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Polipi ghiandolari fundici associati ad ectopia di mucosa gastrica in duodenum: studio istologico ed immunoistochimico di 16 casi

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UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI MILANO
Facoltà di Medicina e Chirurgia
Corso di Laurea in Tecnico di Laboratorio Biomedico
POLIPI GHIANDOLARI FUNDICI SPORADICI ASSOCIATI AD
ECTOPIA DI MUCOSA GASTRICA IN DUODENO: STUDIO
ISTOLOGICO ED IMMUNOISTOCHIMICO DI 16 CASI
Relatore: Chiar.mo Dr. Dario BAUER
Correlatore: Dr. Paolo DECLICH
Tesi di Laurea di:
Jacopo Belloni
Matr. n. 782185
Anno Accademico 2012-2013
2
INDICE
Introduzione pagina 3
Metodi pagina 10
Risultati pagina 18
Conclusioni pagina 31
Riassunto pagina 36
Bibliografia pagina 41
3
INTRODUZIONE
4
Lo stomaco umano è suddiviso anatomicamente in cardias, fondo e corpo e
regione antro-pilorica. A questa suddivisione anatomica, corrispondono
variazioni istologiche della mucosa di rivestimento: mucosa di tipo cardiale,
corpo-fundico ed antro-pilorico (1).
Figura 1: mentre nella mucosa antrale il compartimento superficiale-foveolare e quello
ghiandolare occupano all’incirca il medesimo spessore (1A), nella mucosa corpo-fundica le
ghiandole occupano circa 3/4 dello spessore della mucosa (1B) (ref 2).
.
La mucosa cardiale ed antro-pilorica sono molto simili tra loro. Il
compartimento ghiandolare occupa circa la metà dello spessore (2), e le
ghiandole sono rivestite da epitelio mucoso con ampio citoplasma PAS
positivo. Nel cardias, intercalate alle cellule mucose troviamo cellule endocrine
tipo ECL, mentre la mucosa antro-pilorica presenta cellule G, secernenti
gastrina
Nella mucosa corpo-fundica, presente nei 2/3 prossimali dello stomaco, il
compartimento ghiandolare occupa 3/4 dello spessore della mucosa (2). Esso
presenta tre tipi cellulari: le cellule parietali, eosinofile, di forma piramidale, che
secernono l’HCl ed il fattore intrinseco anti-pernicioso; le cellule principali,
cuboidali, intensamente basofile che secernono il pepsinogeno; sparse cellule
5
endocrine ECL. che sintetizzano istamina e probabilmente peptidi con
funzione regolatoria (3). Le cellule cilindriche mucose sono limitate all’epitelio
di superficie e foveolare.
I polipi ghiandolari fundici (FGPs) sono piccoli polipi sessili (3-5 mm),
spesso multipli, della mucosa corpo-fundica dello stomaco. (figura 2).
Figura 2: endoscopicamente i polipi ghiandolari fundici appaiono come minute rilevatezze
rivestite da mucosa rosea, non infiammata.
Essi sono stati descritti sia come forma sporadica, non associati ad altre
patologie gastro-intestinali, con prevalenza nel sesso femminile (4, 5, 6), sia
associati (forma sindromica) alla poliposi familiare del colon classica (FAP) (7)
o forme attenuate (AFAP) (8), alla Sindrome di Zollinger-Ellison (9, 10), e
recentissimamente descritti nello spettro patologico di una sindrome chiamata
“Gastric Adenocarcinoma and Proxymal Polyposis of the Stomach (GAPPS)
(11, 12).
Siano essi sporadici, o associati ad altre condizioni patologiche, i FGPs dal
punto di vista microscopico presentano un identico aspetto istologico. Essi
sono caratterizzati da un accorciamento delle foveole gastriche e da multiple
dilatazioni sia di tipo superficiale (con cellule mucose), sia da dilatazioni
profonde ghiandolari (rivestite da cellule parietali e principali) (figura 3).
6
Figura 3: il polipo mostra a basso ingrandimento (3a) le tipiche dilatazioni cistiche; a maggiore
ingrandimento, si nota la componente foveolare superficiale (3b), e la componente
ghiandolare profonda con cellule parietali e principali (3c)
La giunzione gastro-duodenale è poco demarcata dal punto di vista
istologico. Lingue irregolari di mucosa antrale possono estendersi per 1-2 mm
nel duodeno anatomico, seguita per ulteriori 2-3 mm da segmenti di epitelio
“transizionale” caratterizzato da una combinazione di mucosa antrale e del
piccolo intestino (13). È possibile apprezzare tale tipo di mucosa anche in
sezioni colorate con ematossilina-eosina, ma questa viene evidenziata molto
più facilmente con la colorazione per l’Alcian ph2,5-PAS (figura 4).
7
Figura 4: alla giunzione gastro-duodenale si nota la transizione tra epitelio gastrico PAS
positivo (in rosso) e i villi intestinali del duodeno con epitelio cilindrico assorbente con cellule
caliciformi Alcian positive (in blu-violetto). La mucosa duodenale mostra un’area di ghiandole
di Brunner, visibili nell’immagine anche nella sottomucosa. Un villo vicino alla giunzione
mostra un’area PAS-positiva di tipo foveolare (freccia), reperto normale in questa sede. In
zone del duodeno più distali tale reperto di mucosa transazionale è chiamato metaplasia
foveolare (da ref.13 )
Caratteristica distintiva del duodeno è la presenza delle ghiandole di
Brunner. Queste sono ghiandole tubulo-acinose rivestite da epitelio cuboidale,
che secernono muco neutro. Le ghiandole di Brunner sono descritte come
8
ghiandole situate nella mucosa, ma, mediamente, un terzo circa di tali
ghiandole è localizzato nella mucosa duodenale. Le ghiandole di Brunner
drenano il proprio secreto per mezzo di dotti che attraversano la muscularis
mucosae e giungono a vari livelli nelle cripte di Lieberkün (13).
