Listeria spp. coliformes totais e fecais e E.Coli no leite cru e pasteurizado de uma indústria de laticínios no Estado da Paraíba (Brasil)

Abstract

The microbiological quality of raw and pasteurized milk was studied along its line production in a dairy factory in Paraíba State, Brazil. Listeria monocytogenes was frequent found in raw milk and the levels of total coliforms (TC), fecal coliforms (FC) and Escherichia coli, were high in the same samples. The results of 75 milk studied samples (45 raw milk, 15 recently pasteurized and 15 sacked), were distributed in two clusters, according its collected period (before and after changes in factory's hygienic process). Both raw samples groups showed high contamination. In the first period (March-April/1998), all the pasteurized milk were out of total and fecal coliforms standards. During the second period (May-August/1998), there was a significant reduction of coliforms levels, however the progress in hygienic conditions were not enough for eliminate the contamination: 11.1% of recent pasteurized milk samples and 22.2% of sacked milk samples were out of TC and also 33.3% and 44.4% recent pasteurized and sacked milk samples. Sacked milk presented more TC and FC than recent pasteurized milk, suggesting contamination after pasteurization or failure at storage. Listeria spp. was found in 33 raw milk samples (73.3%) and in 9 (30%) of pasteurized milk samples. L. monocytogenes was isolated in 17 (51.5%) raw milk samples and in 9 (100%) pasteurized milk samples (4 recent-pasteurized and 5 sacked). The Listeria spp. diversity was: L. monocytogenes (66.6%), L. innocua (25.3%), L. ivanovii (3.9%) L. welshimeri (2.5%) and L. grayi (1.5%). In the pasteurized milk was isolated only: L. monocytogenes and L. innocua. The results suggest a direct relation between high levels of coliforms and presence of Listeria spp.

Full text

Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas, 21(3): 281-287, set.-dez. 2001 281
1
Recebido para publicação em 10/01/00. Aceito para publicação
em 24/08/01. Parte da dissertação de mestrado apresentada por
R.M.R.Catão, ao Curso de Mestrado em Ciência e Tecnologia de
Alimentos da Universidade Federal da Paraíba-UFPB.
2
Departamento de Farmácia e Biologia da Universidade Esta-
dual da Paraíba-UEPB, Campus I - Campina Grande-PB.Av.
Floriano Peixoto, 718 - Campina Grande-PB. CEP 58100-001.
3
Departamento de Tecnologia Química e de Alimentos do Centro
de Tecnologia da Universidade Estadual da Paraíba-UFPB -
Campus I - João Pessoa-PB e DEC/CCT/UFPB - Campus I Cam-
pina Grande -PB.
* A quem a correspondência deve ser enviada.
RESUMO
Investigou-se a qualidade microbiológica do leite in natura e na
linha de produção (leite recém-pasteurizado e leite ensacado),
de uma usina de beneficiamento em Campina Grande-PB. Foi
pesquisada a presença de Listeria spp. e sua diversidade de
espécies, os níveis de coliformes totais (CT), coliformes fecais
(CF) e Escherichia coli. Analisou-se um total de 75 amostras de
leite, sendo 45 de leite cru, 15 de leite recém-pasteurizado e 15
de leite ensacado. Os resultados foram reunidos em dois gru-
pos segundo o período de monitoramento: antes e após mudan-
ças no processo de higienização da usina. Foi evidenciada ele-
vada contaminação nas amostras de leite cru nas duas épocas.
