChlAntennaRC/ChlAntenna = RC/ABS.
Utilizzando i dati originali ed i parametri derivati del transient avremo:
PIABS0/FM)]/[M0/VJ] [(FM – F0) /F0] [(1 – VJ)/VJ]
Applicando ulteriormente il flusso RE (Reduction of End acceptorsR0/
(1 – R0)] avremo il Performace Index totale (PITOT), che esprime la capacità
68
Misurare la vitalità delle piante per mezzo della uorescenza della clorolla
alla riduzione degli accettori finali oltre il PSI.
PITOT ≡ PIABSR0/(1 – δR0)]
o, in altri termini
PITOT0/FM)]/[M0/VJ] [(FM – F0)/F0] [(1 – VJ)/VJ] [(1 – VI)/(1 – VJ)]
come segue:
PIABS(CS) = ABS/CS PIABS (dove ABS/CS = F0 o FM o Chl)
PITOT(CS) = ABS/CS PITOT (dove ABS/CS = F0 o FM o Chl)
-
zione ridotta, e (1 – pi) la frazione ossidata di un certo composto, e log[pi/
(1 – pi)] esprime il potenziale, o driving force, della corrispondente reazione
di ossido-riduzione.
Driving Forces (D. F. )
Estrapolando dalla chimica le inferenze sopra esposte, log(PI) può es-
sere definito come driving force (DF) totali per la fotosintesi del sistema os-
energetica, al tempo 0 (inizio del transient O-J-I-P).
DFABS ≡ log(PIABS) = log(RC/ABS) + log(Po/1 – Po) + log(Eo/1 – Eo)
E, similmente:
DFTOT ≡ DFABS + log(R0/1 – R0)
usando come riferimento il potenziale standard della reazione considerata:
DF = DFtreated – DFcontrol
4.4.7. Parametri conformazionali
I parametri conformazionali sono Sumk (somma delle costanti di de-
eccitazione fotochimica e non fotochimica), kP (costante fotochimica di
69
La uorescenza diretta e l’analisi del transient O-J-I-P
de-eccitazione) e kN (costante non fotochimica di de-eccitazione). Questi
(Sironval et al. 1981; Strasser 1978, 1981), e le espressioni ad essi relative
ND (dissipa-
FX (migrazione di energia
verso il PSI, o spill-over) [kN = kD + kF + kXkN = (ABS/
CS) kF (1/FM)].
P) esprime la capacità di ali-
kp =
(ABS/CS) kF {(1/F0) – (1/FM)}].
Infine, il valore complessivo della costante fotochimica e non fotochimica
kN + kP = (ABS/CS) kF (1/F0)].
Figura 4.8. Rappresentazione schematica della “cascata di energia”.
4.5. Protocolli di uorescenza diretta
-
satech Ltd. ) consentono di modificare le impostazioni e di creare dei pro-
70
Misurare la vitalità delle piante per mezzo della uorescenza della clorolla
intensità consentita dallo strumento stesso (generalmente attorno a 3000
–2s–1). Qualora si rischi di avere una misura “fuori
transient
gain-
pada. In tal modo si otterrà la massima omogeneità dei transient. Il “gain”
-
-
-
re FM
(per la durata di 5 min) e successivi impulsi saturanti (ogni 30 sec) di 3000
–2 s–1. Un altro protocollo, consistente in due impulsi satu-
–2 s–1), consente di misurare la velo-
tale catena si reossida parzialmente. La differenza di FJ può essere interpre-
tata come una misura del grado di reossidazione del pool del PQ nel corso
4.6. Le assunzioni del JIP-test
transient fluorescente dipende dalle assunzioni
-
re le assunzioni, oppure si dimentica che tali assunzioni non sempre so-
no state completamente provate sperimentalmente. Per fare un esempio,
quenching
-
1. -
segnale fluorescente del PSI può essere trascurato nella maggior parte
dei casi.
2.
-
re attività fotochimica.
3.
luce), un centro di reazione aperto del PSII (QA ossidato) ha una mini-
ma emissione di fluorescenza, mentre un centro di reazione chiuso (QA
71
La uorescenza diretta e l’analisi del transient O-J-I-P
ridotto) ha una emissione di fluorescenza massima. Si assume pertanto
-
tutto alla riduzione del QA, che determina la traiettoria complessiva del-
la curva OJIP.
4. Nonostante che il segnale di fluorescenza misurato provenga dal com-
,
-
5. I centri di reazione del PSII sono considerati indipendenti, non connessi
6. -
ce da non consentire variazioni significative dello stato fisiologico del
-
co rimane costante nel corso del transient.
7. A, così come il pool dei
8. Tutti i centri di reazione del PSII sono chiusi (ridotti) se soggetti ad un
impulso luminoso di sufficiente intensità. Perciò alla fine del transient
MP, tutte le
molecole QA sono considerati essere allo stato ridotto QA
–.
9. La capacità di trattenuta del flusso di elettroni rappresenta la frazione
-
+ QA. Non si ritiene
+ e
Feo– possa influenzare il valore di φP0.
10. A
ridotto una sola volta (turnover singolo) (Strasser e Strasser, 1995).
11. Il valore di F0 (o FM) indica il contenuto di clorofilla e rappresenta ap-
cross section).
Capitolo 5
Fotosintesi netta e fluorescenza della clorofilla
fase luminosa, ma non registra ciò che avviene nel ciclo di Calvin-Benson.
-
-
la fotorespirazione, nella riduzione dei nitrati, nella reazione di Mehler, nel
-
Di conseguenza la fluorescenza non riflette direttamente la performan-
netta (PN-
2
(Krause e Weiss 1991).
La fotosintesi può essere misurata per mezzo del consumo di CO2 o
dello sviluppo di O2, e vari strumenti (detti gas analyzer) permettono di
2 avviene nel ciclo di
Oxygen Evolving Complex (OEC), direttamente connessa con il funziona-
-
fotochimiche.
Anche se non necessariamente proporzionali, esistono relazioni misu-
2. La
fotosintesi netta può essere considerata come funzione delle seguenti va-
2
74
Misurare la vitalità delle piante per mezzo della uorescenza della clorolla
-
verso parametri di fluorescenza.
5.1. Campioni adattati alla luce
Nello studio dei rapporti fra fotosintesi netta (PN) e fluorescenza, viene
generalmente considerata la fluorescenza di campioni nello stato adattato
alla luce (misurata tramite la fluorescenza modulata) perché esprimono la
capacità “effettiva” di trattenere e trasportare gli elettroni.
PSIICO2 sono state trovate consideran-
2 atmosferica non costituisce
un fattore limitante, il principale target del trasporto di elettroni sia la ri-
duzione della CO2 stessa. Quando invece gli stomi sono chiusi (limitazione
stomatica come conseguenza di uno stress idrico), la CO2 nel cloroplasto
viene consumata e gli elettroni sono diretti verso destini diversi dal ciclo di
Calvin-Benson.
-
clorofilla sul medesimo campione (vedi par. 7.5), consentendo così analisi
integrate per lo studio dei fattori limitanti e della conduttanza del mesofil-
lo (gm
2, tuttavia la capacità di assimilare
2, ciò significa che
-
CO2-
ne del TPU (Triose Phosphate Use-
un metodo per il calcolo di gm (conduttanza di CO2 nel mesofillo).
Altri autori (Dai et al., 1992) hanno studiato le relazioni fra parametri
PSII2 (PN) per la deter-
Va -
pour Pressure DeficitPSII a fronte della
riduzione di PNPSII/PN) indica che una parte
CO2PN e ad
PN).
75
Fotosintesi netta e uorescenza della clorolla
Infine, il parametro ETR/PN-
troni viene destinato ad alimentare i processi fotosintetici.
5.2. Campioni adattati al buio
(dark adapted-
2
dark adapteddark
fluorescence-
fettiva), tuttavia ci sono evidenze che il declino di parametri misurati in
V/FM e PIABS, sia connesso al declino di PN
-
dizioni ecologicamente favorevoli ci sia una relazione fra efficienza poten-
ziale ed efficienza effettiva.
