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Influencia de la piezoelectricidad del colágeno tipo I en la adhesión celular

Authors:
  • Universidad Internacional de Valencia

Abstract and Figures

Bone healing and growth are controlled by the rate of deposition of hydroxyapatite (HA). This process have been so far accredited to the work of osteoblasts, which are attracted by the electrical dipoles produced either by piezoelectricity, due to deformation of the bone, specially the collagen in it or due to outside electrical stimuli.The main purpose of this work was to study the influence of the cortical bone collagen piezoelectricity effect, on the osteoblastic cells orientation. To evaluate the cellular adhesion on the cortical bone collagen subject to deformation, bone cells of newborn calvaria’s rats were extracted. The bone collagen was prepared and deformed following the specifications described in earlier studies. The results of this study shown that the piezoelectric phenomena of bone collagen promotes the cell’s adhesion on the compression side more than tension side compared with undeformed surface. Further studies ascertaining the osteoblastic activity due to the electric field are being advanced
Content may be subject to copyright.
Carmen Mueller-Karger, Sara Wong, Alexandra La Cruz (Eds.): CLAIB 2007, IFMBE Proceedings 18, pp. 659–662, 2007
www.springerlink.com © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2007
Influencia de la piezoelectricidad del colágeno tipo I en la adhesión celular
A.M. Ferreira1, K. Noris-Suárez1, A. Bello1, A.H. Marquez1, J.L. Feijoo2 y J. Lira-Olivares3.
1 Universidad Simón Bolívar/Dpto. de Biología Celular, Lab. Bioquímica Clínica y Molecular, Caracas, Venezuela.
2 Universidad Simón Bolívar / Dpto. de Ciencia de los Materiales, GPUSB, Caracas, Venezuela.
3 Universidad Simón Bolívar / Centro de Ingeniería de Superficies, CIS, Caracas, Venezuela.
Abstract—Bone healing and growth are controlled by the
rate of deposition of hydroxyapatite (HA). This process have
been so far accredited to the work of osteoblasts, which are
attracted by the electrical dipoles produced either by piezo-
electricity, due to deformation of the bone, specially the colla-
gen in it, or due to outside electrical stimuli. The main purpose
of this work was to study the influence of the cortical bone
collagen piezoelectricity effect, on the osteoblastic cells orienta-
tion. To evaluate the cellular adhesion on the cortical bone
collagen subject to deformation, bone cells of newborn cal-
varia’s rats were extracted. The bone collagen was prepared
and deformed following the specifications described in earlier
studies. The results of this study shown that the piezoelectric
phenomena of bone collagen promotes the cell’s adhesion on
the compression side more than tension side compared with
undeformed surface. Further studies ascertaining the os-
teoblastic activity due to the electric field are being advanced.
Palabras claves— hidroxiapatita, colágeno, osteoblastos,
piezoelectricidad, tejido oseo.
I. INTRODUCCIÓN
El incremento del número de personas que cada año
sufren traumas o enfermedades óseas se traduce en un
aumento de intervenciones quirúrgicas o tratamientos para
la reparación de estas deficiencias óseas. Es por ello que día
tras día la búsqueda de materiales sintéticos biocompatibles
que puedan ser usados en dispositivos médicos destinados a
interaccionar con sistemas biológicos que puedan cumplir
las funciones del tejido se ha intensificado. En la actualidad
el uso de ciertos materiales inertes tales como metales y
cementos óseos han sido usados ampliamente. Sin embargo
dado que el hueso es un tejido vivo que sufre
constantemente modificaciones en ciertos casos, estos
materiales no son compatibles con el tejido y por lo tanto
son rechazados por el sistema inmune del cuerpo.
Dadas estas limitaciones se busca mimetizar fenómenos
que ocurren en el cuerpo humano, implementando nuevas
estrategias para crear reemplazos de tejidos más completos
para la reparación de los defectos y enfermedades óseas. La
integración de un material apropiado que funcione como
soporte de las células regeneradoras del hueso para que
puedan proliferar y diferenciarse va a depender de las
características de la superficie del material (estructura,
composición y ciertas propiedades).