Na primeira (março-abril/1998), todas as amostras de leite be-
neficiado estiveram fora dos padrões da legislação vigente para
CT e CF; na segunda (maio-agosto/1998), houve acentuada re-
dução dos níveis destas bactérias indicadoras, porém as melhorias
na higienização não foram suficientes para solucionar este pro-
blema, visto que 11,1% das amostras recém-pasteurizadas es-
tavam fora dos padrões para CT e 33,3% para CF. Das amos-
tras ensacadas, 22,2% estavam fora dos padrões para CT e
44,4% para CF. Comparando-se os resultados de CT, CF, e E.coli
nas amostras de leite recém-pasteurizado e não ensacado com
as amostras de leite ensacado, foi verificado que as amostras
após serem pasteurizadas e ensacadas apresentaram valores
de CT e CF levemente mais elevados, sugerindo contaminação
durante o processo de ensacamento ou falhas na armazena-
gem. Observou-se que 33 (73,3%) das amostras de leite cru e 9
(30%) das de leite pasteurizado estavam contaminadas com Listeria
spp., sendo identificadas L. monocytogenes em 17 (51,5%) amostras
de leite cru e em 9 (100%) de leite beneficiado (4 recém-pasteu-
rizadas e 5 ensacadas). Em relação à diversidade de espécies,
nas amostras de leite cru foram encontradas: L. monocytogenes
(66,6%), L. innocua (25,3%), L. ivanovii (3,9%), L. welshimeri
(2,5%) e L. grayi (1,5%). Nas amostras de leite pasteurizado
isolaram-se: L. monocyogenes e L. innocua. O conjunto dos
resultados evidenciou deficiências higiênico-sanitárias no leite
in natura e ao longo do processo de produção, resultando em
porcentagens elevadas de amostras que ultrapassaram os valo-
res padrões de CT e CF além de apresentarem-se contamina-
das por Listeria spp., com predominância de L. monocytogenes,
sugerindo a existência de uma relação direta entre os altos índi-
ces de coliformes e a presença de Listeria spp.
Palavras-chave: L. monocytogenes; leite; contaminação.
SUMMARY
LISTERIA SPP., TOTAL COLIFORM, FECAL COLIFORM AND
E.COLI ON RAW AND PASTEURIZED MILK ON A DAIRY
INDUSTRY, (PARAÍBA, BRAZIL). The microbiological quality
of raw and pasteurized milk was studied along its line production
in a dairy factory in Paraíba State, Brazil. Listeria monocytogenes
was frequent found in raw milk and the levels of total coliforms
(TC), fecal coliforms (FC) and Escherichia coli, were high in the
same samples. The results of 75 milk studied samples (45 raw
milk, 15 recently pasteurized and 15 sacked), were distributed
in two clusters, according its collected period (before and after
changes in factory’s hygienic process). Both raw samples groups
showed high contamination. In the first period (March-April/1998),
all the pasteurized milk were out of total and fecal coliforms standards.
During the second period (May-August/1998), there was a significant
reduction of coliforms levels, however the progress in hygienic
conditions were not enough for eliminate the contamination: 11.1%
of recent pasteurized milk samples and 22.2% of sacked milk
samples were out of TC and also 33.3% and 44.4% recent
pasteurized and sacked milk samples. Sacked milk presented
more TC and FC than recent pasteurized milk, suggesting
contamination after pasteurization or failure at storage. Listeria
spp. was found in 33 raw milk samples (73.3%) and in 9 (30%)
of pasteurized milk samples. L. monocytogenes was isolated in
17 (51.5%) raw milk samples and in 9 (100%) pasteurized milk
samples (4 recent-pasteurized and 5 sacked). The Listeria spp.
diversity was: L. monocytogenes (66.6%), L. innocua (25.3%),
L. ivanovii (3.9%) L. welshimeri (2.5%) and L. grayi (1.5%). In
the pasteurized milk was isolated only: L. monocytogenes and
L. innocua. The results suggest a direct relation between high
levels of coliforms and presence of Listeria spp.
Keywords: L. monocytogenes; milk; contamination.
1 – INTRODUÇÃO
Durante o processo de produção, elaboração, trans-
porte, armazenamento e distribuição, qualquer alimen-
to está sujeito à contaminação por substâncias tóxicas
ou por bactérias patogênicas, vírus e parasitos. O leite,
devido à sua riqueza nutritiva, constitui um excelente
meio de cultura para o desenvolvimento de diversos
microrganismos, sendo veículo de transmissão de im-
portantes zoonoses para o homem [12].
No Brasil, de modo geral, o leite é obtido sob con-
dições higiênico-sanitárias deficientes, e em conseqüên-
cia, apresenta elevados números de microrganismos,
o que constitui um risco à saúde da população, princi-
palmente quando consumido sem tratamento térmico
[4]. Em relação ao leite e seus derivados, os cuidados
higiênicos para evitar a contaminação devem ser ini-
ciados desde a ordenha e continuados até a obtenção
do produto final. Diversos microrganismos patogênicos
podem ser encontrados contaminando o leite, dentre
eles podem-se destacar Escherichia coli e L.
monocytogenes [33].
