Content uploaded by Héctor Pérez-Saad
Author content
All content in this area was uploaded by Héctor Pérez-Saad on Jan 26, 2015
Content may be subject to copyright.
1. Memorias VI Congreso Ciencias del Mar, MarCuba 2003.
Efectos farmacológicos de extractos de algas marinas.
Teidy García1 , Sergio Mora2, Anoland Garateix1, Adys Palmero1, Olga Valdés1, Fernando
Guzmán1, Yanelsys Hernández1, María T. Buznego3 , Héctor Pérez-Saad 3.
1CEBIMAR, Loma y 37 Alturas del Vedado, Instituto de Oceanología, CITMA, La Habana,
Cuba. E.mail: cebimar@infomed.sld.cu, 2 Lab. de Farmacología del comportamiento,
Facultad de Medicina, Universidad de Chile. 3Instituto de Neurología y Neurocirugía,
MINSAP, La Habana, Cuba.
RESUMEN
Las algas constituyen una fuente importante de compuestos de interés biomédico. En
este estudio se presentan los resultados del pesquisaje realizado a extractos de 7
especies de algas en modelos de conducta exploratoria y convulsiones inducidas por
choque eléctrico en ratones machos Balb-c y OF1 respectivamente, de 18-22 g de peso
corporal; a dosis entre 40 - 1000 mg/Kg, v.o. (n= 10). Los resultados mostraron que la
mayor dosis de los extractos de Dyctiota sp. y Turbinaria sp. disminuyeron
significativamente la actividad exploratoria a un 34.9% y 41.6% respectivamente. El
extracto de Sargassum sp. disminuyó significativamente la convulsión tónica inducida por
el choque eléctrico a un 74.6 %. Estos resultados sugieren la presencia en estos
extractos de compuestos con efectos sedante y anticonvulsivante. El extracto de Dyctiota
sp. se evaluó en conducta motora y evitación activa en ratas hembras AXC de 200-250 g
de peso corporal, así como en conducta exploratoria, laberinto en cruz, natación forzada y
convulsiones inducidas por choque eléctrico en ratones machos Balb-c y OF1. Se
ensayaron dosis entre 125-1000 mg/kg de peso. Las mayores dosis estudiadas
produjeron una disminución de la conducta motora en ratas a 36% mientras que la
actividad exploratoria se redujo a 14% en ratones. En el modelo de evitación activa a
dosis de 125 y 250 mg/kg del extracto, se observó un enlentecimiento en el aprendizaje.
Estos resultados sugieren un posible efecto sedante en este extracto lo que justifica el
interés en continuar los estudios con esta especie por su posible interés terapéutico.
INTRODUCCION
Los organIsmos marinos poseen un potencial biomédico incalculable como fuente de
estructuras y actividades biológicas únicas. Las algas han sido utilizadas desde hace
siglos como fuente de alimentos y dentro de la medicina tradicional de muchos paises. Se
han descrito actividades biológicas importantes como son: hipotensora, hemolítica,
colinérgica, anticonvulsivante, inmunosupresora, antimicrobiana, antitumoral, etc.
(Alphose et al. 1988; Payri et al, 1995, Kamat et al. 1994). El objetivo del presente trabajo
consistió en realizar el tamizaje neurofarmacológico de 7 extractos de algas provenientes
de la plataforma cubana y profundizar en la evaluación farmacológica de una de las
especies más promisorias (Dyctiota sp.) mediante el empleo de técnicas conductuales
más específicas.
MATERIALES Y METODOS
Colecta y procesamiento de las algas marinas:
Los muestreos de las algas se realizaron mediante buceo en apnea en varios puntos de
la zona Noroccidental (NO) del Archipiélago cubano, comprendida entre el río Banes y
Rincón de Guanabo entre los meses de noviembre del 2000 y mayo del 2001 en 4
estaciones de la zona NO. Las especies se indentificaron taxonómicamente según Littler y
Littler (2000), colocándose en la colección Vaucher del Instituto de Oceanología.
Las algas se almacenaron en congelación y posteriormente fueron molidas y
homogeneizadas previa preparación de los extractos acuosos e hidroalcohólicos. Los
extractos acuosos fueron mezclados en proporción 1:2 en búffer fosfato 0,1 M, pH 7,2
según el procedimiento referido por Shiomi et al, (1979) con modificaciones en cuanto al
tiempo de extracción, mientras que los restantes extractos se prepararon en diferentes
proporciones de la solución etanol: agua entre el 10 % y el 60% según Cannell (1998).