Se ha demostrado, de acuerdo a la ley de Wolf, que si el
hueso sufre una deformación progresiva esta produce una
estructura anatómica la cual es capaz de resistir la fuerza
aplicada, generándose un crecimiento en la zona cóncava
(compresión) y degradación en la zona convexa (tensión).
Partiendo de esta ley diversos trabajos se han realizado en
este campo. Iwao Yasuda (1957) fue el primero en
demostrar que el hueso seco es un piezoeléctrico, ya que al
someter el hueso a cierta deformación mecánica este
generaba impulsos eléctricos que estimulaban el
crecimiento óseo en concordancia con la ley de Wolf [1].
El proceso de reconstrucción de los huesos se relaciona
con un proceso bioquímico, sin embargo las características
piezoeléctricas del hueso, sugieren que el crecimiento puede
ser afectado y/o controlado por los potenciales producidos
por compresión o tensión del hueso y/o colágeno.
Ciertos materiales biológicos como el colágeno y
biopolímeros exhiben una orientación polar uniaxial de los
dipolos en su estructura molecular y pueden ser
considerados como bioeléctricos. Dichos materiales pueden
ser piroeléctricos y/o piezoeléctricos [2]. El colágeno
comprende el 90% de la matriz ósea y junto con la
hidroxiapatita (HA), gobierna las propiedades biomecánicas
y la integridad funcional del este tejido [3].
La piezoelectricidad en colágeno óseo y su influencia en
la fisiología y funcionalidad en el hueso ha sido altamente
estudiada. Sin embargo el proceso de mineralización ha sido
atribuido fundamentalmente a la actividad de los
osteoblastos (células regeneradoras de los huesos) las cuales
son atraídas eléctricamente por los dipolos generados por el
efecto piezoeléctrico al deformar el hueso, especialmente el
colágeno, por un estímulo eléctrico externo. [4].
En trabajos anteriores se ha demostrado que el efecto
piezoeléctrico del colágeno generado al deformar el material
favorece la deposición de la hidroxiapatita (HA) en la zona
cargada negativamente, es decir sometida a compresión
(Ver figura 1). [5]
El objetivo del presente estudio es determinar la
influencia del efecto piezoeléctrico del colágeno tipo I en la
orientación celular, generado al aplicarse un esfuerzo
mecánico.
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Fig. 1 Modelo esquemático de proceso de mineralización [5]
II. MÉTODOS
A. Preparación del colágeno
El colágeno óseo se obtuvo de los miembros posteriores
de conejos New Zeland, siguiendo el procedimiento descrito
por Noris-Suárez et al. [5]
B. Deformación del colágeno
En la deformación del colágeno se utilizó la técnica
descrita por Noris-Suárez et al. [5], doblando en el interior
de un tubo de 0,6 cm de diámetro la muestra de colágeno,
con la diferencia que no solo se deformó con el endostio en
compresión sino también en tensión (ver figura 3).
C. Adhesión y cuantificación celular
Con el propósito de evaluar el fenómeno piezoeléctrico
del colágeno del hueso sobre la adhesión celular se
extrajeron de calvaria de ratas neonatas, células
ósteoprogenitoras siguiendo el método descrito por Noris-
Suárez et al [6]. A fin de evaluar la adhesión celular sobre el
material colagénico se sumergieron las muestras de
colágeno deformadas y sin deformar (control) en una
suspensión celular que contenía 3x105 cel/ml en medio de
cultivo DMEM (el ensayo se realizó por duplicado). Las
células con el colágeno fueron incubadas durante 2 horas a
370C con una atmósfera de 5% CO2 y 95% de humedad (ver
figura 2). Las muestras fueron retiradas de la suspensión y
lavadas con buffer fosfato salino (PBS por sus siglas en
inglés). El número de células adheridas por cada superficie
(cara interna y externa del hueso, sometida o no a
deformación) se cuantificó empleando el kit comercial
Cyquant (Invitrogen, USA). Este se fundamenta en la
tinción del material nuclear de la célula (ADN) con un
compuesto fluorescente. Para lisar las células adheridas y
cuantificar el material nuclear total de la preparación
relativo al número de células presentes (por cada condición
evaluada), se incubaron las muestras a -70 0C durante 30
minutos e inmediatamente se descongelaron a temperatura
ambiente. El material fue solubilizado con el buffer
suministrado en el kit y el número de células adheridas fue
cuantificado empleando un fluorímetro a las longitudes de
onda λ= 480 nm de excitación y λ= 520 nm de emisión.