La presenza nel duodeno, oltre l’area di mucosa transizionale, di mucosa di
tipo gastrico è stata interpretata sia come una eterotopia di tipo congenito, sia
come un processo reattivo metaplastico. L’ eterotopia è definita come
presenza di un tessuto adulto maturo in sedi in cui normalmente non è
presente, mentre la metaplasia è definita come la trasformazione da un tipo di
tessuto maturo ad un altro tipo di tessuto maturo, spesso come risultato di un
processo infiammatorio (14).
La metaplasia gastrica in duodeno è caratterizzata dalla presenza di un
rivestimento superficiale di tipo mucosecernente PAS-positivo (figura 5) che
sostituisce il normale epitelio assorbente, eventualmente associata ad
infiammazione (“duodenite peptica”), mentre l’eterotopia corpo-fundica
duodenale è caratterizzata dalla presenza di ghiandole specializzate di tipo
corpo-fundico (15). Attualmente, la presenza di mucosa corpo-fundica in
duodeno è pressoché unanimemente considerata una eterotopia (14).
Figura 5: La porzione superficiale del villo mostra un epitelio mucosecernente di tipo
foveolare gastrico (4a), evidenziato in rosso dalla colorazione istochimica Alcian-PAS (4b)(da
ref. 15)
)
9
Dal punto di vista endoscopico, l’eterotopia corpo-fundica in duodeno
appare come minuta modularità o come rilevatezza sessile (16).
Sono stati segnalati in letteratura casi di FGPs associati alla presenza di
mucosa di tipo “gastrico” in duodeno. Sipponen et al. riportarono per primi nel
1983 la presenza di due casi di eterotopia “gastrica” nei loro 52 pazienti con
FGPs sporadici (5), mentre Ferrara et al. nel 1993 e successivamente Declich
et al. nel 2005 descrissero complessivamente cinque casi di eterotopia
“fundica” nei loro 70 pazienti con FGPs sporadici (17, 18). Entrambi i gruppi
non riportavano ulteriori dettagli istologici o istochimici su tali reperti.
Il fatto che l’eterotopia corpo-fundica in duodeno si presenti
endoscopicamente come minuta rilevatezza (14), ha portato Zygulska et al.
(19) ad interpretare come FGPs aree multiple di eterotopia corpo-fundica. In
realtà, l’immagine riportata da tali autori, mostrerebbe un area di mucosa
corpo-fundica priva di dilatazioni cistiche, e quindi a nostro parere,
interpretabile come eterotopia e non come polipo fundico (20).
Recentemente, studiando una casistica di pazienti con FGPs non correlata
con i nostri precedenti risultati, abbiamo deciso di riconsiderare l’associazione
tra FGPs e presenza di mucosa “gastrica” in duodeno, prendendo in
considerazione:
valutazione del tipo di mucosa presente (gastrica fundica piuttosto
che di tipo non specializzato antrale), sia usando tecniche
istologiche, sia usando marker immunoistochimici caratteristici dei
differenti tipi cellulari;
la frequenza della associazione tra FGPs e presenza di mucosa
gastrica in duodeno confrontando tale frequenza con quella della
popolazione endoscopica generale nello stesso periodo (novembre
1997-aprile 2013);
valutare la possibile presenza nella mucosa gastrica in duodeno di
alterazioni (dilatazioni cistiche, accorciamento delle foveole) simili
alle caratteristiche istologiche dei FGPs;
Valutazione del valore diagnostico sia delle colorazioni istochimiche
usate, sia degli anticorpi testati.
10
METODI
11
Tra i 448 casi di FGP pervenuti dal novembre 1997 all’ aprile 2013, sono stati
selezionati 16 pazienti che accanto ad una biopsia diagnostica per FGP,
avessero anche una biopsia con “mucosa gastrica” in duodeno (dal bulbo al
tratto D2): le diagnosi originali erano di ectopia di tipo fundico, corpo fundico
gastrico e cardiale, metaplasia gastrica in duodeno.
Le biopsie gastriche e duodenali dei 16 pazienti e 4 campioni di controllo di
mucosa dell’antro e del corpo normali, pervenute fissate in Bouin diluito al fine
di preservare la morfologia e l’architettura del tessuto, sono state processate
secondo le procedure standard dei campioni istologici, con l’utilizzo di un
processatore automatico (LEICA ASP 300). Dai frammenti inclusi in paraffina
e tagliati al microtomo, sono stati allestiti 8 vetrini: tre per le colorazioni
istochimiche (EE, Giemsa, Alcian PAS) e cinque utilizzati per le indagini di
immunoistochimica.
Ematossilina-eosina: colorazione istologica di base
Sparaffinatura delle sezioni mediante xilolo e
trattamento con scala discendente degli alcoli
Lavaggio in H2O corrente per reidratare il pezzo e
permettere la successiva colorazione.
Colorazione con ematossilina di Harris per 5 minuti
Lavaggio in H2O corrente per 10 minuti
Differenziazione in acqua cloridrica (H2O+HCl 37%) per
1 secondo
Viraggio in H2O corrente per 10 minuti
Colorazione con eosina per 4 minuti
Rapido lavaggio in H2O corrente per 1 secondo
Disidratazione mediante scala ascendente degli alcoli
Diafanizzazione in xilolo mediante 3 passaggi di 3 minuti
ciascuno
Montaggio automatizzato in DPX
Risultato: i nuclei e le sostanze basofile sono colorati in blu
mentre i citoplasmi e le sostanze acidofile in rosa. A livello del
fondo gastrico le cellule parietali sono particolarmente acidofile e
colorate in rosa, mentre le cellule principali intensamente
basofile e colorate in blu
12
Giemsa: metodo per evidenziare la presenza dell’H. pylori su
sezioni di tessuto e per distinguere le componenti principali e
parietali della mucosa gastrica (21).