LISTERIA SPP., COLIFORMES TOTAIS E FECAIS E E.COLI
NO LEITE CRU E PASTEURIZADO DE UMA INDÚSTRIA
DE LATICÍNIOS, NO ESTADO DA PARAÍBA (BRASIL)
1
Raïssa Mayer Ramalho CATÃO
2,
*, Beatriz Susana Ovruski de CEBALLOS
3

282 Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas, 21(3): 281-287, set-dez. 2001
Na microbiologia de alimentos vem sendo estuda-
da, nos últimos anos, a presença de Listeria spp. com
predominância da espécie L. monocytogenes, assim
como a diversidade de espécies do gênero. Contribuem
para este estudo, um maior conhecimento destes
patógenos nos seus aspectos epidemiológicos, clínicos
e laboratoriais através do desenvolvimento de meios
de cultura mais seletivos que favoreceram seu isola-
mento e identificação [11, 16]. De fato, sua detecção
ficou bastante facilitada em alimentos com a limitação
do desenvolvimento da microbiota acompanhante [7,
17], possibilitando a utilização de procedimentos que
agilizaram o diagnóstico e facilitaram seu rastreamento
ambiental.
Listeria spp. é um cocobacilo Gram-positivo, não-
esporulado, não-produtor de ácidos, aeróbio e anaeróbio
facultativo, de ampla distribuição ambiental, com cará-
ter ubiquitário, tendo sido isolado de águas superficiais,
de esgotos domésticos, águas residuárias de indústrias
de laticínios e de abatedouros, de solos, de insetos, de
adubo orgânico e em fezes de animais e inclusive de
humanos [19, 23, 26]. Pode também ser isolada em
diversos produtos alimentícios sejam crus ou após tra-
tamentos térmicos ou químicos [10, 12, 31, 35].
L. monocytogenes é patogênica para o homem e
diversos animais, e sua ampla distribuição ambiental,
igual às outras espécies, é favorecida pela sua capaci-
dade de se desenvolver entre 0°C e 44°C e, embora
sua faixa ótima seja entre 30°C e 37°C, pode sobrevi-
ver em alimentos congelados. Tolera pH extremos de 5
e 9, baixa atividade da água e concentrações de NaCl
de 10% e até superiores. Este conjunto de característi-
cas faz com que Listeria spp. e L. monocytogenes, em
especial, sejam um patógeno emergente de grande in-
teresse na área de alimentos e explica o destaque que
estes microrganismos vêm ocupando nos últimos anos
no controle de qualidade na indústria de alimentos, vis-
to as dificuldades de sua eliminação, assim como, a
possibilidade de causar uma doença grave no consu-
midor [20, 27, 30, 31, 37].
A literatura é abundante em relatos da presença de
Listeria spp. em alimentos, seja nas matérias-primas,
durante a produção e/ou durante o processamento ou
nos produtos já acabados em exposição nas pratelei-
ras [10, 31].
No Brasil, existem vários registros da presença de
L. monocytogenes em leite e derivados [6, 13, 24, 38,
42]. Dentre eles, SILVA, HOFER, TIBANA [39], pesqui-
sando a contaminação em queijos produzidos no Rio
de Janeiro, encontraram 19,6% das amostras positivas
para L. monocytogenes e, ainda, as mesmas amostras
foram também positivas para L. innocua e L. grayi. A
grande freqüência de casos de listeriose, veiculada por
queijos, evidencia a importância desse alimento e de
outros derivados do leite na cadeia epidemiológica de
transmissão de Listeria spp. [35].
Curiosamente, a Portaria nº 451 da Secretaria de
Vigilância Sanitária do Ministério da Saúde de 19 de
setembro de 1997, que estabelecia os padrões micro-
biológicos para produtos alimentícios expostos à ven-
da, não apresentava, na época que este trabalho foi
realizado, nenhuma referência para valores de L.
monocytogenes isoladas de leite [2]. Entretanto, nos
Estados Unidos, a USDA (1987) fixou uma tolerância
zero para esta bactéria em suprimentos alimentícios
de um modo geral [15, 18].