Reduction of End acceptors), che dipen-
dono dalla forma della traiettoria della fase I-P del transient, ha fornito uno
strumento che da informazioni sulla capacità della catena di trasporto nel
fornire elettroni per la riduzione della CO2. Desotgiu et al (2012) hanno
trovato una correlazione positiva fra i parametri RE della fase I-P e PN in
esperimenti su Fagus sylvatica e cloni di pioppo. I parametri RE, inoltre,
-
-
nel ciclo di Calvin-Benson rispetto agli elettroni utilizzati per la riduzione
e un alto rapporto PSI/PSII permette la rapida riduzione della ferredos-
Calvin-Benson.
Capitolo 6
Altri metodi fluorimetrici
6.1. Chlorophyll Fluorescence Imaging (CFI)
Chlorophyll
Fluorescence Imaging (CFI). Essa si avvale dei progressi della tecnologia nei
-
fine sono stati sviluppati dei sistemi modulari che permettono la misura
della fluorescenza in condizioni di luce naturale, illuminando il campione
-
-
eten, 2001). Sistemi di CFI sono stati sviluppati per essere usati sia ad alta
foglia o pianta intera. Applicazioni di remote sensing permettono di deter-
minare la fluorescenza della clorofilla anche a livello di paesaggio (Zarco-
Tejada et al., 2009).
La tecnica CFI consente di ottenere una panoramica della emissione di
fluorescenza da parte di singole cellule, foglie o piante intere, fornendo
informazioni sul loro stato di stress in maniera visiva, veloce, precisa e in-
tuitiva (Lichtenthaler e Miehé, 1997; Omasa, 1990; Calatayud et al., 2006).
Questa tecnica permette lo studio spaziale e temporale della eterogenei-
a numerosi fattori endogeni, e non può essere evidenziata con i sistemi
tradizionali che permettono solo misure puntiformi (Ellenson e Amudson,
-
sentata, pixel per pixel, per mezzo di immagini in falso colore, dove i vari
-
lata convenzionale: F0, F0
, FM, FM
and FS.
78
Misurare la vitalità delle piante per mezzo della uorescenza della clorolla
a viene indotta illuminando il campione
-
nera due tipi di fluorescenza: la fluorescenza della clorofilla nel rosso e la
-
durre immagini per mezzo di Charge Coupled Device Cameras (CCD, Chaer-
Laser-Induced Fluorescence
Imaging System) permette la cattura simultanea della emissione della fluo-
-
-
rofilla a
della fluorescenza della clorofilla, da sola o in relazione ai differenti rap-
porti (F440/ F690, F440/F740), possono essere utilizzati come indicatori di
-
rofilla. Altre tecniche CFI usate per lo studio dello stress nelle piante sono
la termografia (Chaerle e Van Der Straeten, 2000), la riflettanza (Nilsson,
Fig. 6.1 – Esempio di Chlorophyll Fluorescence Imaging (CFI) su foglia di peperone: i valori
riportati indicano il non-photochemical quenching (qN) misurato negli spot circolari (foto
concessa da A. Calatayud, IVIA, Valencia).
79
Altri metodi uorimetrici
6.2. Assorbimento del P700
-
-
alla ferredossina, eventualmente causando la riduzione del NADP e la
fissazione di CO2. Contrariamente al centro di reazione del PSII (P680) la
-
lontano (far red
-
catena di trasporto.
6.3. Fluorescenza ritardata (Delayed Fluorescence, DF)
La fluorescenza ritardata (DF, delayed fluorescence
-
tiche inizialmente stimolate da illuminazione (Strehler e Arnold, 1951;
Berden-Zrimec et al., 2010). Essa ha lo stesso spettro di emissione del-
la fluorescenza della clorofilla a, ma avviene con un tempo ritardato,
da pochi millisecondi ad alcuni minuti (Arnold e Davidson, 1954). DF
-
durante il primo secondo, seguito talvolta da un picco più o meno pro-
nunciato (Bertsch, 1962; Zrimec et al., 2005; Berden-Zrimec et al., 2010).
La maggior fonte di DF sono le retroreazioni nel PSII (Rutherford and
negative nei chinoni (QA e QB). Le componenti lente di DF hanno origine
80
Misurare la vitalità delle piante per mezzo della uorescenza della clorolla
A e QB. Il
-
morte non interferisce nella misura.
Capitolo 7
Strumenti disponibili sul mercato
commercio, per la misura della fluorescenza della clorofilla. Questo settore
-
delli aggiornati, atti a soddisfare le differenti esigenze e rendere più age-
vole e rapido il lavoro. Inoltre i rapidi progressi nella teoria e negli studi di
tenersi aggiornato consultando i siti dei costruttori. Gli strumenti maggior-
di fornire indicazioni relative anche ad altre ditte attive sul mercato scien-
7.1. Hansatech Instruments Limited
Strumenti per la misura della uorescenza diretta
Si tratta dei fluorimetri della serie PEA (Plant Efficiency Analyzer). Il ca-
-
–2s–1). Il rilevatore di fluorescenza, tramite un mi-
croprocessore, consente una misurazione precisa e rapida (risoluzione a
della curva, da F0 a FM-
82
Misurare la vitalità delle piante per mezzo della uorescenza della clorolla
-
anche alla riduzione del numero delle misure intermedie (da circa 1000 a
tramite Bluetooth anziché via cavo.
Strumenti per la misura della uorescenza modulata
Sono i fluorimetri modulati della serie FMS (FMS1 e FMS2). Consisto-
al campione. I due modelli possono essere usati in modalità stand alone,
comandati da un computer esterno su cui sono installati gli appositi pro-
anche in indagini di campo.
Strumenti multifunzione
in grado di effettuare contemporaneamente diversi tipi di analisi su un me-
desimo campione. m-PEA (Multi-Function Plant Efficiency Analyzer, Fig. 7.3)
-
neamente, la cinetica veloce (prompt fluorescence
820 nm e la fluorescenza ritardata (delayed fluorescence). Si tratta di un siste-
7.2. WALZ (Heinz Walz GmbH)
Effeltrich (Germany)
Fluorimetri modulati della serie PAM
Storicamente gli strumenti PAM della Walz sono i primi che hanno ap-
plicato e sviluppato il metodo Pulse Amplitude Modulation
-
cedenti portando una serie di miglioramenti sia nella parte elettronica che
83
Strumenti disponibili sul mercato
Figura 7.1 – Fluorimetro HandyPEA (Hansatech), per la misura della uorescenza direa
(cinetica veloce) della clorolla a in vivo (hp://www.Hansatech-instruments.com/conti-
nuousSystems.htm).
Figura 7.2 – Fluorimetro FMS2 (Hansatech), per la misura della uorescenza modulata
della clorolla a in vivo (hp://www.Hansatech-instruments.com/fms2.htm).
84
Misurare la vitalità delle piante per mezzo della uorescenza della clorolla
ottica. Mentre i primi modelli erano molto pesanti e destinati ad un uso
-
che la cinetica veloce (transient fluorescente). Un ulteriore sviluppo della
fluorescenza modulata.
Strumenti CFI (Chlorophyll Imaging Fluorescence) - Imaging PAM
M-series
Lo studio della CFI (Chlorophyll Fluorescence Imaging) può essere at-
tuato a differenti scale per mezzo degli strumenti della Imaging PAM M-
series. La serie M comprende le versioni MAXI, MINI (Fig. 7.4), MICRO e
differenti teste di misura. La serie M estende le applicazioni della prece-
dente versione standard IMAGING-PAM, in uso dal 2001. Con gli attua-
li sistemi della serie M possono essere ottenute immagini di fluorescenza
a vari livelli di scala, da singole cellule (Microscopy) fino a piante intere
(Maxi). Inoltre il sistema Mini consente applicazioni in condizioni di pieno
campo.
Strumenti multifunzione
-
di determinare la prompt fluorescence (cinetica veloce).