Sparaffinatura delle sezioni mediante xilolo e trattamento
con scala discendente degli alcoli
Lavaggio in H2O corrente per reidratare le sezioni per 10
minuti.
Immersione delle sezioni nella soluzione di Giemsa diluito
(1:5 con H2O distillata) per 12 minuti
Decolorazione tramite 2 passaggi in alcool 95°
Disidratazione tramite 3 passaggi in alcool isopropilico
Diafanizzazione tramite 2 passaggi in xilolo
Montaggio automatizzato tramite DPX
Risultato: i nuclei risultano colorati in blu, il batterio H. pylori
colorato in blu intenso e i citoplasmi basofili in blu pallido. Le
cellule principali mostrano un intenso colore blu mentre le parietali
risultano di un colore azzurrino.
Alcian Pas: metodica per evidenziare le mucine acide e neutre
su sezione istologica
Sparaffinatura delle sezioni mediante xilolo e trattamento
con scala discendente degli alcoli.
Lavaggio in H2O distillata per reidratare le sezioni.
Colorare la sezione con 10 gocce di Alcian Blu a pH 2.5
(Mowry) per 30 minuti.
Sodio tetraborato in soluzione (10 gocce) per un tempo di
azione di 10 minuti in seguito a sgocciolamento del vetrino.
Lavaggio in H2O distillata.
Acido Periodico 1% per 15 minuti.
Lavaggio delle sezioni in H2O corrente per 10 minuti e
breve risciacquo in H2O distillata.
Immersione del vetrino in reattivo di Schiff per 50-60
minuti.
Lavaggio in H2O corrente per 10 minuti.
Disidratazione mediante scala ascendente degli alcoli.
Diafanizzazione tramite 2 passaggi in xilolo.
Montaggio in DPX.
.
Risultato: i mucopolisaccaridi acidi si colorano di blu, mentre
quelli neutri si colorano di rosso.
Con il termine immunoistochimica (IHC) si definiscono le tecniche e i metodi
per evidenziare morfologicamente la localizzazione di uno o più antigeni su
13
cellule isolate, preparati istologici e citologici mediante l’utilizzo di anticorpi
specifici, attraverso la formazione del complesso antigene-anticorpo reso poi
visibile al microscopio grazie all’impiego di sistemi di rivelazione di tipo
enzimatico o fluorescente e da un cromogeno. All’interno di un laboratorio di
Anatomia Patologica, l’IHC costituisce un settore diagnostico e prognostico
che si affianca alle tradizionali indagini morfologiche e istochimiche, al fine di
consentire una più precisa definizione delle lesioni ed una migliore
conoscenza circa la loro evoluzione.
Le nostre indagini di IHC sono state eseguite utilizzando un coloratore
automatico Ventana, modello Benchmark XT (figura 6)
Figura 6: Processatore automatico Benchmark XT Ventana
14
Questa apparecchiatura, grazie ad un sistema a “codice a barre”, è in grado
di riconoscere sia i reagenti che i vetrini e di eseguire automaticamente tutti
gli step di un protocollo di colorazione (sparaffinatura-smascheramento
termico o enzimatico- temperatura d’incubazione dell’anticorpo- tempo di
incubazione - controcolorazione); il protocollo, specifico per ciascun anticorpo
utilizzato, viene selezionato nella fase di stampa delle etichette, utilizzando un
software del computer collegato al processatore stesso.
Lo strumento si struttura in tre principali componenti:
una parte superiore che svolge la vera e propria colorazione
un sistema di taniche per i liquidi e i reflui di scarico
un computer che gestisce diverse operazioni: dall’avvio della corsa di
colorazione, alla registrazione dei reagenti im piegati, la stampa delle
etichette con codice a barre e la creazione di nuovi protocolli.
La parte superiore, il “sistema coloratore”, comprende due caroselli: uno
destinato al posizionamento dei vetrini su appositi thermopad, ognuno dotato
di sensore per il controllo della temperatura, e l’altro dedicato ai dispensatori
dei reagenti. La rotazione di queste due piattaforme permette ad un sistema
ottico di leggere il codice a barre presente sia sul dispensatore (prep-kit)
riconoscendo il reagente, che sul vetrino idendificando il protocollo di
colorazione.
Il sistema di contenitori, invece, è dotato di un compressore che consente il
passaggio dei liquidi e di aria pressurizzata nella parte superiore
dell’apparecchio.
Le taniche in plastica per i liquidi hanno una capacità di 3,5 e 5 litri e
contengono:
EZ PREP (diluizione 1:10) tampone per sparffinatura
LCS (prediluito) olio liquido cover slip
SSC (diluizione 1:5) tampone di stringenza
Reaction buffer(diluizione 1:10) due taniche collegate tra loro
CC1 (prediluito) tampone pH 8 per lo smascheramento
CC2 e OPTIONAL reagenti opzionali
Le due taniche per la raccolta degli scarichi, hanno capacità di 20 litri e sono
dotate di un sensore che permette di monitorare il livello dei reflui.
15
Per il nostro studio immunoistochimico sono stati utilizzati i seguenti materiali:
“XT ULTRAVIEW DAB” come sistema di rivelazione: un metodo
immunoenzimatico che utilizza la DAB (diamminobenzidina) come
cromogeno conferendo al tessuto una colorazione marrone-bruno in
corrispondenza delle zone dove è avvenuto il legame Ag-Ab.
Anticorpi: Mucin 6- Mucin 5 (due cloni )- Shh- Betacatenina
o Anticorpo anti-MUC6 (CLH5): La MUC6 è una glicoproteina di
grosse dimensioni espressa a livello delle cellule mucose del
collo, a livello delle ghiandole antrali e di Brunner (22); secondo
Singhi et al. dovrebbe essere positiva anche a livello delle cellule
principali (23)
o Anticorpi anti-MUC5AC (45M1 e 1-13M1): la MUC5AC è una
mucina secreta dall’epitelio di gastrico di superficie e foveolare
(22).
o Anticorpo anti-Sonic hedgehog (Shh, H-160 sc-9024): Shh è una
sostanza che svolge molteplici funzioni all’interno dell’organismo.