Previamente se realizó una curva de calibración con una
suspensión celular, siguiendo las instrucciones del kit.
III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En trabajos previos [5, 7] se reportó la capacidad del
colágeno óseo de inducir deposición de mineral cuando este
era deformado, mediado por el efecto piezoeléctrico en
presencia de fluido simulado del cuerpo. En estos trabajos
se demostró que la deposición del mineral ocurre en la cara
sometida a compresión (cargada negativamente, ver figura 1
y 4).
A pesar de que en diversos trabajos se ha discutido sobre
el efecto que ejerce el fenómeno de piezoelectricidad del
colágeno sobre las células óseas, no existen estudios que
Fig.2 Esquema del montaje experimental para la adhesión celular
Fig.3 Esquema de deformación del colágeno óseo
Influencia de la piezoelectricidad del colágeno tipo I en la adhesión celular 661
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demuestren que efectivamente la adhesión de las células
óseas se puede orientar por este fenómeno.
Utilizando el Kit Cyquant se pudo determinar la cantidad
de células adheridas en la superficie del colágeno y
comparar la adhesión celular sobre las muestras que
sufrieron deformación respecto al control (material sin
deformar). Se quiso evaluar la influencia de la apariencia
superficial de cada cara (endostio o periostio) del material
óseo, a fin de descartar que ésta fuera importante para el
fenómeno de adhesión. Por ello las muestras fueron
deformadas sometiendo en un caso la superficie del
endostio a compresión y en otro caso a tensión. Viceversa,
el periostio sometido a tensión en un caso, y a compresión
en el otro (ver figura 3).
Se encontró que el número de células que se adhirieron
en la superficie de colágeno difieren entre las muestras
comparadas. Para las muestras sometidas a deformación en
presencia de la suspensión celular se encontró que en la
zona correspondiente al endostio (cara interna del hueso)
había un mayor número de células adheridas en el área
sometida a compresión en comparación con esa misma
superficie sometida a tensión (ver tabla 1 y figura 3).
En la zona correspondiente al periostio (parte externa del
hueso) se encuentra que la cantidad de osteoblastos
adheridos en el área sometida a compresión es ligeramente
mayor que en esa misma área cuando es sometida a tensión
(ver tabla 1 y figura 5).
Por otra parte, comparando el área de compresión en
ambas zonas, endostio y periostio, se observa que la
adhesión celular es similar y que la pequeña variabilidad se
encuentra dentro del rango de error. Sin embargo en el área
de tensión la adhesión celular es mayor en la zona del
periostio respecto a la del endostio (ver tabla 1).
En general, se adhiere un mayor número de células en la
superficie del material deformado respecto al sin deformar
(ver tabla 1y figura 5).
El efecto piezoeléctrico parece afectar la orientación de
la adhesión celular en el colágeno en particular, cuando es
deformado en compresión. De ello se deduce que la
polaridad negativa (compresión) generada al deformar el
colágeno induce una mayor adhesión celular comportándose
de manera similar al fenómeno de deposición encontrado
para la hidroxiapatita reportada en experimentos anteriores
[5].
De acuerdo a lo expuesto anteriormente se propone un
modelo que permita explicar esta orientación. Cuando la
superficie se encuentra cargada positivamente la adhesión
celular puede ocurrir para favorecer una degradación del
material regulando los osteoclastos e induciendo
osteoclastogénesis. En el caso inverso, cuando la superficie
se encuentra polarizada negativamente la adhesión de los
osteoblastos inhibe la osteogénesis y promueve una
formación ósea (ver figura 6).