A falta de notificações de casos de listeriose no Brasil,
e, em particular, os associados a alimentos na região
Nordeste tornam interessante a pesquisa de Listeria spp.,
comparando-se sua presença com a qualidade sanitá-
ria do produto, usando-se como indicadores os coliformes
totais e os coliformes fecais.
O objetivo deste trabalho é investigar a qualidade
microbiológica e em particular a presença de Listeria
spp. no leite cru (in natura) e ao longo da linha de pro-
dução do leite pasteurizado de uma Usina de Laticínios
no Estado da Paraíba, visando detectar as condições
microbiológicas do produto pronto para consumo.
2 – MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 – Coleta das amostras de leite
Foram analisadas 75 amostras de leite, sendo 45
de leite cru (15 provenientes do município de Sousa-
PB, 15 do município de Campina Grande-PB, 15 do
município de Garanhuns-PE) e 30 de leite pasteuriza-
do tipo C (15 coletadas na saída do pasteurizador e 15
ensacadas e prontas para comercialização). As amos-
tras foram coletadas com freqüência quinzenal, no pe-
ríodo de março a agosto de 1998. Em cada amostragem
foram coletados ao todo 5 (cinco) litros de leite, sendo
1 (um) litro de cada tipo, utilizando-se recipientes esté-
reis para as amostras de leite cru e recém-pasteuriza-
do. As amostras de leite pasteurizado, já ensacadas,
foram coletadas aleatoriamente dentro da câmara re-
frigerada de estocagem da própria usina. O volume das
amostras utilizadas na amostragem foi coletado inde-
pendente do volume de produção da usina, pois este
variava de acordo com a quantidade de leite fornecido
diariamente pelos produtores. As amostras foram trans-
portadas ao laboratório sob refrigeração, em caixa
isotérmica, e analisadas em um período de aproxima-
damente uma hora após a coleta.
2.2. – Pesquisa de Listeria
Foi investigada segundo a metodologia descrita pela
Food and Drug Administration-FDA, citada por ROCOURT,
SCHRETTENBRUNNER, SEELIGER [34]. A técnica
usada foi a seguinte: homogeneização da amostra de
leite por agitação e inoculação de 25mL da mesma em
225mL de Caldo Enriquecido para Listeria (Caldo LEB
da BIOBRÁS), adicionado de A.N.C. (Acriflavina, Áci-
do Nalidixico, Cicloheximida), seguido de incubação a
30°C (±1°C)/24-48 horas. Posteriormente, após agita-
ção do Caldo LEB, transferiu-se 0,1mL deste para pla-
ca de Petri contendo Ágar Oxford (BIOBRÁS) adiciona-
do de C.C.C.A.F (Cloreto de Lítio; Acriflavina, Fosfomi-
cina, Colistina, Cicloheximida, Cefotetan) e o sistema

Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas, 21(3): 281-287, set.-dez. 2001 283
indicador (Esculina e Citrato Férrico Amoniacal). As
placas foram incubadas a 35°C/24-48 horas. Todas as
análises foram realizadas em duplicatas. As cepas sus-
peitas de Listeria spp., nas placas de ágar seletivo para
Listeria – Ágar Oxford, foram identificadas através de
testes: morfo-tintoriais (coloração de Gram), motilidade,
catalase, redução do nitrato a nitrito, produção de β-
hemolisina e fermentação de carboidratos (glicose,
ramnose, xilose e manitol). As cepas β-hemolisina po-
sitivas foram submetidas ao teste de CAMP com
Staphylococcus aureus. Todas as cepas identificadas
como L. monocytogrnes foram produtoras de β-hemolisina
e positivas para os testes de CAMP, catalase, motilidade
e fermentação da ramnose e glicose e apresentaram-
se negativas para os testes de redução do nitrato a nitrito
e fermentação da xilose e manitol. Trinta destas cepas
foram escolhidas aleatoriamente para serem testadas
pelo sistema API Listeria – Bio Mérieux, a fim de com-
parar os resultados das duas metodologias. Todas as
cepas analisadas apresentaram o mesmo resultado,
confirmando assim a equivalência dos dois métodos.