A livello gastrico ha funzione morfogenetica ed è essenziale per la
differenziazione delle cellule staminali in cellule principali e
parietali dello stomaco umano. Nella mucosa umana normale si
distribuisce esclusivamente nelle cellule parietali (24, 25).
o Anticorpo monoclonale anti-βcatenina (Ventana): la βcatenina è
una molecola proteica con funzioni di stabilizzazione e
mantenimento delle strutture cellulari e coinvolta nei meccanismi
di trascrizione genica. È stata descritta a livello gastrico, senza
ulteriori specificazioni di citotipo (26, 27).
Per ogni blocchetto preso in esame, sono stati allestiti cinque vetrini
polilisinati (uno per anticorpo) con sezioni dello spessore di 2-3 microm. Inoltre
sono stati preparati dei vetrini di controllo con sezioni di mucosa antrale e
corpo gastrico di aspetto normale, utilizzati anche per le prove di titolazione
degli anticorpi impiegati.
16
Una volta raccolte le sezioni, i vetrini sono stati lasciati ad asciugare all’aria
per 24 ore, e successivamente posti in stufetta a 60°C per circa 15 minuti, allo
scopo di migliorare l’adesione del tessuto al vetrino portaoggetto, così da
evitarne il distacco durante la fase di smascheramento.
I vetrini pronti, identificati con l’etichetta bar-code che individua il protocollo
di colorazione, sono stati collocati sui thermopad dell’immunocoloratore e
all’avvio della corsa , riscaldati a 75°C e sparaffinati mediante l’impiego di EZ
PREP.
Per ogni anticorpo utilizzato sono stati definiti specifici protocolli
Di seguito viene riportata la tabella che illustra per ogni antisiero il tempo di
smascheramento dei siti antigenici, la concentrazione, il tempo e la
temperatura di incubazione.
Smascheramento
Diluizione
Ab
Tempodi
incubazione
°C
incubazione
MUCIN6Esteso(90’)1:101h37°C
MUCIN5AC
45M1
Nessuno1:10032’T.ambiente
MUCIN5AC1
13M1
Nessuno1:10032’T.ambiente
Shh(H160sc
9024)
Ridotto(30’)1:201h37°C
βcateninaStandard(60’)Prediluito32’37°C
Alla fine dell’incubazione viene dispensato il cromogeno 3,3’
Diaminobenzidina (UV DAB) che reagendo con la perossidasi produce un
precipitato marrone, rendendo così visibile al microscopio i siti di legame Ag-
Ab, perfettamente distinguibili sulla sezione, in quando eventuali legami
aspecifici o precipitati vengono eliminati dall’aggiunta di una aliquota di UV
COPPER. Infine l’ultimo passaggio prevede una lieve controcolorazione dei
17
nuclei con ematossilina (8 minuti), seguita da un lavaggio in H2O corrente per
eliminare ogni residuo di LCS, disidratazione tramite una scala ascendente
degli alcoli, diafanizzazione in xilolo e montaggio.
18
RISULTATI
19
Caratteristiche cliniche (tabella 1)
Pz. con FGP/ m.
“gastrica” in
duodeno
sporadici
15
FAP
1
7 -
8 1
F/M 0.8/1 -
Età media 61.13 31 al primo riscontro di mucosa gastrica
in duodeno
Uso di PPI+ 3/15 0/1
Tabella 1: sono riassunte le caratteristiche cliniche principali dei 16 pazienti con FGP/mucosa
gastrica in duodeno.
Nel periodo novembre 1997-aprile 2013 16 dei 448 pazienti (3,57%) con polipi
ghiandolari fundici (FGPs) avevano associate delle aree di mucosa gastrica in
duodeno. Nello stesso periodo, su 4580 pazienti con biopsie combinate
gastrica e duodenale, sono stati diagnosticati 87 casi di mucosa gastrica in
duodeno (1,89%).16 dei 103 pazienti che avevano una biopsia con mucosa
gastrica in duodeno erano associati con FGPs (15,5%). Abbiamo valutato se
la maggiore frequenza di associazione tra FGPs e mucosa gastrica in
duodeno rispetto alla popolazione endoscopica generale fosse statisticamente
significativa. Applicando alle frequenze osservate il Fisher’s exact test,
abbiamo rilevato che la differenza osservata tra i due gruppi era
statisticamente significativa (p>0,05).
Tabella 2: Con m.gastrica duod. Senza m.gastrica duod. Totale
FGPs 16 432 448
Pz. con biopsia
gastrica/duodenale
87 4493 4580
Totale 103 4925 5028
Fisher’s exact test, two tailed P=0,0228. Il risultato è statisticamente significativo
(P>0,05)
Quindici pazienti avevano un’anamnesi negativa per colon-carcinoma e
sono quindi stati classificati come portatori di FGP sporadici. Un paziente era
sotto controllo dopo colectomia totale per FAP.
20
Per quanto riguarda possibili influenze di una terapia con inibitori della
pompa protonica (PPI) sulla genesi di FGPs o della mucosa gastrica in
duodeno, solo tre dei 15 pazienti con FGPs sporadici avevano fatto uso in
precedenza di tali farmaci. Il paziente con FGPs associati a FAP non ne aveva
mai fatto uso nei 16 anni di controlli endoscopici.
Generalmente, i pazienti con FGPs sporadici hanno una prevalenza
femminile (rapporto femmine/maschi di 2,1/1) e un’età media di 57,8 anni (36).