IV. CONCLUSIONES
La adhesión celular en las diferentes superficies es
afectada por la distribución de cargas generadas por el
efecto piezoeléctrico, encontrándose que las células se
orientan y adhieren con una mayor predisposición hacia la
zona cargada negativamente (compresión). Se requieren
otros estudios para entender mejor como la
Fig.4 Micrografías obtenidas por MEB de la deposición
preferencial de la HA en ambos lados deformados del [5]
Tabla 1. Células adheridas según la zona y condición experimental.
Deformación Endostio
(cel x103)
Periostio
(cel x103)
Compresión 45 ± 7 48 ± 5
Tensión 33 ± 1 43 ± 5
Sin deformar 38 ± 5 34 ± 5
Fig. 5 Esquema de la adhesión celular en las diferentes deformaciones
662 A.M. Ferreira, K. Noris-Suárez, A. Bello, A.H. Marquez, J.L. Feijoo y J. Lira-Olivares.
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piezoelectricidad del material estaría regulando las
funciones celulares.
RECONOCIMIENTOS
El presente trabajo fue financiado por fondos
provenientes de FONACIT (proyectos LAB-2000001152,
G-200100900 y G-2005000173) y del Decanato de
Investigación y Desarrollo de la Universidad Simón Bolívar
por el apoyo al programa de Grupos GID-02 y Fondo
Trabajo PPI (Prof Jose Luis Feijoo)
REFERENCIAS
1. Fukada E., Yasuda I. et al. (1957) On the piezoelectric effect
of bone. J. Phys. Soc. Jpn 10: 1158–1162.
2. Silva C., Thomazini D. et al. (2001) Collagen-Hydroxyapatite
films: piezoelectric films. Mat. Sci. Eng. 863: 210-218.
3. Knott L., Bailey A. (1998) Collagen cross-links in mineraliza-
tion tissues: a review of their chemistry, function, and clinical
relevance. Bone 22: 181–187
4. Young R. W., (1966) The control of cell specialization in
bone. Clin Orthop. Relat. Res. 45: 153-156
5. Noris-Suárez K., Lira-Olivares J. et al (2007) In Vitro Deposi-
tion of Hydroxyapatite on Cortical Bone Collagen Stimulated
by Deformation-Induced Piezoelectricity. 8(3): 941-948.
6. K. Noris-Suárez, I. Barrios de Arenas et al (2005) Caracteri-
zación biológica empleando células osteobláticas de vidrios
del sistema SiO2.Na2O.CaO K2O.MgO.P2O5 modificados
con Al2O3 y B2O3. Rev. Latin. Am. Met. Mat. 23: 82-88.
7. Noris-Suárez K., Lira -Olivares J., Ferreira A. M., Graterol
A., Feijoo J. L., Lee S. W.. (2007) Electrochemical influence
of collagen piezoelectric effect in bone healing Mat. Sci.
Forum 544- 545: 981-984
Autor de correspondencia:
Autor: Karem Noris Suárez
Instituto: Universidad Simon Bolivar
Calle: Carretera Nacional de Baruta
Ciudad: Caracas
País: Venezuela
E-mail: knoris@usb.ve
Fig. 6 Modelo propuesto de regulación de la funcionalidad celular
según la adhesión preferencial de las células óseas.
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Antecedentes. Los efectos deletéreos de suprimir la oxigenación de los tejidos se pueden eliminar con protección celular, utilizando alimentos como el pescado, que contiene litio, ácidos grasos, omega 3, frutas y verduras para aportar antioxidantes. La regeneración celular y tisular se puede mediar por encefalinas. Su acción puede asociarse al ejercicio físico intenso y el trabajo excéntrico encargados de retirar los tejidos lesionados. Objetivo. Conocer algunas experiencias que utilizan la inmersión en piscina para suprimir el dolor y dar calidad de vida al paciente. Materiales y métodos. Se analiza la interacción de diez variables utilizadas como herramientas de trabajo en ocho pacientes escogidos al azar. Resultados. El trabajo excéntrico es la más importante de las herramientas. El daño muscular produce factor de crecimiento muscular y nervioso, lo cual, junto al empleo de insulinas, regenera en conjunto los tejidos. La herramienta de los endocanabinoides participa en la relajación, protección, alimentación y re-funcionalización de los tejidos, a la par que interactúa con las endorfinas para mediar la reparación en el sistema endotelial. Conclusiones. Las imágenes funcionales avanzadas (3 Teslas) de resonancia serán de utilidad para observar y evaluar las interacciones de las herramientas.