Strumenti PAM per usi speciali
La Walz ha predisposto una varietà di strumenti per usi specifici:
• MONITORING PAM per la misura nel lungo periodo delle caratteristi-
-
tali difficili;
•
•
•
superficiali;
•
fotosintesi;
• MICROFIBER PAM per la misura puntiforme delle caratteristiche foto-
sintetiche di una vasta gamma di campioni;
85
Strumenti disponibili sul mercato
Figura 7.3 – Il sistema m-Pea (Hansatech) consente la misura simultanea della uorescenza
direa della clorolla a nel PSII, l’assorbimento nel P700 (PSI) e la uorescenza ritardata
(hp://www.hansatech-instruments.com).
Figura 7.4 – Sistema di Chlorophyll Fluorescence Imaging (CFI) Walz – Mini (Foto conces-
sa da A. Calatayud, IVIA, Valencia).
86
Misurare la vitalità delle piante per mezzo della uorescenza della clorolla
• XE PAM consente di misurare la fluorescenza della clorofilla a differen-
• JUNIOR PAM per finalità didattiche ed educative.
7.3. ADC Bioscientic
Fluorimetri della serie OS
Il fluorimetro OS5p (Advanced Modulated Fluorometer) rappresenta la più
recente evoluzione della serie rispetto al capostipite ADC: OSI. OS5p pesa
-
modulata e il transient OJIP. Il fluorimetro OS-30p (Plant Stress Device OJIP
Option
ripetute. Misura FV/FM ed i parametri correlati, oltre ai punti OJIP del tran-
sient, Area a Tm. Il fluorimetro OS1p (Ultra-Compact Chlorophyll Fluorome-
ter
Misura, in condizioni di campo, FV/FM e i principali parametri della fluore-
scenza modulata.
7.4. Altri produttori
La Photon System Instruments (PSI, Drasov, CZ, ) of-
fre una vasta gamma di soluzioni per la misura della fluorescenza sia in
-
timo caso, con gli strumenti della serie Fluorpen), comprese applicazioni
delle proteine verdi (GFP-Pen). Inoltre PSI offre strumenti per la CFI (Chlo-
rophyll Fluorescence Imaging-
si simultanea di un gran numero di campioni.
) e Technologica ()
offrono varie soluzioni di Fluorcam aperte e chiuse, a varia scala di detta-
glio (da Micro FluorCam a strumenti adatti allo screening su vasta scala).
7.5. Misura simultanea di fotosintesi e uorescenza
Molti strumenti per la misura della fotosintesi netta possono essere
2, i più noti riguar-
dano i seguenti produttori:
87
Strumenti disponibili sul mercato
• Li-Cor, con il gas-analyzer Li-Cor 6400
()
•
(
htm)
• Walz, con il gas analyzer GFS-3000
(
html)
-
la clorofilla e sviluppo di ossigeno, i fluorimetri FMS1 e FMS2 della dit-
()
Figura 7.5 – Sistema IRGA (Infra Red Gas Analyzer) CIRAS-2 (PP Systems), arezzato
per la misura simultanea sullo stesso campione vegetale degli scambi gassosi e della uore-
scenza della clorolla. A sinistra: pinza e cuvea per alloggiare il campione. A destra: corpo
dell’analizzatore IRGA (hp://www.ppsys-tems.com/ciras_cfm.htm).
88
Misurare la vitalità delle piante per mezzo della uorescenza della clorolla
Caraeristiche tecniche
Modello
Fluorimetro Handy PEA
(Hansatech)
Fluorimetro Pocket Pea
(Hansatech)
Fluorimetro OS-30p
(ADC)
Illuminazione 3 LED ad alta intensità con
emissione massima a 650 nm.
(near infrared - NIR)
Singolo LED ad alta intensità
con emissione massima a 627
nm. Filtro NIR
(massima emissione a 660 nm)
Intensità luminosa Massima intensità luminosa
μmol m–2 s–1
Massima intensità luminosa
alla foglia: 3500 μmol m–2 s–1 –2 s–1
Rilevatori e Filtri
Sensore di uorescenza
(„testa” dello strumento)
con cavo, di lunghezza
commutazione
Temperatura di lavoro 0 – 40 °C 0 – 40 °C 5 – 45 °C
Controllo di amplicazione
del segnale, “Gain” Manuale o automatico * *
Durata della misura 0,001 – 300 s 1, 3 – 10 sec 2 – 255 s
Rapidità di acquisizione
dati
induzione cinetica di circa 120
punti in un secondo di misura.
induzione cinetica di circa 120
punti in un secondo di misura.
Da 10 a 30000 punti per
per le curve OJIP.
Display LCD 128 x 64 dots
89
Strumenti disponibili sul mercato
Caraeristiche tecniche
Modello
Fluorimetro Handy PEA
(Hansatech)
Fluorimetro Pocket Pea
(Hansatech)
Fluorimetro OS-30p
(ADC)
Capacità di memoria RAM 512K - 1000 transient di
RAM 512K - 200 transient di
8000 data set e 32 tracce
sperimentali
Alimentazione
continuo
A polimeri di litio 3. 7V, 570
mAhr – 1 giorno di lavoro
continuo (ricarica: 4 h)
Accumulatore Ni-MH,
continuo
Dimensioni 17 x 8,5 x 4 cm 17,5 x 7, 5 x 3,5 cm 18 cm x 7 cm x 6 cm
Peso
Sistema operativo
dati tramite Bluetooth *
Utilità del software
* mancante
Parametri misurati Fo, FM, Fv, Fv/FM, PI,
Tfm, AM, OJIP
Fo, FM, Fv, Fv/FM, PI,
Tfm, AM, OJIP
Fo, Ft, FM, Fv, Fv/ FM,
Tfm, AM, OJIP
Altre utilità
(sospensione di cloroplasti,
* *
Clip fogliari, per
adaamento al buio
mm in diametro
mm in diametro
* = informazione mancante
90
Misurare la vitalità delle piante per mezzo della uorescenza della clorolla
Tabella 2 - Caraeristiche tecniche dei uorimetri a uorescenza modulata.
Dati tecnici
Modello
Hansatech Instruments Walz ADC
FMS1 FMS2 PAM-2500 Mini-PAM OSI 5 FL OS1FL
Sorgente
luminosa
(fascio
modulato)
Fascio modulato
a 594 nm (giallo),
e controllo di
4 step (LED
opzionale 470
Fascio modulato
a 594 nm (giallo),
e controllo di
4 step (LED
opzionale 470
Fascio modulato
a 630 nm, e
controllo di
step.
Fascio modulato
a 650 nm, e
controllo di
Fascio modulato
a 660 nm, e
controllo di
intensità da 0 a 1
mmol m–2s–1
Fascio modulato
a 660 nm, e
controllo di
intensità da 0 a 1
mmol m–2s–1
Impulso di
saturazione
Lampada
alogena con luce
–2
s–1, con controllo
di intensità in
100 step.
Lampada
alogena con luce
–2
s–1, con controllo
di intensità in
100 step.
Lampada
alogena con luce
–2
s–1, con controllo
di intensità in 20
step.
Lampada
alogena con luce
–2
s–1
Lampada
alogena con luce
–2
s–1
Lampada
alogena con luce
–2
s–1
Flash
ainico
Lampada
alogena con luce
–2
s–1, con controllo
di intensità in 50
step.
Lampada
alogena con luce
–2
s–1, con controllo
di intensità in 50
step
LED 630 nm da 0
–2
s–1, con controllo
di intensità in 20
step
Lampada
alogena con luce
–2 s–1
Opzionale: : Flash
esterno intensità
m–2 s–1
685 nm LED –
–2
s–1
Mancante
Lampada
far red
LED (735 nm) LED (735 nm) LED (750 nm) LED (735 nm) Mancante
Rilevatore Fotodiodo PIN
nm
Fotodiodo PIN
nm
Fotodiodo PIN
nm
Fotodiodo PIN
nm
Fotodiodo
Fotodiodo
91
Strumenti disponibili sul mercato
Dati tecnici
Modello
Hansatech Instruments Walz ADC
FMS1 FMS2 PAM-2500 Mini-PAM OSI 5 FL OS1FL
Memoria 128 MB Floppy 3. 5”1. 44
MB capacity
*
Power Da 95 a 260 V
acido (5 pezzi)
12V, 2. 0 Ah.