L’attuale gruppo di pazienti con associazione FGPs/mucosa gastrica in
duodeno mostrava invece una età media lievemente maggiore (61,1 ) ed un
rapporto femmine/ maschi di 0.8/1. Abbiamo allora confrontato l’età media dei
15 pazienti con polipi sporadici ed eterotopia con l’età media di un secondo
campione di 26 pazienti consecutivi con soli polipi, usando il test T di Student
con due gradi di libertà, e prendendo come limite di significatività P> 0,05. Il
test ha mostrato che tra i due campioni, non c’è una differenza significativa di
età (P=0,0513).
Tabella 3 età media FGP/m. gastrica duodeno Solo FGP
Età Media 61.13 58.04
Deviazione standard 11.54 15.30
Totale pazienti 15 26
Test T di Student P= 0.5013 La differenza tra i due campioni non è statisticamente
significativa
A
nche il confronto del rapporto femmine maschi tra pazienti con e senza
mucosa gastrica in duodeno, applicando il Fisher’s exact test ha mostrato che
tra i due gruppi non c’è una differenza statisticamente significativa
Tabella 4: rapporto
femmine/maschi
FGP/m. gastrica in duodeno Solo FGP
Femmine 7 19
Maschi 8 7
Totale 15 26
Fisher exact test P= 0,1080 differenza non statisticamente significativa
21
Endoscopicamente, tutti i 16 pazienti presentavano polipi multipli (1-20),
sessili, di piccole dimensioni (diametro di 2-5 mm) rivestiti da mucosa rosea,
non infiammata, del tutto analoga alla mucosa corpo-fundica circostante.
Le aree di mucosa gastrica in duodeno (sedi dal bulbo duodenale alla 2a
porzione duodenale) apparivano in tutti casi studiati come minime rilevatezze,
, ai polipi.
Istologia
Polipi ghiandolari fundici- Tutti i 16 pazienti con FGP (15 sporadici, 1
sindromico) avevano uno o più prelievi bioptici diagnostici per FGP, con
dilatazioni multiple, con un diametro non omogeneo, sia superficiali, sia
ghiandolari profonde, eventualmente con protrusioni intraluminali irregolari e
accorciamento delle foveole gastriche. Le dilatazioni cistiche erano rivestite da
tutti e tre i tipi istologici della mucosa corpo-fundica: cellule colonnari
mucosecernenti (foveolari), cellule parietali (eosinofile di forma piramidale) e
cellule principali (basofile), con una prevalenza delle cellule mucose o delle
cellule parietali/principali nelle singole cisti (Figura 7). Si notavano cisti anche
profonde con un rivestimento di cellule foveolari.
22
Figura 7: il polipo presenta numerose dilatazioni cistiche, non omogenee, rivestite da cellule
mucose, parietali e principali (7a); a maggiore ingrandimento (7b) si notano varie piccole cisti
rivestite da cellule parietali e principali (*), una cisti rivestita solo da cellule mucose (§) e una
cisti con un’area rivestita da cellule mucose (freccia) (7a, EE, 10X; 7b EE, 20X)
La lamina propria della mucosa era priva di significativo infiltrato
infiammatorio, occasionalmente con lieve edema. La colorazione
istochimica di Giemsa utilizzata per la ricerca di Helicobacter pylori (H.
pylori) risultava risultata negativa in tutti i 16 FGP. La colorazione di
Giemsa rendeva più facile la distinzione tra cellule parietali (colorate in
azzurro chiaro) e le cellule principali (colorate di blu scuro)(figura 8). La
colorazione istochimica per le mucine acide e basiche Alcian ph 2,5-
PAS mostrava in tutti casi l’assenza di metaplasia intestinale e colorava
intensamente di rosso sia l’epitelio di superficie che foveolare, sia la
componente di cellule mucose delle cisti
23
Figura 8: in questo caso di eterotopia fundica in duodeno, la colorazione di Giemsa colora di
azzurro tenue le cellule parietali, mentre le principali sono colorate di blu scuro (Giemsa, 40X)
Mucosa gastrica in duodeno
Quindici dei 16 pazienti avevano una diagnosi originale di ectopia/eterotopia di
mucosa corpo-fundica in duodeno; una paziente aveva una diagnosi originale
di “mucosa bulbare con area nodulare di ectopia cardiale”. Due pazienti (uno
con FGPs sporadici, l’altro associato a FAP) avevano avuto la presenza di
“ectopia gastrica fundica in duodeno” in due diversi esami endoscopici. Alla
revisione, la colorazione con ematossilina-eosina mostrava in tutti e 16 i
pazienti la presenza nella lamina propria del duodeno di ghiandole
specializzate corpo-fundiche. Il Giemsa, colorando differenzialmente cellule
parietali e principali (azzurro tenue e blu scuro rispettivamente) permetteva un
riconoscimento più sicuro. Le aree di eterotopia potevano essere costituite da
minimi gruppi di ghiandole (diametro di 300-500 micron) a frammenti di 1-2
mm in cui era difficile distinguere aree residue di epitelio duodenale. La
colorazione con Alcian-PAS mostrava sia frammenti bioptici con epitelio di
superficie di tipo duodenale (cellule assorbenti negative con cellule caliciformi
blu) che di tipo gastrico (epitelio di superficie mucosecernente intensamente
24
rosso) sino a frammenti diffusamente di tipo gastrico, con focali aree residue
di tipo intestinale. Al di sotto dell’epitelio di superficie erano sempre presenti in
tutti i casi presenti ghiandole di tipo corpo-fundico. In tutti i casi quindi veniva
confermata la diagnosi di “eterotopia corpo-fundica in duodeno”.
Figura 9: l’Alcian-PAS evidenzia le mucine neutre dell’epitelio di superficie e delle ghiandole
di Brunner (Alcian-PAS, 10X)
In tutti i 16 casi di mucosa eterotopica, si notava nella porzione più profonda
della lamina propria la presenza di ghiandole di Brunner, in continuità con la
componente sottomucosa delle stesse (figura 8).