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The piezoelectric effect of bone has been observed similarly to the case of wood or ramie. The specimens were cut out from the femur of man and ox, and dried completely by heating. The piezoelectric constants were measured by three different experiments, that is, measurements of the static direct effect, the dynamic direct effect and the dynamic converse effect. The piezoelectric effect appears only when the shearing force is applied to the collagen fibres to make them slip past erch other. The magnitude of piezoelectric constant depends on the angle between the applied pressure and the axis of the bone. The maximum value of piezoelectric constant amounts to 6x 10-9c.g.s.e.s.u., which is about one-tenth of a piezoelectric constant du of quarts crystal. The specimens which were boiled in hot water and afterwards dried completely showed little change in the piezoelectric effect, the fact ascertaining that the effect is not of biological origin. The origin to piezoelectricity in bone may be ascribed to the piezoelectric effect of the crystalline micelle of collagen molecules. The consideration of the symmetry of the configulation of collagen fibres in the bone texture shows the existence of effects which are represented by only two piezoelectric constants d14 and d25, which are the same in magnitude but opposite in sign.
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One of the most revolutionary trends of the past four decades should be named the innovative use of specials ceramics designed to reproduce different function of living organisms. Ceramics used for these purposes are defined as bioceramics. In this category we find bioactive glasses of SiO2.Na2O.CaO.K2O.MgO.P2O5 system that show the capacity of chemical bonding between bone and this material. AI2O3 and B2O3 have been used in bioactive glasses to modify its surface dissolution and durability. However, Al2O3 in contrast to B2O3 can inhibit bone bonding, being the acceptable amount of alumina a function of glass composition. In the present work were evaluated glasses of SiO2.Na2O.CaO.K2O.MgO.P2O5 system, modified by a variable amount of Al2O3and B2O3. Our results showed alkalinization of culture medium. Therefore, the pH and glass composition could affect the cellular viability of the osteoblast; especially when the bioactive glass contained 1% alumina with 0% B2O3 in the composition. Whereas the glass contained 1.5% alumina combined with 1% B2O3 looks to enhances the adhesion and proliferation of the bone cells. Those results suggest that the assayed bioactive glasses could be used as coating materials for orthopedic and dental implant.
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Bone healing and growth are controlled by the rate of deposition of hidroxiapatite (HA). This process have been so far accredited to the work of osteoblasts, which are attracted by the electrical dipoles produced either by piezoelectricity, due to deformation of the bone, specially the collagen in it, or due to outside electrical stimuli. The present work shows that even without osteoblasts present, the piezoelectric dipoles produced by deformed collagen, can produce the precipitation of HA by electrochemical means, without catalyzer as in biomimetic deposition. These findings could clarify the contribution of osteoblasts in bone growth as compared to the electrochemical action by itself. Further studies ascertaining the osteoblastic activity due to the electric field are being advanced.
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In the present work, we have studied the effect of the piezoelectricity of elastically deformed cortical bone collagen on surface using a biomimetic approach. The mineralization process induced as a consequence of the piezoelectricity effect was evaluated using scanning electron microscopy (SEM), thermally stimulated depolarization current (TSDC), and differential scanning calorimetry (DSC). SEM micrographs showed that mineralization occurred predominantly over the compressed side of bone collagen, due to the effect of piezoelectricity, when the sample was immersed in the simulated body fluid (SBF) in a cell-free system. The TSDC method was used to examine the complex collagen dielectric response. The dielectric spectra of deformed and undeformed collagen samples with different hydration levels were compared and correlated with the mineralization process followed by SEM. The dielectric measurements showed that the mineralization induced significant changes in the dielectric spectra of the deformed sample. DSC and TSDC results demonstrated a reduction of the collagen glass transition as the mineralization process advanced. The combined use of SEM, TSDC, and DSC showed that, even without osteoblasts present, the piezoelectric dipoles produced by deformed collagen can produce the precipitation of hydroxyapatite by electrochemical means, without a catalytic converter as occurs in classical biomimetic deposition.