Caricatore da
95– 260 V
acido 12V, 2. 0
Ah.
Ah
Caricatore da 90
– 264 V
acido - 12 V, 3.
4 Ah
acido - 12 V, 1.
2 Ah
Dimensioni 26 x 23,5 x 8,3 cm 18 x 10 x 10 cm 23 x 10,5 x 10,5 cm 19 x 13 x 9,5 cm 13 x 18 x 28 cm 7 x 11 x 19 cm
Peso
Sistema
operativo
* *
Capacità del
software
creare protocolli
creare protocolli
creare protocolli
***
Parametri
misurati
Fo, FM, Fv, Fv/ FM,
Fs, FM
, Fo
Fv/FM
, ØPSII,
P
NPQ, PAR,
Temperatura
per la misura
di ETR usando
sensori di PAR/
TEMP)
Fo, FM, Fv, Fv/ FM,
Fs, FM
Fo, Fv,
Fv/FM
, ØPSII,
P
NPQ, PAR,
Temperatura
per la misura
di ETR usando
sensori di PAR/
TEMP)
Fo, FM, Fv, Fv/ FM,
Ft, FM
, Fo', Yield,
P
Fo, NPQ, PAR,
Temperatura
per la misura
di ETR usando
sensori di PAR/
TEMP)
Fo, FM, Fv, Fv/ FM,
Ft, FMP
,
Temperatura
per la misura
di ETR usando
sensori di PAR/
TEMP)
Fo, FM, Fv, Fv/
FM, Ft, Fms,
P
NPQ, PAR,
Temperatura
per la misura
di ETR usando
sensori di PAR/
TEMP)
Fo, FM, Fv, Fv/
FM, Ft, Fs, Fms,
ETR, Y,
Temperatura
per la misura
di ETR usando
sensori di PAR/
TEMP)
* = informazione mancante
Capitolo 8
Fattori ambientali e parametri
di fluorescenza
8.1. Radiazione luminosa
-
consistere in processi di acclimatazione che agiscono nel lungo periodo
-
luminoso.
descritte da numerosi autori (Boardman, 1977; Lichtenthaler et al., 1981,
2007; Anderson e Osmond, 1987; Anderson et al., 1995; Terashima et al.,
2006; Tateno e Taneda, 2007). Le foglie di luce hanno una più elevata LMA
(Leaf Mass per Area, peso secco per unità di superficie) e un maggior spes-
-
ne dei cloroplasti nelle foglie di luce si manifesta con tilacoidi più corti e
-
tenna e incrementando i processi di dissipazione controllata (Ballottari et
al., 2007). Inoltre la luce stimola la produzione fogliare di antiossidanti e
-
tochimica primaria (FV/FM) in letteratura si ritrovano risultati contrastan-
ti. Lichtenthaler et al. (2004) e Sarijeva et al. (2007), tramite studi condotti
su foglie di Fagus sylvatica
-
te condotti su Fagus sylvatica-
tenuto un risultato opposto, con FV/FM sempre significativamente inferiore
94
Misurare la vitalità delle piante per mezzo della uorescenza della clorolla
nelle foglie di luce (Cascio et al., 2010; Desotgiu et al., in stampa). Questa
apparente contraddizione può essere spiegata con il fatto che nella regione
che le foglie adottano strategie strutturali che rendono permanente la ca-
foglie di luce, evidenziata da Pollastrini et al. (2011) e Desotgiu et al. (in
transient fluorescente, consiste nella loro
maggior capacità di ridurre gli accettori finali oltre PSI. Questa caratteristi-
fase I-P del transient fluorescente e relativi parametri.
-
stimola la produzione di specie reattive di ossigeno (ROS) sia al sito del
PSI e del PSII. In condizioni di elevata irradianza il flusso di elettroni nella
catena di trasporto (ETC, Electron Transport Chain) può provocare, oltre il
-
tori finali (ferredossina, NAD+
-
-
temente indurre la produzione dei ROS, dannosi per la vita delle cellule.
-
centro di reazione del PSII (vedi par. 2.5), e nei conseguenti meccanicismi
FV/FM
down-regulation che consente di smaltire
transient fluorescente ha consentito di verificare che, assie-
me alla riduzione di FV/FM
-
-
oxygen evolving system
95
Fattori ambientali e parametri di uorescenza
del transient-
tività nel sistema tripartito LHC - antenna - RC.
Figura 8.1 – (A) decorso giornaliero di TR/ABS (FV/FM), su foglie di luce (simboli pieni) e di
ombra (simboli vuoti) di faggio (Fagus sylvatica L. ). Si osserva la depressione a mezzogior-
no, soprauo nelle foglie di luce. (B) decorso giornaliero del parametro RE/ET, collegato
alla fase I-P del transient di uorescenza. In questo caso, l’ampiezza della fase I-P è massima
a mezzogiorno nelle foglie di luce.
8.2. Radiazione ultravioletta
-
suddiviso in UV vicino (380 – 200 nm) e UV estremo (200 – 10 nm). Quando
-
-
sa in UV-A (400 – 315 nm), UV-B (315 – 280 nm) e UV-C (280 – 100 nm). La
maggior parte della radiazione UV che arriva alla superficie terreste (circa
-
-
UV-B soprattutto nelle regioni artiche, con conseguenze sulla vegetazione.
Ci sono ecosistemi (per esempio, in alta montagna o nelle regioni mediter-
UV-screening
96
Misurare la vitalità delle piante per mezzo della uorescenza della clorolla
Gli studi sugli effetti della radiazione UV-B sulla vegetazione sono svol-
ti somministrando radiazione supplementare per mezzo di apposite lam-
pade, o riducendo la radiazione esistente per mezzo di filtri UV.
Vari studi (Strid et al., 1990; Melis et al., 1992) hanno messo in evidenza
-
del PSII (FV/FM
In una rassegna sui lavori riguardanti la risposta della fluorescenza in
piante soggette ad alti livelli di UV-B, Tevini (2004) riferisce che il target
principale della radiazione ultravioletta riguarda i centri di reazione del
transient
2008, 2011; Pollastrini et al., 2011) ha confermato la diminuzione del valore
di FV/FM e dei centri di reazione attivi. Inoltre, le piante cresciute in assenza
di UV-B hanno mostrato una maggiore efficienza nella riduzione degli ac-
cettori finali, espressa dai parametri relativi alla fase I-P.
8.3. Temperatura
8.3.1 Alte temperature
Il processo fotosintetico consta di numerose reazioni di tipo enzima-
traspirazione stomatica costituisce tuttavia un efficiente sistema di raffred-
damento delle foglie.
nonché le condizioni fisiologiche con cui la pianta affronta le alte tempera-
-
cross-resistance.
Fino a che non viene raggiunta la soglia di denaturazione delle protei-
e Bussotti (2004) hanno osservato che le temperature estive rendono più
veloce il trasporto di elettroni. Quando la temperatura supera la soglia dei
97
Fattori ambientali e parametri di uorescenza
del livello di F0 (che indica la disorganizzazione dei tilacoidi, Yamane et
al., 1997, 2000) e il conseguente declino di FV/FM
2-
/FM
e FV
/FM
. Le elevate tempera-
connettività (Srivastava et al., 1997).
8.3.2 Basse temperature
graduale diminuzione delle temperature stesse, sono in grado di porre in
atto strategie di acclimatazione (cold hardening-
-
tura avviene molto rapidamente (cold shock
trovano in uno stato fisiologico non acclimatato (gelate precoci alla fine del
periodo vegetativo, o tardive in primavera). Nel caso delle piante sempre-
winter photoinhibition (García-Plazaola et al., 1999; Oliveira e Peñuelas, 2000,
2002; Martinez-Ferri et al., 2004).