2.3 – Quantificação de coliformes totais (CT) pela téc-
nica de tubos múltiplos – Número mais provável
(NMP)
Seguiu-se a metodologia da APHA [1], usando-se
a técnica dos tubos múltiplos, com 3 tubos por dilui-
ção, para determinação do NMP de coliformes totais
por mL (CT/mL) de amostra, utilizando-se o meio Cal-
do Lactosado Verde Brilhante e Bile 2% (VBB) com in-
cubação a 35°C durante 24 – 48 horas.
2.4 – Quantificação de coliformes fecais (CF) através
da técnica de tubos múltiplos e identificação E. coli
Tubos de VBB positivos foram repicados para tu-
bos com caldo E.coli suplemetado com 4 metil umbeliferil
β-D glucoronídeo (EC-MUG), utilizado para determinar
de forma simultânea, a presença de CF e E. coli. Após
a incubação a 44,5°C durante 24 horas, registrou-se o
número dos tubos com crescimento positivo para a pre-
sença de CF (turbidez e gás) e determinou-se o NMP/mL.
Todos os tubos de EC-MUG com desenvolvimento em
24h de incubação foram observados sob luz ultravioleta
(λ=365nm) numa cabine escura, considerando-se po-
sitivos para E. coli os que apresentaram fluorescência
azul. Uma alça do material de cada um desses tubos,
foi semeada em Ágar Eosina Azul de Metileno (EMB)
para obtenção de colônias isoladas e após incubação a
37°C/24 horas; as colônias típicas foram submetidas a
testes de triagem (Triple Sugar Iron – TSI; motilidade -
SIM, Citrato de Simmons, Uréia, Vermelho de Metila –
VM e Voges Proskauer – VP).
3 – RESULTADOS E DISCUSSÃO
A Tabela 1 mostra que das 75 amostras de leite, 42
(56,0%) apresentaram Listeria spp., sendo mais freqüen-
tes no leite cru (33 amostras – 73,3%). É importante
ressaltar que todos os tipos de leite analisados revela-
ram a presença de Listeria spp. em percentuais eleva-
dos (66,6% a 86,6%), variando com a origem do pro-
duto. Salienta-se presença de Listeria spp. em 9 (30%)
amostras de leite pasteurizado. L. monocytogenes foi
isolada em 26 (61,9%) das amostras de leite analisa-
das. Observa-se que os resultados para o leite pasteu-
rizado e para o ensacado foram analisados em conjun-
to, ou seja, sem diferenciar a origem das amostras vis-
to que, na usina, são misturadas as amostras de leite
de todos os fornecedores, antes da pasteurização.
TABELA 1. Incidência de Listeria spp. e de L. monocytogenes em
amostras de leite cru e pasteurizado (Campina Grande-PB)
I, II e III = amostras de leite cru de diferentes produtores; IV= amostra de leite
recém-pasteurizado; V= amostra de leite ensacado.
Para uma melhor avaliação da distribuição tempo-
ral dos resultados, estes foram divididos em dois gru-
pos, de acordo com o período de coleta (março a abril/
1998 e maio a agosto/1998). Esta divisão foi caracteri-
zada pelas melhorias das condições de higienização
(sanitização) da usina de laticínios, executada entre fins
do mês de abril e início do mês de maio em prol da
ampliação de sua linha de produção, quando se troca-
ram os detergentes e sanitizantes utilizados por outros,
específicos para a higienização de plantas de produtos
láteos. Isto foi feito após dois meses de iniciada esta
pesquisa.
A Figura 1 apresenta o percentual de positividade
de Listeria spp. no total das amostras de leite cru, re-
cém-pasteurizado e ensacado em cada período. A fi-
gura mostra também o percentual de amostras positi-
vas, referente a todo o período estudado.
FIGURA 1. Percentual de positividade para Listeria spp. nas
amostras de leite in natura (cru), recém-pasteurizado e
ensacado, coletadas nos períodos de março a abril/1998 e
de maio a agosto/1998
Na Tabela 2 observa-se que o leite in natura apre-
sentou a maior diversidade de espécies do gênero: L.