Todos los extractos fueron mantenidos en reposo entre 24 y 72 horas a 10°C,
centrifugados, concentrados al vacío por rotoevaporación a 50°C y secados por
liofilización, para su posterior análisis químico y evaluación de su actividad.
Se evaluaron los siguientes extractos:
1. Extracto etanólico al 10% de Dyctiota sp.
2. Extracto etanólico al 60% de Kappahycus sp
3. Extracto acuoso de Ulva sp.
4. Extracto etanólico al 50% de Ulva sp.
5. Extracto etanólico al 50% de Thalassia sp.
6. Extracto etanólico al 50% de Padina sp.
7. Extracto etanólico al 10% de Turbinaria sp.
8. Extracto etanólico al 60% de Sargassum sp.
-Ensayos conductuales.
Los experimentos se realizaron con ratones machos OF1 y Balb-c, de 18-22 g de peso
corporal con dosis de 40, 200 y 1000 mg/Kg de peso corporal. Se utilizaron un total de
10 animales por cada dosis más un grupo control, como patrón ansiolítico diacepam (1
mg/Kg, i.p) 30 min antes del ensayo y como antidepresivo imipramina (30 mg/Kg, i.p) a las
24, 18 y 1h antes de la evaluación. Todas los extractos y drogas se administraron en
volúmenes de 0.01mL/g de peso corporal. Los modelos empleados en este tamizaje
inicial fueron conducta exploratoria y convulsiones inducidas por choque eléctrico.
-Conducta exploratoria. La conducta exploratoria fue observada en ratones mediante un
recipiente de campo abierto, con una pared de 15 cm de alto y un diámetro de 30 cm
(Pérez-Saad et al. 2003). En el piso se dibujó un círculo concéntrico de 10 cm de
diámetro. La observación comenzó con la colocación del animal en el círculo central y a
partir de ese momento se midieron los parámetros siguientes: 1. latencia (tiempo total
transcurrido en el círculo central); 2. número de empinamientos; 3. número de veces que
el animal atraviesa el círculo central-conducta diagonal y 4. tiempo total transcurrido en el
círculo durante el tiempo de observación. Se emplea un cronómetro manual-mecánico y
el tiempo total de observación fue de 6 min.
-Crisis por choque eléctrico. Las crisis fueron inducidas por el paso de pulsos cuadrados
de 170 V con una duración de 900 ms y frecuencia de 0.1 Hz, mediante electrodos
auriculares. El parámetro medido fue la duración de la hiperextensión de las patas
traseras (Browning, 1987).
-Evaluación del extracto de la especie Dyctiota sp.
En el caso del extracto etanólico de Dyctiota sp., se realizaron un grupo de experimentos
adicionales que incluyeron conducta motora, evitación activa y laberinto en cruz en ratas
hembras AXC de 200 a 250 g de peso corporal, así como conducta exploratoria, laberinto
en cruz, natación forzada y convulsiones inducidas por choque eléctrico en ratones
machos Balb-c y OF1, de 18 a 22 g de peso corporal. Se ensayaron dosis del extracto
entre 125-1000 mg/kg de peso. Todos los extractos y drogas se administraron por vía oral
e intraperitoneal a volúmenes de 0.01mL/g de peso.
- Actividad Motora: Cada rata fue ubicada en una caja de acrílico (30x30x30) instalada en
el interior de una cámara de madera aislada de sonido. El piso de la caja lo constituye
una plataforma de actividad (Lafayette Instruments Co Modelo 86010), conectada a un
contador electromecánico. La actividad motora total es monitoreada por este contador,
cada 5 min. durante un período de 30 min (Díaz-Véliz et al., 2000). Simultáneamente se
registran otras conductas motoras, tales como levantadas, sacudidas de la cabeza,
acicaleo, rotaciones, etc.
- Evitación Activa: Cada animal es ubicado individualmente en una caja de
condicionamiento de dos vías (Two-Way Shutte Box Lafayette Instruments Co Modelo
85103), compuesta por dos unidades, las cuales están equipadas con un piso de 18
barras de acero inoxidable conectadas a una fuente de choques eléctricos ( Master Shock
Suplly Lafayettte Innstruments modelo 80223). Cada rata fue sometida a 50 ensayos de
condicionamiento (1 cada 0.5 min) después de 5 min. de habituación. Cada ensayo
consistió en la presentación de un tono (estímulo condicionado), el cual, después de 5
seg., es combinado con un choque eléctrico de 0.20 mA ( estímulo no condicionado),
aplicado a las patas a través de las barras del piso. La respuesta de evitación
condicionada es definida como el cruce al compartimiento dentro de los primeros 5 seg
(duración del tono) Si la rata no escapa antes de completar los 10 seg de choque es
considerado como falla en el escape (Díaz-Véliz et al., 2000).