In due dei 16 casi di mucosa eterotopica, si notavano rare dilatazioni, simili
a quelle diagnostiche per polipo fundico. La colorazione con l’Alcian-PAS ne
evidenziava la componente mucosa. (figura 12b)
25
Immunoistochimica (tabella 5)
ControlliCtrl.1Ctrl.2Ctrl.3Ctrl.4
MUC6C‐ C‐A+C‐A+C‐A+
MUC5AC113M1C++ C+ A+ C+ A+ C+ A+
MUC5AC45MC+ C- A+ C- A- C- A+/-
Shh(H160)C- C- A- C- A- C+ A+
βcateninaC++ C+ A+ C+ A+ C+ A+
F
FG
GP
P
N
Ne
eg
g.
.
+
+/
/
+
+
+
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+
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MUC5AC45M7 2 6 3
Shh(H160)15 1 2 0
βcatenina0 0 0 18
Tabella 5: sono riportati i risultati immunoistochimici di controlli, polipi ed eterotopie. Per quanto
riguarda le eterotopie, sono stati valutati immunoistochimicamente anche entrambi i due casi
che avevano un doppio prelievo.
Nella tabella 5 sono riportati i risultati immunoistochimici sui 4 controlli di
mucosa corpo-fundica e antrale normali, sui 16 polipi e sui 16 casi di
eterotopia corpo-fundica in duodeno.
26
L’anticorpo anti MUC6 si è dimostrato sempre negativo sulla mucosa
corpo-fundica dei controlli e nei FGPs, mentre si è dimostrato intensamente
positivo nelle ghiandole profonde della mucosa antrale di controllo e nelle
ghiandole di Brunner (sia nella parte profonda della lamina propria, sia nella
sottomucosa) presenti nelle biopsie di mucosa eterotopica in duodeno.
Figura 10: caso 3, eterotopia. L’anticorpo anti-MUC6, totalmente negativo sull’epitelio di
superficie colora le ghiandole di Brunner (20X)
Abbiamo usato due diversi anticorpi contro la mucina MUC5AC, il clone 1-
13M1 e 45M1. Il MUC5AC (1-13M1) ha colorato in tutti i casi l’epitelio di
superficie e foveolare di mucosa corpo-fundica e antrale di controllo, tutti i 16
FGPs, ed i 16 casi di eterotopia.
27
Figura 11: caso 3, eterotopia. L’anticorpo anti-MUC5AC(1-13M1), colora esclusivamente
l’epitelio di superficie e foveolare, mentre le ghiandole di Brunner sono negative (20X)
Nei polipi, la positività si estendeva anche nelle cisti, talora anche in cisti
profonde, evidenziandone la componente foveolare.
Anche nei 2 casi di eterotopia con dilatazioni cistiche il MUC5AC (1-13M1)
mostrava focale positività intracistica al di sotto delle foveole. Il MUC5AC (1-
13M1) era sempre negativo sia nella mucosa duodenale, sia nelle ghiandole di
Brunner (figura 12)
28
Figura 12: caso 7, eterotopia con dilatazione. La dilatazione profonda visibile con
ematossilina eosina (a), mostra focale positività al PAS (b), confermata dalla positività con
l’anticorpo anti-MUC5AC (c). L’anticorpo anti-MUC6 mostra focale positività nelle ghiandole di
Brunner (d) (a,b,c,d, 10X)
Il secondo clone, MUC5AC (45M1) mostrava una positività ridotta, spesso
del tutto assente in aree in cui l’Alcian-PAS e MUC5AC (1-13M1) mostravano
chiaramente la presenza di una componente mucosa foveolare (figura 13).
Figura 13: controllo 1,la colorazione con anti-MUC5AC(1-13M1) appare molto più intensa e
diffusa rispetto all’anti-MUC5AC(45M1) (Immunoistochimica, 5X)
29
L’anticorpo anti-SHH (H-160) mostrava una debole o minima positività
citoplasmatica nel compartimento ghiandolare acido-peptico in 1 dei 4 dei
controlli, in 11 dei 16 FGPs e in 3 dei 18 campioni di eterotopie. Spesso
risultava in una colorazione di fondo, non significativa. Laddove selettivamente
e chiaramente positivo, mostrava nelle ghiandole acido-peptiche un gradiente
di intensità crescente dalla porzione superficiale a quella profonda delle
ghiandole. A maggior ingrandimento, sembrava di fatto positivo nelle cellule
principali piuttosto che parietali (figura 13).
Figura 15: controllo 1. L’anticorpo Shh appare diffusamente positivo nelle cellule principali,
mentre le cellule parietali appaiono negative(freccie) (40X)
L’anticorpo anti β-catenina si è dimostrato positivo in tutti i 16 pazienti ed
in tutti i 18 campioni (positività di membrana) sia a livello dell’epitelio di
superficie-foveolare, sia nel compartimento acido-peptico di controlli, FGPs ed
eterotopie..A livello delle ghiandole acido-peptiche ha dimostrato un gradiente
di intensità decrescente dalla porzione superficiale a quella profonda delle
ghiandole.
30
Figura 13: controllo 1. L’anticorpo anti βcatenina mostra una decrescente positività, dalla
porzione superficiale e auqlle profonda delle ghiandole immunoistochimica
(Immunoistochimica, 40X)
Due pazienti (1 con FGP sporadici, l’altro con FGP sindromici) avevano
avuto un prelievo di eterotopia corpo-fundica in duodeno di due successivi
esami endoscopici. Il primo paziente (caso 3, sporadico) aveva avuto un
profilo immunoistochimico .