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In this paper we report a study of the physicochemical, dielectric and piezoelectric properties of anionic collagen and collagen–hydroxyapatite (HA) composites, considering the development of new biomaterials which have potential applications in support for cellular growth and in systems for bone regeneration. The piezoelectric strain tensor element d14, the elastic constant s55, and the dielectric permittivity ε11 were measured for the anionic collagen and collagen–HA films. The thermal analysis shows that the denaturation endotherm is at 59.47 °C for the collagen sample. The collagen–HA composite film shows two transitions, at 48.9 and 80.65 °C. The X-ray diffraction pattern of the collagen film shows a broad band characteristic of an amorphous material. The main peaks associated to the crystalline HA is present in the sample of collagen–HA. In the collagen–HA composite, one can also notice the presence of other peaks with low intensities which is an indication of the formation of other crystalline phases of apatite. The scanning electron photomicrograph of anionic collagen membranes shows very thin bundles of collagen. The scanning electron photomicrography of collagen–HA film also show deposits of hydroxyapatite on the collagen fibers forming larger bundles and suggesting that a collagenous structure of reconstituted collagen fibers could act as nucleators for the formation of apatite crystal similar to those of bone. The piezoelectric strain tensor element d14 was measured for the anionic collagen, with a value of 0.062 pC N−1, which is in good agreement compared with values reported in the literature obtained with other techniques. For the collagen–HA composite membranes, a slight decrease of the value of the piezoelectricity (0.041 pC N−1) was observed. The anionic collagen membranes present the highest density, dielectric permittivity and lowest frequency constant f.L.
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Bone collagen cross-links are now widely used to assess bone resorption levels in many metabolic bone diseases. The post-translational modifications of bone and other mineralizing collagens are significantly different from those of other type I collagen matrices, a fact that has been exploited during recent advances in the development of biochemical markers of bone resorption. The enzymatic collagen cross-linking mechanism is based upon aldehyde formation from specific telopeptide lysine or hydroxylysine residues. The immature ketoimine cross-links in bone form via the condensation of a telopeptide aldehyde with a helical lysine or hydroxylysine. Subsequent maturation to the pyridinoline and pyrrole cross-links occur by further reaction of the ketoimines with telopeptide aldehydes. In mineralizing tissues, a relatively low level of lysyl hydroxylation results in low levels of hydroxylysyl pyridinoline, and the occurrence of the largely bone specific lysyl pyridinoline and pyrrolic cross-links. The collagen post-translational modifications appear to play an integral role in matrix mineralization. The matrix of the turkey tendon only mineralizes after a remodeling of the collagen and the subsequent formation of a modified matrix more typical of bone than tendon. Further, disturbances in the post-translational modification of collagen can also affect the mineralization density and crystal structure of the tissue. In addition to their use as a convenient measure of matrix degradation, collagen cross-links are of significant importance for the biomechanical integrity of bone. Recent studies of osteoporotic bone, for example, have demonstrated that subtle perturbations in the pattern of lysine hydroxylation result in changes in the cross-link profile. These alterations, specifically changes in the level of the pyrrolic cross-link, also correlate with the strength of the bone. Further research into the biochemistry of bone collagen cross-links may expand current understanding and their clinical application in metabolic bone disease. This review also demonstrates the potential for further study into this area to provide more subtle information into the mechanisms and etiology of disease and aging of mineralizing tissues.
Calle: Carretera Nacional de Baruta Ciudad: Caracas País: Venezuela E-mail: knoris@usb.ve Fig. 6 Modelo propuesto de regulación de la funcionalidad celular según la adhesión preferencial de las células óseas
  • Autor
Autor: Karem Noris Suárez Instituto: Universidad Simon Bolivar Calle: Carretera Nacional de Baruta Ciudad: Caracas País: Venezuela E-mail: knoris@usb.ve Fig. 6 Modelo propuesto de regulación de la funcionalidad celular según la adhesión preferencial de las células óseas.