-El laberinto en cruz elevado está basado en un modelo propuesto por Pellow et al. (1985)
y validado por Lister (1987) para ratones. Consiste en dos brazos abiertos opuestos (20 x
5 cm), y dos cerrados (20 x 5 cm), en forma de cruz conectados por una plataforma
central (5 x 5 cm). La plataforma, las paredes laterales de los brazos cerrados y los pisos
de ambos brazos están confeccionados en plywood. Las paredes de los brazos cerrados
tienen una altura de 15 cm. El laberinto esta elevado a 50 cm del piso. Para la
observación el animal se coloca en el centro de la plataforma y su conducta exploratoria
se registra durante 5 min. Para el análisis de los datos se calcula qué porciento
representa el tiempo de permanencia en el brazo abierto con respecto al total del tiempo
de permanencia de ambos brazos.
-Natación forzada: Este ensayo se basa en el procedimiento originalmente descrito por
Porsolt y colaboradores en 1978. La prueba se realiza en un vaso de precipitado con un
volúmen de dos litros, 17 cm de altura y 13 cm de diámetro, conteniendo agua de forma
tal que se mantengan 13 cm libres de agua. La temperatura de ésta es de alrededor de
los 25º C. Los animales se someten a una sesión de entrenamiento 24 h antes de la
prueba, para lo cual se colocan en el recipiente con agua y se dejan en esas condiciones
por 15 minutos. Al finalizar la sesión, se administra el extracto a los animales de acuerdo
al grupo al que pertenecen. A las 6 horas después de la primera administración-18 horas
antes de la prueba- se realiza la segunda administración de los compuestos. Al día
siguiente, a las 23 horas después de la primera administración-1 hora antes de la prueba-
se realiza la última administración. Entre un animal y otro se procede a un cambio de
agua. Durante la prueba (5 minutos) se registran: el tiempo de inmovilidad (tiempo que
transcurre cuando los animales permanecen inmóviles realizando únicamente los
movimientos necesarios para mantenerse flotando) y el escalamiento.
- Procesamiento estadístico
Los resultados fueron analizados a través de la prueba t-student o ANOVA para
comparaciones múltiples, tomando como nivel de significación p≤0.05. Este
procesamiento se realizó con el programa STADGRAPHIC versión 4.0 y los resultados se
expresan como las medias y errores estándar de las medias.
RESULTADOS
De los 7 extractos evaluados tres fueron efectivos en dosis de 1000 mg/kg. Las especies
Phaeophytas: Dyctiota sp. y Turbinaria sp. disminuyeron significativamente la actividad
exploratoria en un 34.9% y 41.6% respectivamente, mientras que Sargassum sp.
disminuyó significativamente la duración de las convulsiones tónicas inducidas por choque
eléctrico en un 74,6% (Fig.1).
Los extractos de Dyctiota sp. y Turbinaria sp. provocaron una disminución de la conducta
exploratoria mientras que el extracto de Sargassum sp. produjo un efecto
anticonvulsivante.
-Evaluación de la especie Dyctiota sp.
-Evaluaciones en ratas:
La evaluación del extracto sobre el modelo de actividad motora espontánea en dosis
de 125 y 250 mg/kg, mostró que el extracto total del alga produce una disminución
estadísticamente significativa de los índices de actividad motora, tiempo de acicaleo de
los animales y el número de empinamientos (levantadas) como se observa en la Fig. 2 .
0%
20%
40%
60%
80%
100%
120%
Dyctiota
Kappaphycus
Ulva Acu.
Ulva Et.
Thalassia
Padina
Turbinaria
Sargassum
Algas evaluadas (1000 mg/Kg), * p< 0.05.
Fig.1 -Efecto de extractos de diferentes especies de algas sobre conducta
exploratoria y choque eléctrico.
Conducta Exploratoria
Electroshock
Efecto
*
*
*
Fig. 2. Efecto del extracto etanólico de Dyctiota sp. en el modelo de actividad
motora (*p < 0.05).
En el modelo de evitación activa como se muestra en la Fig. 3, se observó un
enlentecimiento en el aprendizaje con relación al grupo control.