.MUC6++, MUC5AC (1-13M1)++, MUC5AC
(45M1)++ , SHH-, β-catenina++ ed un profilo MUC6++, MUC5AC (1-13M1)+,
MUC5AC (45M1)-, SHH-, β-catenina++. Nel secondo prelievo, la positività per
entrambi gli anticorpi anti MUC5AC appariva meno marcata. Il secondo
paziente (caso 12, sindromico) mostrava un profilo MUC6+, MUC5AC (1-
13M1)++, MUC5AC (45M1)+ , SHH-, β-catenina++ ed un profilo MUC6-,
MUC5AC (1-13M1)++, MUC5AC (45M1)-/+, SHH+, β-catenina++. In questo
secondo paziente, non erano presenti nel campione ghiandole di Brunner.
31
CONCLUSIONI
32
I polipi ghiandolari fundici (FGP) sono piccoli polipi sessili (2-5mm), di solito
multipli, della mucosa gastrica corpo-fundica, che appaiono
endoscopicamente rivestiti da mucosa rosea non infiammata. Istologicamente,
sono caratterizzati da accorciamento delle foveole e da dilatazioni ghiandolari
cistiche rivestite sia da cellule mucose, che principali e parietali. Identici dal
punto di vista istologico, i FGPs sono stati descritti in forma sporadica (4, 6),
associati a poliposi familiare del colon (FAP) (7), alla Sindrome di Zollinger-
Ellison (9, 10) e recentemente associati alla sindrome GAPPS
(adenocarcinoma gastrico e poliposi prossimale dello stomaco) (11, 12).
Già nel 1983, Sipponen et al. (5) e successivamente Declich et al. (17, 18)
avevano descritto una associazione tra FGPs sporadici e la presenza di 2 e 5
casi rispettivamente di mucosa gastrica in duodeno. Entrambi i gruppi non
avevano effettuato ulteriori studi sulla natura di questo reperto. Recentemente
Genta et al. (15) e Conlon et al (28) hanno studiato casistiche di eterotopia
corpo-fundica in duodeno, delineandone con precisione l’aspetto istologico, e
distinguendola da casi di sola metaplasia foveolare di superficie. Nella nostra
casistica attuale, tutte le diagnosi originali di ectopia/eterotopia fundica
associata a FGPs sono state riviste e confermate. Mentre tra i pazienti con
biopsia gastrica e duodenale la frequenza di eterotopia in duodeno era
dell’1,9%, tra i 448 pazienti con FGPs la frequenza di eterotopia in duodeno
era del 3,6%, una differenza statisticamente significativa. D’altra parte, tra i
103 pazienti con eterotopia, la frequenza di FGPs era del 15,5%
Sia il gruppo di Genta che quello di Conlon hanno confermato una
frequente associazione tra eterotopia fundica in duodeno e FGPs (il 14,9 e
32% rispettivamente). Il nostro attuale risultato (15,5%) è assolutamente
sovrapponibile ai risultati di Genta. Un dato molto importante che emerge da
questi lavori, è la relazione inversa tra colonizzazione gastrica da Helicobacter
pylori ed eterotopia. Essendo tutti i nostri 16 pazienti Helicobacter pylori
negativi, anche i nostri dati avvalorano questa relazione.
Dal punto di vista eziologico, Genta nella discussione del proprio lavoro
ipotizza che essendo i FGPs associati alla terapia con inibitori della pompa
protonica (PPI), ed essendo l’eterotopia più frequente nei pazienti con FGPs
33
rispetto alla popolazione endoscopica generale, giunge all’ipotesi che anche
l’eterotopia in duodeno possa essere associata a trattamento con PPI. Noi
abbiamo scritto varie volte negando una associazione tra FGPs e terapia con
PPI (29, 30, 31), descrivendo casi di iperplasia delle cellule parietali con focali
dilatazioni ghiandolari che potrebbero essere confusi con FGPs (32). Tra i
nostri 16 pazienti attuali solo 3 avevano fatto uso di PPI, rendendo quindi
improbabile l’ipotesi di un rapporto tra PPI ed eterotopia.
Nel presente studio, abbiamo usato sia nei FGPs, sia nelle eterotopie una
serie di colorazioni istochimiche ed immunoistochimiche, che hanno permesso
di delineare con maggiore facilità e precisione le caratteristiche della mucosa
eterotopica. La colorazione con Alcian-PAS ha mostrato con grande chiarezza
nei polipi la componente mucosa delle cisti, talora presente anche in cisti
profonde, un processo descritto come “metaplasia foveolare” da Pilichowska e
Borchard (33), mentre nelle eterotopie evidenziava l’epitelio di superficie di
tipo gastrico (intensamente PAS positivio) così come la presenza delle
ghiandole di Brunner, sia nella porzione profonda della lamina propria della
mucosa, sia nella sottomucosa.
Seguendo il suggerimento di Rubio et al (21), abbiamo usato
sistematicamente la colorazione di Giemsa modificata, sia nelle biopsie di
controllo, sia nei FGPs che nelle eterotopie. Questa colorazione ha
notevolmente facilitato, nelle aree più focali, il riconoscimento delle ghiandole
acido peptiche, colorando in azzurro tenue le cellule parietali ed in blu scuro le
cellule principali.
Nel presente lavoro abbiamo avuto l’occasione di testare quattro nuovi
anticorpi: un anticorpo anti-MUC6, due anticorpi anti-MUC5AC, ed un nuovo
anticorpo anti-Shh
Singhi et al. (23), hanno usato l’anticorpo anti-MUC6 (Ventana)
descrivendone la positività nelle cellule muco-peptiche e nelle cellule
principali. Nel presente lavoro, usando l’anticorpo MUC6 (CLH5) abbiamo
avuto una esperienza totalmente differente: nella mucosa corpo-fundica
normale, nei FGPs e nelle ghiandole acido-peptiche delle eterotopie abbiamo
avuto in tutti casi una negatività completa, mentre il MUC6 si è dimostrato
34
positivo nelle ghiandole antrali dei controlli e nelle ghiandole di Brunner delle
eterotopie. Evidentemente i due anticorpi hanno una diversa specificità.