Un effetto primario della riduzione delle temperature consiste nella
1996; Allen e Ort, 2001; Ort, 2002). Ciò comporta la diminuzione dei sink
/FM
e FV
/
FM
-
-
vocano la diminuzione di FM e FV/FM0 (Fryer et al.,
-
/
FM
dal momento che il flusso di elettroni può essere indirizzato a recettori
diversi dalla CO2/FM
alla capacità di detossificare i ROS e, di conseguenza, indica tolleranza nei
transient fluorescente (Liang et al., 2007;
-
mento del valore di FJ) e una riduzione della fase J-I, in cui lo step I può
addirittura scomparire nella curva.
8.4. Carenza idrica
La risposta della fluorescenza della clorofilla in piante soggette a caren-
-
tano risultati controversi se non addirittura contrastanti. Il primo effetto
98
Misurare la vitalità delle piante per mezzo della uorescenza della clorolla
dello stress idrico consiste nel ridurre drasticamente, tramite la chiusura
-
ca (carbon starvation). Solo successivamente si possono osservare degli effetti
indotti dalla deidratazione delle cellule (dessiccation). Una insufficiente di-
2 causata dalla chiusura stomatica, può alterare il funzio-
namento relativo di PSI e PSII e la richiesta energetica per la riduzione della
CO2
Il parametro maggiormente usato, sia negli studi di fluorescenza diretta
che modulata, FV/FM
-
ti poco o non significativi, anche in condizioni di forte deidratazione (Lu e
-
-
Water Use Efficiency, WUE = PN/E, dove E indica
13-
V/FM può essere
un mero epifenomeno dovuto alla eventuale riduzione di F0 in piante sogget-
te ad aridità. Lo stress idrico infatti produce i propri effetti soprattutto a ca-
il 30% del valore di F0
il ciclo di Calvin-Benson, FV/FM
adattati alla luce.
V/FM tende a diminui-
viene misurato su piante in stato di stress idrico poste sotto forte illumina-
-
las, 2003).
V/FM in relazione allo sta-
to idrico delle foglie, e il particolare con RWC (Relative Water Content) e il
potenziale idrico (Scarascia-Mugnozza et al., 1996; Faraloni, 2011), anche se,
V/FM declina a livelli di deidratazione molto alti.
Le limitazioni stomatiche imposte alla fotosintesi sono accompagnate
-
la CO2
/FM
99
Fattori ambientali e parametri di uorescenza
-
respirazione in condizioni di stress può tuttavia sostenere un trasporto di
-
/FM
transient fluorescente. Sia pure con FV/FM invariato, la riduzione della ef-
ficienza complessiva del PSII (Performance Index, PIABS) in piante sotto-
idrica si manifesta soprattutto nella regione I-P del transient, indicando una
ridotta efficienza nel ridurre gli accettori finali oltre il PSI. Questa risposta
8.5. Salinità
-
-
La riduzione del potenziale idrico fogliare determina la riduzione del-
-
/FM
come discusso nella sezione sullo stress idrico. La
salinità non influisce sulla fotochimica primaria del PSII, e non vengono de-
V/FM
8.6. Biossido di carbonio
-
ma della rivoluzione industriale fosse 280 ppm. Attualmente (agosto 2010)
-
metrico ecc. ), ma si possono ipotizzare effetti diretti dovuti alla CO2 stessa.
La CO2 alimenta i processi fotosintetici, e le piante si giovano del suo
incremento aumentando la fotosintesi netta (PN) rispetto alla conduttan-
Water Use Efficiency
100
Misurare la vitalità delle piante per mezzo della uorescenza della clorolla
-
-
mentarne la produttività.
Nel complesso la CO2
2 deve essere tuttavia sostenuta
-
canismi di down-regulation-
meccanismi possono portare ad una riduzione di FV/FM (come limitazione del
flusso di elettroni), ed alla diminuzione del pool degli accettori finali.
8.7. Decienze di nutrienti
-
elementi provengono dalla CO2
-
menti (azoto - N, solfo - S, fosforo - P, calcio - Ca, magnesio - Mg, potassio
- K e, secondo alcuni autori, anche ferro - Fe) e microelementi (la maggior
parte degli elementi esistenti e, in particolare, manganese - Mn, rame - Cu,
sono ugualmente essenziali alla vita delle piante. La loro assimilazione av-
viene per proporzioni grosso modo costanti, riflettendo la composizione
seguono la “legge del minimo” o dei fattori limitanti. La loro carenza può
dare origine a specifiche sintomatologie fogliari.
-
-
-
come indice di efficienza fotosintetica (Reich et al., 1991).
suoli oligotrofici, con scarso contenuto di nutrienti minerali e soprattutto
consistono in modificazioni fogliari in senso sclerofillico, aumentando la
-
mantenuti (o anche aumentati) i contenuti di clorofilla e azoto per unità di
101
Fattori ambientali e parametri di uorescenza
considerata un adattamento evolutivo a suoli carenti di azoto e altri nu-
-
-
sono stati indirizzati al rilievo precoce degli stati di stress derivanti dalla
-
tervenendo sulle carenze ed evitando gli eccessi, assicurando in tal modo
una produttività ottimale.
fotosintetico, con conseguenze negative su ogni fase della fotosintesi. Lu
et al. (2001) riferiscono che la carenza di azoto ha scarsi effetti sulla resa
V/FM/
FM
-
transient di fluorescenza, ma al momento attuale non disponiamo di studi
Per molte specie esiste una forte correlazione fra il contenuto totale di
2 alle alte intensità luminose (Evans, 1989) e, di
/FM e FV/FM (Cheng et al., 2000),
-
ma che FV/FM sia alterato.
La carenza di azoto viene inoltre determinata per mezzo di tecniche di
-
zoto e nel contenuto in clorofilla possono essere misurate con flash-lamp fluo-
rescence imaging system (FL-FIS) (Langsdorf et al., 2000; Lichtenthaler et al.,
-
-
i rapporti F440/F690 e F440/F740 (Heisel et al., 1996).
-
-
102
Misurare la vitalità delle piante per mezzo della uorescenza della clorolla
si. Vari studiosi si sono occupati degli effetti della carenza di elementi sin-
Ripley et al., 2004; Boyce, 2007; Antal et al., 2007). Gli effetti dipendono dal
altri fattori di stress. Fra le risposte osservate dai differenti autori, la ridu-
zione del parametro FV/FM
M e aumento di F0.
Altre risposte includono la riduzione di FV
/FM
nella fluorescenza modulata
transient, la riduzione del numero dei centri di reazione at-
K.
8.8. Tossicità da metalli pesanti
I metalli pesanti sono presenti in natura in molte matrici geologiche (per
esempio rocce ofiolotiche, aree geotermiche ecc. ) Essi possono inoltre es-
e industriali. Nelle piante i metalli pesanti possono essere essenziali come
microelementi, svolgendo importanti funzioni nelle varie attività enzima-
tiche (Cu, Zn, Mo, Co, Ni ecc. ), oppure possono essere non essenziali e la
vegetazione spontanea ha sviluppato adattamenti specifici per vivere e
riprodursi (come, per esempio, sui terreni serpentinicoli). Nel caso inve-
ce che siano presenti come contaminanti, essi possono venire assunti dal
Cadmio (Cd).
-
-
ne della clorofilla, degradazione di composti lipidici, disorganizzazione di
OEC e del complesso antenna LHCII.
Rame (Cu)
medicinali e mangimi. A concentrazioni elevate il rame interferisce con il
Mercurio (Hg). Metallo non essenziale. Composti del mercurio sono usati
-
del trasporto foto sintetico degli elettroni.
103
Fattori ambientali e parametri di uorescenza
Zinco (Zn). Micronutriente essenziale per le piante. Così come il rame,
-
Cobalto (Co)
-
Alluminio (Al).