0
200
400
600
800
Control
125
250
Actividad Motora
0
40
80
120
Control
125
250
Acicaleo
0
10
20
30
Control
125
250
Levantadas
*
*
*
*
*
*
mg/kg
mg/kg
mg/kg
Fig. 3. Efecto del extracto etanólio de Dyctiota sp. sobre el modelo de evitación
activa. Cada punto representa la mediana de los aciertos en los 5 minutos
precedentes
0
2
4
6
8
10
10 15 20 25 30
min
Respuestas condicionadas
Control
125 mg/kg
250 mg/kg
El extracto no demostró efectos ansiolíticos en el ensayo del laberinto en cruz elevado.
- Evaluaciones en ratones:
Se realizaron evaluaciones complementarias en ratones Balb-c y OF1 en los siguientes
modelos: conducta exploratoria, convulsiones inducidas por choque eléctrico, laberinto en
cruz y natación forzada.
Conducta exploratoria: Se observa una disminución de la actividad motora total
(empinamientos más cruces en el círculo central) en ratones Balb-c. Como se ilustra en la
Fig. 4 los parámetros medidos disminuyeron significativamente en todas las dosis.
Laberinto en cruz: No se produjeron cambios significativos por efecto del extracto (Fig. 5)
en este modelo en ratones OF1. Sin embargo, para poder emitir una respuesta definitoria
acerca de la acción del extracto en este modelo debemos ampliar la muestra pues este
efecto se observó en grupos de 5 animales cada uno.
Fig. 4 Efecto del extracto etanólico de Dyctiota
sp.sobre la conducta exploratoria.
0
5
10
15
20
25
30
35
control 40 200 1000
Paradas + cruces.
mg/kg
*
*
*
Fig.5 Efecto del extracto etanólico de Dyctiota
sp. sobre laberinto en cruz.
0
10
20
30
40
50
control diacepam 125 250 500 1000
Permanencia (%).
mg/kg
En el modelo de natación forzada (125, 250, 500 y 1000 mg/kg de peso) se observa a
algunas dosis aumentos en los períodos de inmovilidad por acción del extracto en ratones
Balb-c, aunque no hubo una acción dosis-respuesta.
En el caso de las convulsiones inducidas por choque eléctrico el extracto no parece
proteger ni ejercer ningún efecto a las dosis empleadas (40, 200 y 1000 mg/kg de peso)
en ratones OF1.
DISCUSION
Las principales conclusiones derivadas del pesquisaje realizado con las 7 especies de
algas sugieren que los extractos de Dyctiota sp. y Turbinaria sp. presentan un perfil de
acción neurofarmacológica propia de compuestos con acción sedante y en el caso del
extracto de Sargassum sp. se evidenció un efecto anticonvulsivante.
En la literatura consultada sobre investigaciones realizadas con extractos de algas
marinas son escasos los reportes de acciones sobre Sistema Nervioso. Es conocida la
presencia en las algas pardas de kainato, amino ácido excitatorio de gran valor en el
estudio de la epileptogénesis (Ben-Ari y Cossart 2000). A partir del alga parda
Cystophora moniliformis (Keleconm 1986) se aisló un compuesto que presenta
propiedades anticonvulsivantes. Asimismo, un efecto depresor sobre neuronas de
invertebrados de la Caulerpina, obtenida de la especie Caulerpa taxifolia, ha sido
planteado por Mozzachiodi y col. (2001). Por otra parte, de las referencias encontradas se
destacan los resultados de un tamizaje farmacológico realizado por Payri y col. (1995) en
extractos crudos de diferentes especies de algas provenientes de Tahití, en el que se
empleó la prueba de Irwin para la evaluación de la actividad sobre el Sistema Nervioso
Central. Este grupo reportó que el extracto de Sargassum sp refleja actividad
neurofamacológica en esta prueba lo cual es coincidente con los resultados del presente
estudio. Sin embargo, estos autores no encontraron efectos en los extractos provenientes
de especies de los géneros Dyctiota y Turbinaria, lo cual resulta diferente con respecto a
lo encontrado en este trabajo. Aunque no tenemos una explicación concluyente al
respecto podríamos comentar algunos aspectos para explicar estas diferencias. En
primer lugar, en esa investigación no se aclaran las dosis empleadas, las cuales pudieran
resultar inferiores a las utilizadas en este estudio, en segundo lugar no sabemos si los
efectos observados en nuestro caso son atribuibles a las algas por si mismas o si
pudieran deberse a la presencia de simbiontes asociados y/o metabolitos secundarios los
cuales pueden variar significativamente de un ecosistema a otro. Específicamente, han
sido descritos efectos de microalgas sobre el Sistema Nervioso, las cuales pudieran estar
asociadas a las macroalgas y por lo tanto no se descarta que pudieran ser las
responsables de esta actividad.