Nel presente lavoro, abbiamo testato due differenti anticorpi anti-MUC5AC,
il MUC5AC(1-13M1) e il MUC5AC(45M1). Entrambi hanno mostrato una
grande specificità, risultando positivi esclusivamente sull’epitelio gastrico di
superficie e foveolare di controlli, polipi ed eterotopie, nelle aree mucose delle
cisti dei FGPs, e sempre negativo nelle ghiandole antrali dei controlli e nelle
ghiandole di Brunner.
Nei due casi di eterotopia che mostravano focali dilatazioni cistiche, i due
anticorpi anti MUC5AC mostravano una focale positività nelle dilatazioni
cistiche, quindi del tutto simile a quelle dei polipi. Pur mantenendo l’dea di non
interpretare tali eterotopie con dilatazioni come FGPs ectopici (19), termine
che scondo noi porterebbe soltanto confusione, ci sembra interessante
segnalare questo reperto istologico e immunoistochimico.
Valutando comparativamente i due anticopri anti-MUC5AC, il MUC5AC(1-
13M1) mostrava una positività più intensa e completa, mentre il
MUC5AC(45M1) mostrava una positività mediamente pià debole, focale e
talora assente.
Volendo introdurre un anticorpo anti MUC5AC nella diagnostica corrente,
dato che è stato recentemente dimostrato essere un fattore prognostico
positivo nel cancro gastrico (35), la nostra scelta tecnica ovviamente è
ricaduta sul clone MUC5AC(1-13M1).
Il Shh è una molecola con un fondamentale ruolo nella differenziazione del
tubo enterico primitivo dell’embrione in senso gastrico (24). Il Shh mantiene
anche nello stomaco adulto una funzione nella normale differenziazione delle
ghiandole acido-peptiche, ed nella mucosa umana è presente unicamente a
livello delle cellule parietali (25). In precedenza abbiamo usato un l’anticorpo
anti-Shh(H19), su controlli normali e FGPs, dimostrando una positività
esclusivamente nelle cellule parietali (41).
Nel lavoro attuale, abbiamo usato su controlli, polipi ed eterotopie un nuovo
anticorpo, l’ Shh(H-160). I risultati sono stati deludenti (positività ben evidente
e leggibile solo in 1 dei 4 controlli, in 9 dei 16 FGPs ed in 2 dei 18 campioni di
35
eterotopia), e paradossali. Mentre con il precedente clone, avevamo
evidenziato un gradiente di intensità decrescente dalla porzione superficiale a
quella profonda delle ghiandole, con una positività esclusiva nelle cellule
parietali, con il clone Shh(H-160) il gradiente appariva invertito, e la positività
nelle cellule principali.
Un marker sul quale abbiamo concentrato il nostro interesse è stato la
βcatenina. La βcatenina (insieme all’APC) fa parte di una serie di molecole
importanti per l’omeostasi del compartimento ghiandolare gastrico, ed una sua
mutazione attivante, sarebbe alla base della genesi stessa dei FGP (26).
In letteratura, è già stata descritta una positività di membrana,
genericamente a livello gastrico (26, 27) Nel presente lavoro, abbiamo
dimostrato una positività per la βcatenina una positività in tutti i controlli,
FGPs, ed eterotopie, sia a livello dell’epitelio di superficie, sia nel
compartimento ghiandolare, con un caratteristico aspetto “a nido d’ape”.
Appariva anche evidente un gradiente di intensità decrescente tra la porzione
superficiale e quella profonda delle ghiandole acido-peptiche (dove
prevalgono le cellule principali. Secondo noi la βcatenina, appare positiva a
livello dell’epitelio di superficie e nelle cellule parietali.
In conclusione, abbiamo dimostrato che l’eterotopia corpo-fundica in
duodeno è significativamente più frequente nei pazienti con FGPs rispetto alla
popolazione endoscopica generale (3,6% VS 1,9%), e che i FGPs erano la
condizione clinica più frequente tra i nostri 103 pazienti con eterotopia
(15,5%). Abbiamo notato in due casi la presenza di focali dilatazioni cistiche,
simili a quelle dei FGPs.
L’uso combinato di tecniche istochimiche ed immunoistochmiche ci ha
permesso, oltre ad una più sicura dimostrazione dell’eterotopia, nei casi più
focali, di delineare un preciso fenotipo per le cellule mucose foveolari (PAS+,
MUC5AC+, MUC6-), cellule parietali (PAS-, Giemsa azzurro chiaro, MUC5AC-
, MUC6-, βcatenina+) ghiandole antrali e di Brunner (PAS+. MUC5AC-,
MUC6+) e principali (PAS-, Giemsa blu intenso)
36
RIASSUNTO
37
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L’anticorpo anti-Muc6 è risultato sempre negativo nella mucosa
corpo-fundica di controllo e nei FGPs, ma ha mostrato positività
per le ghiandole profonde della mucosa antrale e ghiandole di
Brunner.
I due anticorpi anti-Muc 5AC hanno colorato l’epitelio di superficie
e foveolare nei controlli, nei FGPs e nelle eterotopie, mentre sono
risultati sempre negativi per mucosa duodenale e ghiandole di
Brunner. Tuttavia il clone 45M1 è risultato generalmente meno
affidabile rispetto a 1-13M1, poiché la colorazione si è spesso
dimostrata ridotta o assente.
L’anti-Shh ha dato risultati positivi solo in pochi casi, nei quali si
riscontrava nelle ghiandole acido peptiche un gradiente di
intensità crescente dalla porzione superficiale a quella profonda
delle ghiandole. A maggior ingrandimento si intuiva una positività
a livello delle cellule principali.
L’anticorpo anti-βcatenina ha dato ottimi risultati sia nei casi che
nei controlli, provocando una positività di membrana a livello di
epitelio di superficie-foveolare, nel compartimento acido-peptico
(con gradiente di intensità decrescente andando verso la porzione
profonda), nei FGPs e nelle eterotopie.
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