-
Piombo (Pb). Metallo non essenziale. Deriva da attività industriali e dal
mentre stimola la respirazione.
Nickel (Ni). Elemento essenziale in alcune piante. Deriva da attività agri-
Quasi tutti i parametri di fluorescenza vengono alterati dai metalli pe-
dalla dose e dalla durata del tempo di esposizione. Un effetto importante
M e FS (riduzione di RFD).
nelle piante trattate con metalli pesanti. Infatti vari studi effettuati appli-
-
piuttosto che il trasporto di elettroni nei tilacoidi.
8.9. Erbicidi
degli elettroni dal PSII, mentre non ha effetti sul PSI o su altri siti come
il ciclo di Calvin. La fase iniziale della induzione di fluorescenza (tran-
sient
DCMU. In foglie trattate con DCMU la massima emissione di fluorescenza
avviene a circa 2 ms (step J nel transient di fluorescenza, con la soppressio-
V/FM (vedi Fig. 4. 6).
-
-
tanto la soppressione della fase I-P (Joly et al., 2005).
104
Misurare la vitalità delle piante per mezzo della uorescenza della clorolla
8.10. Ozono
3
-
avvenire a causa della chiusura stomatica (carbon starvation) per evitare
-
viene alimentato il ciclo di Calvin-Benson e viene a mancare la riduzione
Il parametro FV/FM
-
lito riscontrata dopo periodi di esposizione molto lunghi, anticipando i
normali processi di senescenza. Guidi et al. (2009), lavorando su cultivar
-
down-regulation che serve per rista-
electron
transport chain) e la capacità di recezione degli accettori finali oltre il PSI.
Questo meccanismo serve ad evitare una sovra-eccitazione dello stroma
del valore di tutti i parametri che indicano la dissipazione controllata di
energia come in NPQ (nella fluorescenza modulata), e la riduzione dei cen-
transient
0), in foglie
-
-
-
transient
stati osservati nella fase I-P (Bussotti et al., 2011) e nei parametri ad essa col-
-
-
105
Fattori ambientali e parametri di uorescenza
Figura 8.2 – Analisi della risposta all’inquinamento da ozono, per mezzo dell’analisi del
transient uorescente, in un clone di pioppo (POP) e di faggio (FS) (da Desotgiu et al.,
2010, modicato). (A) Curva ΔV, oenuta per sorazione delle curva normalizzata fra F0 e
FM (V) di piante traate con ozono (T) meno quelle di controllo (C) [ΔV = VT – VC]. Il princi-
pale eeo del traamento con ozono consiste in un picco negativo, in entrambe le specie, a
30 (ΔVI) ms, che indica la diminuzione della capacità di riduzione degli acceori nali oltre
il PSI. (B) Curva ΔW, oenuta per sorazione delle curva normalizzata fra F0 e FJ (W) di
piante traate con ozono (T) meno quelle di controllo (C) [ΔW = WT – WC]. Il picco positivo
a 300 μs (ΔVK) indica la riduzione dell’ecienza dell’oxygen evolving complex (OEC).
-
to può essere interpretato in termini di acclimatazione, permettendo alla
Capitolo 9
Applicazioni
9.1. Screening
per lo screening di grandi numeri di piante (fenotipizzazione, o phenot-
yping), per individuare i genotipi più idonei in determinate condizioni. I
metodi tradizionalmente usati per valutare il comportamente di piante in
-
della clorofilla offrono grandi potenzialità per attuare un rapido screening
di un gran numero di piccole piante, grazie anche allo sviluppo di nuove
-
avanzate di CFI (Chlorophyll Fluorescence Imaging) permettono, con adegua-
-
-
giormente resistenti a stress idrico, salinità e alte temperature. Nel campo
-
genotipi di Crataegus (Percival e Fraser, 2001) e di Acer (Percival et al., 2003)
resistenti a somministrazioni fogliari di sale.
108
Misurare la vitalità delle piante per mezzo della uorescenza della clorolla
9.2. Vivaistica e verde urbano
-
tà delle piantine (Binder et al., 1996; Mattsson, 1996), in modo da poter se-
per le successive fasi di coltivazione.
-
della clorofilla consente di tenere sotto controllo i danni da gelo che avven-
parametro FV/FM scende al di sotto di 0,4 la mortalità dei semenzali supera
-
V/
FM
valore di FV/FM
per la conservazione al freddo, il parametro FV/FM
effetti di differenti tecniche di coltivazione per migliorare la sopravviven-
2+
(Percival et al., 1999).
La somministrazione controllata di un moderato stress idrico in vivaio
(drought hardiness, o indurimento) ne fa aumentare la sopravvivenza post-
corso di ricerche con differente finalità fanno ritenere che i processi di “in-
-
ca, misurata per mezzo della fluorescenza.
Più in generale, la fluorescenza può essere usata per tenere sotto con-
-
rizazione ecc.) e la vitalità delle piante post-trapianto, monitorando il
successo o meno degli impianti in modo da poter intervenire prontamente
con le necessarie cure colturali (Percival, 2004).
9.3. Post-harvest quality
Nella produzione orticola commerciale i prodotti (frutta, ortaggi) so-
no raccolti freschi e trasportati dal luogo di produzione al mercato. Alla
stessa maniera le piante ornamentali sono trasportate intatte. Durante la
raccolta ed il trasporto, piante e prodotti sono soggetti a numerosi fattori
possono essere soggetti a stress idrico successivamente alla loro raccolta se
non vengono gestiti adeguatamente, così come prodotti di origine tropicale
109
Applicazioni
conservazione. Molti frutti sono soggetti a trattamenti con alte temperature
per rimuovere le infestazioni parassitari prima del loro trasporto. I frut-
ti freschi e gli ortaggi sono spesso trasportati in confezioni con atmosfera
2
(DeEll and Toivonen, 2003). Le piante ornamentali in vaso sono tenute al
che derivano dalla gestione di prodotti verdi (DeEll e Toivonen, 2003), e
-
-
fiscono in pochi giorni, hanno valori di FV/FM
che tecniche di CFI (Chlorophyll Fluorescence Imaging) possono essere usate
per determinare la concentrazione ottimale di O2 e CO2 da usare negli im-
Modified Atmosphere Packages) usati
per il trasporto e la conservazione dei prodotti orticoli. Misure effettuate su
V/FM e
/FM
di odori che indicano il deterioramento del prodotto (Toivonen e DeEll,
2001). Molti prodotti vengono refrigerati nel corso del loro trasporto e con-
essere usate per determinare le risposte nei confronti di differenti e innova-
tive pratiche (DeEll et al., 2000; Purvis, 2002).
9.4. Monitoraggio ambientale
Il monitoraggio della vegetazione spontanea, dei licheni e delle fore-
ste per mezzo della fluorescenza della clorofilla (Mohammed et al., 2003,
esempio:
•
presenti sul territorio ante e post opera;
• -
logico nei popolamenti misti, per la previsione delle dinamiche vegeta-
• -
-
tazione spontanea e delle foreste può essere applicato ad un rilievo di tipo
110
Misurare la vitalità delle piante per mezzo della uorescenza della clorolla
terrestre, come tecnica aggiuntiva alle azioni che vengono svolte nei nor-
mali inventari forestali e/o rilievi di tipo sanitario, oppure a rilievi remoti
(telerilevamento, o remote sensing).
9.4.1 Monitoraggio terrestre
-
grare utilmente le tecniche e i tipi di analisi terrestri usati tradizionalmente
campioni di chioma (vedi, per esempio, il programma paneuropeo per il
monitoraggio delle condizioni delle foreste, ). Tuttavia
-
-
-
-
deguata numerosità di campionamento.
Come campionare. Nel caso di disegni campionari complessi, oppure
-
-
la raccolta, la conservazione e il trasporto in maniera da evitare danni al
-
-
logico nel corso della stagione (senescenza, eventi di stress idrico, estremi
che le risposte risentono sia delle variazioni di temperatura nel corso del
111
Applicazioni
Alcuni accorgimenti sono necessari per limitare le fonti di errore e mi-
-
gliati protocolli di campionamento, in modo che tutte le procedure siano
standardizzate.