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I (Sousa-PB) 15 10 (66,6%) 4 (40,0%)
II (Garanhuns-PE) 15 13 (86,6%) 8 (61,5%)
III (C.Grande-PB) 15 10 (66.6%) 5 (50,0%)
Sub – total 1 45 33 (73,3%) 17 (51,5%)
IV 15 4 (26,6%) 4 (100%)
V
15 5 (33,3%) 5 (100%)
Sub – total 2 30 9 (30,0%) 9 (100%)
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1º Período 2º Período Média do total de Am ostras
(março - abril) (maio - agosto) (março - agosto)
Leite Cru Recém-Pasteurizado Ensacado

284 Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas, 21(3): 281-287, set-dez. 2001
monocytogenes, L. innocua, L. ivanovii, L. welshimeri e
L. grayi. Esta última foi encontrada apenas nas amos-
tras do produtor I. Nas amostras de leite recém-pasteu-
rizado, foram encontradas L. monocytogenes e nas de
leite ensacado L. monocytogenes e L. innocua, sugerin-
do a possibilidade de contaminação pós-pasteurização.
TABELA 2. Diversidade das espécies de Listeria spp. em amostras
de leite cru e pasteurizado.
I, II e III = amostras de leite cru de diferentes produtores; IV= amostra de leite
recém-pasteurizado; V= amostra de leite ensacado.
Observaram-se diferentes percentuais de isolamento
para as várias espécies de Listeria, que foram identificadas
como: L. monocytogenes 88 (66,6%) das 126 cepas
isoladas, L. innocua 32 (25,3%), L.ivanovii 5 (3,9%), L.
welshimeri 3 (2,3%) e L. grayi 2 (1,5%), constatando-se
a predominância de L. monocytogenes.
A Figura 2 mostra o percentual de diversidade e de
isolamentos simultâneos das espécies de Listeria en-
contradas no leite cru e no pasteurizado. A maioria das
amostras de leite caracterizou-se por apresentar con-
taminação com duas espécies ao mesmo tempo e a
concomitância de ocorrência mais comum foi L.
monocytogenes e L. innocua, tanto nas amostras de
leite cru quanto nas de leite pasteurizado. De fato, esta
concomitância de isolamento ocorreu principalmente com
as duas espécies de maior freqüência nos diferentes
tipos de leite estudados e em porcentagens menores
com as outras, mais escassas. Observou-se que 47,6%
das amostras apresentaram uma única espécie sendo:
L. monocytogenes (38,1%) e L. innocua (9,5%), nas
demais amostras foram isoladas duas espécies.
As amostras de leite cru de todos os produtores
apresentaram elevada incidência de CT, CF e E. coli,
evidenciando alta contaminação da matéria-prima. To-
das as amostras de leite pasteurizado analisadas nos
meses de março a abril/1998 (1º período de estudo)
apresentaram-se fora dos padrões microbiológicos, que
determinam para o leite tipo C, valor máximo de CT de
10NMP/mL e de CF de 2NMP/mL. Os resultados suge-
rem contaminação pós-pasteurização no ensacamento
ou pasteurização deficiente.
FIGURA 2. Percentual de diversidade e concomitância entre as
espécies de Listeria spp. isoladas em amostras de leite cru
e pasteurizado.
Após melhorias na higienização, houve uma signi-
ficativa redução da contaminação. Os valores de CT e
CF passaram a ser aceitáveis a partir de maio/1998,
permanecendo assim durante quase todo o segundo
período de estudo, onde se constatou que 11,1% das
amostras recém-pasteurizadas estavam fora dos pa-
drões para CT e 33,3% para CF e dentre das amostras
ensacadas, 22,2% estavam fora dos padrões para CT
e 44,4% para CF (Tabela 3).
TABELA 3. Número e percentual de amostras de leite benefici-
ado, fora dos padrões, em relação ao período de coleta.
IV= amostra de leite recém-pasteurizado; V= amostra de leite ensacado
Considerando que o processo de pasteurização
continuou sem alterações, as melhorias na qualidade
microbiológica do leite podem ser atribuídas à higieni-
zação. Vale a pena ressaltar que o valor médio de CF
nas amostras ensacadas (CF de 11,32NMP/mL) foi pra-
ticamente igual ao valor médio das amostras recém-
pasteurizadas (10,68CF/mL), o que reforça a hipótese
de que havia deficiências higiênicas no ensacamento.