Es necesario realizar estudios de aislamiento y purificación para la determinación de los
compuestos responsables de estas actividades así como su naturaleza química. Algunas
investigaciones refieren que los terpenos, presentes en algas rojas, presentan
propiedades depresivas sobre el Sistema Nervioso Central (Taylor et al., 1981). En el
caso de las algas pardas, como las que resultaron positivas en este estudio, también se
ha reportado la presencia de terpenos. Específicamente los terpenos han sido propuestos
como marcadores taxonómicos en el género Dyctiota debido a que están presentes en
altas concentraciones. (Calvanti et al., 1998).
Finalmente, los resultados de la evaluación del extracto etanólico al 10 % del alga
Dyctiota sp. en los modelos conductuales para la detección de compuestos con actividad
ansiolítica y antidepresiva apuntan hacia un posible efecto sedante (tanto en ratones
como en ratas), lo que avala el interés en continuar los estudios con el extracto de esta
especie.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo ha sido realizado como parte del proyecto X-8 de Antidepresivos.Ansiolíticos
del CYTED.
REFERENCIAS
Alphose K. (1988) Utilizacao terapeutica ble substancias bioactivas de origem mariha: do
mito a realidade Parte II Rev. Bras. Farm. 69 (4), 53.
Browning RA. (1987) The role of neurotransmitters in electroshock seizure models. In:
Jobe PC, Laird II HE, eds., Neurotransmitter and epilepsy. New Jersey: The Human
Press, 277.
Ben-Ari Y. and Cossart R. (2000) Kainate, a double agetn that generates seizures: two
decades of progress. Trends Neurosci. 23 (11), 580.
Calvanti D.N., Bemfica R.C and Teixeira V.L. (1998) Chemotaxonomy of Dyctiotales
(Phaeophyla) 7: Chemical similarity among population of Dyctiota. Proceedings 4to.
Congreso Latinoamericano de Ficología, Brazil.
Cannell R.J. (1998): Natural Products Isolation en Methods in Biotechnology, 4, Editora
Humana Press, Totowa, New Jersey, 473.
Díaz-Véliz G., Butrón S., Benavides M.S., Bussaubat N., Mora S (2000). Gender, estrous
cycle, ovariectomy and ovarian hormones influence the effects of diazepam on
avoidance conditioning in rats. Pharmacology, Biochemistry and Behaviour, 66 (4),
887.
Kamat S.Y., Wahidulla S., Dsouza L., Naik C.G., Ambiye V., Bhakuni D.S., Jain S., Goel
A.K., Srimal R.C. (1994) Bioactivity of Marine Organisms: Part VII-Effect of seaweed
extract on Central Nervous System. Indian J. Exp Biol Jun, 32(6), 418.
Kelecom A. (1986) Utilizacăo terapěutica de substăncias bioativas de origem marinha: do
mito a realidade. Parte I. Rev. Bras. Farm. 67, 77.
Lister R.G. (1987) The use of a plus-maze to measure anxiety in the mouse.
Psychopharmacology. 92, 180.
Littler D.S. and Littler M.M. (2000): Caribbean Reef Plants. Off Shore Graphics, Inc,
542.
Mozzachiodi R. , Scuri R. , Roberto M. and Brunelli M. (2001) Caulerpenyne, a toxin from
the seaweed Caulerpa taxifolia, depresses afterhyperpolarization in invertebrate
neurons Neuroscience, 107, 3, 519.
Payri C., Khalifa N., Deslandes E. and Managau (1995) Pharmacological screening of
some seaweed from Tahití (French Polynesia) for Central Nervous System activity.
XVth. International Seaweed Symposium Valdivia-Chile. January 8-14.
Pérez-Saad H., Buznego M.T., Llanio M., Fernández M.D. (2003) Perfil
Neurofarmacológico de Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng (orégano francés)
Revista Neurología 36 (1), 98.
Pellow S., Chopin P., File S.E., Briley M. (1985) Validation of open: closed arm entries in
an elevated plus-maze as a measure of anxiety in rat. J. Neurosci. Meth. 14, 149.
Porsolt, R.D., Anton, G., Blavet, N and Jalfre, M. Behavioural despair in rats: a new model
sensitive to antidepressant treatments. Eur. J. Pharmacol., 47: 379-391, 1978.
Shiomi K..H., Kamiya Y. and Shimizu (1979): Purification and characterization of an
agglutinin in the red alga Agardhiella tenera Biochim. and Biophyc. Acta 576, 118.
Taylor K.M., Baird-Lambert J, Davis P.A. and Spence I. (1981) Methylplysinopsin and
other marine natural products affecting neurotransmission. Fed. Proc., January; 40
(1), 15.