-
-
do le medesime impostazioni operazionali (durata e intensità del lampo,
applicando poi ai risultati ottenuti i coefficienti di correzione necessari.
9.4.2 Telerilevamento
Varie tecniche e indici ottici sono usati nelle applicazioni di remote sen-
sing sulla vegetazione. Gli scopi che vengono normalmente perseguiti ri-
-
sipazione sotto forma di calore (Non Photochemical Quenching-
di de-epossidazione delle xantofille, producono variazioni della riflettanza
-
hanno formulato un indice spettrale, il Photochemical Reflectance Index
(PRI), calcolato come rapporto normalizzato tra la riflettanza a 531 nm e
de-epossidazione (Penuelas et al., 1995, 1997). Altri approcci prendono in-
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Autori
Filippo Bussotti, Rosanna Desotgiu, Martina Pollastrini
Università degli Studi di Firenze
Piazzale delle Cascine 28, 50144 Firenze, Italia
Mohamed Hazem Kalaji
Department of Plant Physiology
Faculty of Agriculture and Biology
Tadeusz Łoboda
Division of Sanitary Biology and Biotechnology
Faculty of Civil and Environmental Engineering
Karolina Bosa
Department of Pomology
Faculty of Horticulture and Landscape Architecture
Per corrispondenza:
Filippo Bussotti
Tel. +39 055 3288269
Fax. +39 055 360137
Email:
1. Brunetto Chiarelli, Renzo Bigazzi, Luca
Sineo (a cura di), Alia: Antropologia di
una comunità dell’entroterra siciliano
2. Vincenzo Cavaliere, Dario Rosini, Da
amministratore a manager. Il dirigente
pubblico nella gestione del personale:
esperienze a confronto
3. Carlo Biagini, Information technology ed
automazione del progetto
4. Cosimo Chiarelli, Walter Pasini (a
cura di), Paolo Mantegazza. Medico,
antropologo, viaggiatore
5. Luca Solari, Topics in Fluvial and Lagoon
Morphodynamics
6. Salvatore Cesario, Chiara Fredianelli,
Alessandro Remorini, Un pacchetto
evidence based di tecniche cognitivo-
comportamentali sui generis
7. Marco Masseti, Uomini e (non solo)
topi. Gli animali domestici e la fauna
antropocora
8. Simone Margherini (a cura di), BIL
Bibliografia Informatizzata Leopardiana
1815-1999: manuale d’uso ver. 1.0
9. Paolo Puma, Disegno dell’architettura.
Appunti per la didattica
10. Antonio Calvani (a cura di), Innovazione
tecnologica e cambiamento dell’università.
Verso l’università virtuale
11. Leonardo Casini, Enrico Marone,
Silvio Menghini, La riforma della Politica
Agricola Comunitaria e la filiera olivicolo-
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12. Salvatore Cesario, L’ultima a dover
morire è la speranza. Tentativi di narrativa
autobiografica e di “autobiografia assistita”
13. Alessandro Bertirotti, L’uomo, il suono
e la musica
14. Maria Antonietta Rovida, Palazzi
senesi tra ‘600 e ‘700. Modelli abitativi e
architettura tra tradizione e innovazione
Schemi di negoziato e tecniche
di comunicazione per il tessile e
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16. Antonio Calvani, Technological
innovation and change in the university.
Moving towards the Virtual University
17. Paolo Emilio Pecorella, Tell Barri/
Kahat: la campagna del 2000. Relazione
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18. Marta Chevanne, Appunti di Patologia
Generale. Corso di laurea in Tecniche
di Radiologia Medica per Immagini e
Radioterapia
19. Paolo Ventura, Città e stazione ferroviaria
20. Nicola Spinosi, Critica sociale e
individuazione
Dalla
misurazione dei servizi alla customer
satisfaction
Ecological
Design for an Effective Urban Regeneration
cura di), Il pupazzo di garza. L’esperienza
della malattia potenzialmente mortale nei
bambini e negli adolescenti
24. Manlio Marchetta, La progettazione della
città portuale. Sperimentazioni didattiche
per una nuova Livorno
Note su progetto
e metropoli
26. Leonardo Casini, Enrico Marone, Silvio
Menghini, OCM seminativi: tendenze
evolutive e assetto territoriale
27. Pecorella Paolo Emilio, Raffaella
Tell Barri/Kahat: la
campagna del 2001. Relazione preliminare
28. Nicola Spinosi, Wir Kinder. La questione
del potere nelle relazioni adulti/bambini
29. Stefano Cordero di Montezemolo, I
profili finanziari delle società vinicole
30. Luca Bagnoli, Maurizio Catalano,
Il bilancio sociale degli enti non profit:
esperienze toscane
31. Elena Rotelli, Il capitolo della cattedrale
di Firenze dalle origini al XV secolo
32. Leonardo Trisciuzzi, Barbara Sandrucci,
Tamara Zappaterra, Il recupero del sé
attraverso l’autobiografia
33. Nicola Spinosi, Invito alla psicologia
sociale
34. Raffaele Moschillo, Laboratorio di disegno.
Esercitazioni guidate al disegno di arredo
35. Niccolò Bellanca, Le emergenze
umanitarie complesse. Un’introduzione
STRUMENTI
PER LA DIDATTICA E LA RICERCA
36. Giovanni Allegretti, Porto Alegre una
biografia territoriale. Ricercando la qualità
urbana a partire dal patrimonio sociale
37. Riccardo Passeri, Leonardo Quagliotti,
Christian Simoni, Procedure concorsuali
e governo dell’impresa artigiana in Toscana
38. Nicola Spinosi, Un soffitto viola.
Psicoterapia, formazione, autobiografia
39. Tommaso Urso, Una biblioteca in
divenire. La biblioteca della Facoltà di
Lettere dalla penna all’elaboratore. Seconda
edizione rivista e accresciuta
40. Paolo Emilio Pecorella, Raffaella
Tell Barri/Kahat: la
campagna del 2002. Relazione preliminare
41. Antonio Pellicanò, Da Galileo Galilei
a Cosimo Noferi: verso una nuova
scienza. Un inedito trattato galileiano di
architettura nella Firenze del 1650
42. Aldo Burresi (a cura di), Il marketing
della moda. Temi emergenti nel
tessile-abbigliamento
43. Curzio Cipriani, Appunti di museologia
naturalistica
Incipit. Esercizi
di composizione architettonica
Silvia Martelli, Simona Rizzitelli, Il
Giardino di Villa Corsini a Mezzomonte.
Descrizione dello stato di fatto e proposta
di restauro conservativo
di), Mondo democristiano, mondo cattolico
nel secondo Novecento italiano
47. Stefano Alessandri, Sintesi e discussioni
su temi di chimica generale
48. Gianni Galeota (a cura di), Traslocare,
riaggregare, rifondare. Il caso della
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di Firenze
49. Gianni Cavallina, Nuove città antichi
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50. Bruno Zanoni, Tecnologia alimentare
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51. Gianfranco Martiello, La tutela penale
del capitale sociale nelle società per azioni
52. Salvatore Cingari (a cura di), Cultura
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Due esempi a confronto: Italia e Romania
53. Laura Leonardi (a cura di), Il distretto
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54. Cristina Delogu (a cura di), Tecnologia
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55. Luca Bagnoli (a cura di), La lettura dei
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56. Lorenzo Grifone Baglioni (a cura di),
Una generazione che cambia. Civismo,
solidarietà e nuove incertezze dei giovani
della provincia di Firenze
57. Monica Bolognesi, Laura Donati,
Acque e territorio.
Progetti e regole per la qualità dell’abitare
58. Carlo Natali, Daniela Poli (a cura di),
Città e territori da vivere oggi e domani.
Il contributo scientifico delle tesi di laurea
59. Riccardo Passeri, Valutazioni
imprenditoriali per la successione
nell’impresa familiare
Storia dei musei naturalistici fiorentini
61. Gianfranco Bettin Lattes, Marco
Bontempi (a cura di), Generazione
Erasmus? L’identità europea tra vissuto e
istituzioni
62. Paolo Emilio Pecorella, Raffaella
Tell Barri / Kahat. La
campagna del 2003
Il cervello delle
passioni. Dieci tesi di Adolfo Natalini
64. Saverio Pisaniello, Esistenza minima.
Stanze, spazî della mente, reliquiario
65. Maria Antonietta Rovida (a cura di),
Fonti per la storia dell’architettura, della
città, del territorio
66. Ornella De Zordo, Saggi di anglistica
e americanistica. Temi e prospettive di
ricerca
67. Chiara Favilli, Maria Paola Monaco,
Materiali per lo studio del diritto
antidiscriminatorio
68. Paolo Emilio Pecorella, Raffaella
Tell Barri / Kahat. La
campagna del 2004
69. Emanuela Caldognetto Magno,
Federica Cavicchio, Aspetti emotivi e
relazionali nell’e-learning
70. Marco Masseti, Uomini e (non solo) topi
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71. Giovanni Nerli, Marco Pierini,
Costruzione di macchine
72. Lorenzo Viviani, L’Europa dei partiti.
Per una sociologia dei partiti politici nel
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73 Teresa Crespellani, Terremoto e ricerca.
Un percorso scientifico condiviso per
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Cava. Architeu-
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75. Ernesto Tavoletti, Higher Education and
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Liberalismo,
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Carlo Rosselli (1917-1930)
77. Luca Bagnoli, Massimo Cini (a cura
di), La cooperazione sociale nell’area
metropolitana fiorentina. Una lettura dei
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di Firenze, Pistoia e Prato nel quadriennio
2004-2007
La villa del Novecento
79. Cosimo Di Bari, A passo di critica. Il
modello di Media Education nell’opera
di Umberto Eco
80. Leonardo Chiesi (a cura di), Identità
sociale e territorio. Il Montalbano
Cinquant’anni,
cento chiese. L’edilizia di culto nelle diocesi
di Firenze, Prato e Fiesole (1946-2000)
Camilla Perrone, Francesca Rispoli,
Partecipazione in Toscana: interpretazioni
e racconti
83.
(a cura di), Un fiume per il territorio.
Indirizzi progettuali per il parco fluviale
del Valdarno empolese
84. Dino Costantini (a cura di),
Multiculturalismo alla francese?
85. Alessandro Viviani (a cura di), Firms
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The Philosophy of the
Imagination in Vico and Malebranche
87. Carmelo Calabrò, Liberalismo,
democrazia, socialismo. L’itinerario di
Carlo Rosselli
88. David Fanfani (a cura di), Pianicare tra
città e campagna. Scenari, attori e progetti
di nuova ruralità per il territorio di Prato
89. Massimo Papini (a cura di), L’ultima
cura. I vissuti degli operatori in due reparti
di oncologia pediatrica
90. Raffaella Cerica, Cultura Organizzativa
e Performance economico-finanziarie
91. Alessandra Lorini, Duccio Basosi (a
cura di), Cuba in the World, the World
in Cuba
92. Marco Goldoni, La dottrina costituzionale
di Sieyès
93. Francesca Di Donato, La scienza e la
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Brand-building: the creative
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95. Ornella De Zordo (a cura di), Saggi di
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96. Massimo Moneglia, Alessandro
Bootstrapping
Information from Corpora in a Cross-
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97. Alessandro Panunzi, La variazione
semantica del verbo essere nell’Italiano
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98. Matteo Gerlini, Sansone e la Guerra
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99. Luca Raffini, La democrazia in
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100. Gianfranco Bandini (a cura di), noi-loro.
Storia e attualità della relazione educativa
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101. Anna Taglioli, Il mondo degli altri.
Territori e orizzonti sociologici del
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102. Gianni Angelucci, Luisa Vierucci
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umanitario e la guerra aerea. Scritti scelti
103. Giulia Mascagni, Salute e disuguaglianze
in Europa
(a cura di), Le reti della comunicazione
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105. Cosimo Chiarelli, Walter Pasini (a cura
di), Paolo Mantegazza e l’Evoluzionismo
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106. Andrea Simoncini (a cura di), La
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107. Claudio Borri, Claudio Mannini
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interaction on non-conventional bridges
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108. Emiliano Scampoli, Firenze, archeologia
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109. Emanuela Cresti, Iørn Korzen (a cura
di), Language, Cognition and Identity.
Extensions of the endocentric/exocentric
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Education in Action. A Research Study
in Six European Countries
111. Lorenzo Grifone Baglioni (a cura di),
Scegliere di partecipare. L’impegno dei
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arene deliberative e nei partiti
112. Alfonso Lagi, Ranuccio Nuti, Stefano
Taddei, Raccontaci l’ipertensione.
Indagine a distanza in Toscana
113. Lorenzo De Sio, I partiti cambiano, i
valori restano? Una ricerca quantitativa e
qualitativa sulla cultura politica in Toscana
114. Anna Romiti, Coreografie di stakeholders
nel management del turismo sportivo
115. Guidi Vannini (a cura di), Archeologia
Pubblica in Toscana: un progetto e una
proposta
116. Lucia Varra (a cura di), Le case per ferie:
valori, funzioni e processi per un servizio
differenziato e di qualità
117. Gianfranco Bandini (a cura di), Manuali,
sussidi e didattica della geografia. Una
prospettiva storica
118.
MUSINT.
Le Collezioni archeologiche egee e cipriote
in Toscana. Ricerche ed esperienze di
museologia interattiva
119. Ilaria Caloi, Modernità Minoica. L’Arte
Egea e l’Art Nouveau: il Caso di Mariano
Fortuny y Madrazo
120. Heliana Mello, Alessandro Panunzi,
Pragmatics
and Prosody. Illocution, Modality,
Attitude, Information Patterning and
Speech Annotation
121. Luciana Lazzeretti, Cluster creativi per
i beni culturali. L’esperienza toscana
delle tecnologie per la conservazione e la
valorizzazione
122. Maurizio De Vita (a cura di / edited
Città storica e sostenibilità / Historic
Cities and Sustainability
123. Eleonora Berti, Itinerari culturali del
consiglio d’Europa tra ricerca di identità
e progetto di paesaggio
124. Stefano Di Blasi (a cura di), La ricerca
applicata ai vini di qualità
125. Lorenzo Cini, Società civile e democrazia
radicale
126. Francesco Ciampi, La consulenza
direzionale: interpretazione scientifica in
chiave cognitiva
127. Lucia Varra (a cura di), Dal dato diffuso
alla conoscenza condivisa. Competitività
e sostenibilità di Abetone nel progetto
dell’Osservatorio Turistico di Destinazione
128. Riccardo Roni, Il lavoro della
ragione. Dimensioni del soggetto nella
Fenomenologia dello spirito di Hegel
129. Vanna Boffo (a cura di), A Glance at
Work. Educational Perspectives
130 Raffaele Donvito, L’innovazione nei
servizi: i percorsi di innovazione nel re-
tailing basati sul vertical branding
131 Dino Costantini, La democrazia dei mod-
erni. Storia di una crisi
132 Thomas Casadei, I diritti sociali. Un
percorso filosofico-giuridico
133 Maurizio De Vita, Verso il restauro. Temi,
tesi, progei per la conservazione
134 Laura Leonardi, La società europea in
costruzione. Sde e tendenze nella socio-
logia contemporanea
135 Antonio Capestro, Oggi la cià. Riessi-
one sui fenomeni di trasformazione urbana
136 Antonio Capestro, Progettando città.
Riessioni sul metodo della Progeazione
Urbana
137 Filippo Bussotti, Hazem M. Kalaji,
Misurare la vitalità delle piante per mezzo
della uorescenza della clorolla
Stampato da Logo s.r.l. Borgoricco (PD)