Também as flutuações observadas ao longo do perío-
do de amostragem para ambos indicadores foram bas-
tante semelhantes. Comparando-se os valores de E.
coli com os de CF em ambos os períodos, constatou-se
que as flutuações foram semelhantes. As Figuras 3, 4
e 5 ilustram esse comportamento.
FIGURA 3. Distribuição temporal do NMP/mL de coliformes to-
tais nas amostras de leite recém-pasteurizado e ensacado
FIGURA 4. Distribuição temporal do NMP/mL de coliformes fecais
nas amostras de leite recém-pasteurizado e ensacado.
A
A
m
m
o
o
s
s
t
t
r
r
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a
s
s
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N
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l
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h
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i
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m
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e
r
r
i
i
I
10 (30)
17 ( 56,6) 9 (30,.0) 1 ( 3,3) 2 (6,6) 1 (3,3)
II 13 (39)
24 ( 61,5) 13 (33,3) 1 ( 2,5) 0 (0,0) 1 (2,5)
III 10 (30)
19 ( 63,3) 7 (23,3) 3 (10,0) 0 (0,0) 1 (3,3)
IV 4 (12)
12 (100,0) 0 ( 0,0) 0 ( 0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)
V 5 (15)
12 ( 80,0) 3 (20,0) 0 ( 0,0) 0 (0,0) 0 (0,0)
T
T
o
o
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t
a
a
l
l
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6
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3
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,
3
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)
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5
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3
3
,
,
9
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)
)
2
2
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(
1
1
,
,
5
5
)
)
3
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(
(
2
2
,
,
3
3
)
)
C
A
B
D
E
F
G
Amostras fora dos Padrões (Nº e %)
IV VPeríodo de Coleta
Nº de
Amostras
CT CF CT CF
1º(março a abril/1998) 6 6 (100,0%) 6 (100,0%) 6 (100,0%) 6 (100,0%)
2º(maio a agosto/1998) 9 1 ( 11,1%) 3 ( 33,3%) 2 ( 22,2%) 4 ( 44,4%)
0
1
10
100
1000
10000
Datas
NMP CT/m
L
Recém-pasteurizado Ensacado
1º Período 2º Período
0
1
10
100
1000
10000
5/3
13/3
21/3
29/3
6/4
14/4
22/4
30/4
8/5
16/5
24/5
1/6
9/6
17/6
25/6
3/7
11/7
19/7
27/7
4/8
12/8
Datas
NMP CF/m
L
Recém-pasteurizado Ensacado
1º Período
2º Período
A =
L. monocytogenes
(38,1%)
B =
L. innocua
(9,5%)
C =
L. monocytogenes
+
L. innocua
(33,3%)
D =
L. monocytogenes
+
L. grayi
(4,8%)
E =
L. innocua
+
L. welshimeri
(4,8%)
F =
L. monocytogenes
+
L. ivanovii
(7,1%)
G =
L. welshimeri
+
L. ivanovii
(2,4%)

Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas, 21(3): 281-287, set.-dez. 2001 285
FIGURA 5. Distribuição temporal do NMP/mL de E. coli nas amostras
de leite recém-pasteurizado e ensacado.
Na Tabela 4 pode-se observar que um elevado nú-
mero de amostras de leite pasteurizado tipo C, e de
amostras ensacadas estão fora dos padrões de CT e
CF. Em relação ao leite recém-pasteurizado, 7 (46,6%)
e 9 (60,0%) das amostras estavam fora dos padrões,
respectivamente para CT e CF, enquanto no leite
ensacado somente 8 (53,3%) e 10 (66,6%) das amos-
tras estiveram fora dos padrões.
TABELA 4. Número e percentual de amostras de leite pasteuri-
zado tipo C, fora dos padrões para CT e CF, analisadas no
período de março a agosto/1998.
IV= amostra de leite recém-pasteurizado; V= amostra de leite ensacado.
Neste estudo foram realizados testes qualitativos
para o isolamento de Listeria spp., que permitiram de-
terminar sua presença em amostras de leite. Métodos
qualitativos são considerados adequados para atender
à legislação de alguns países, que preconizam tolerân-
cia zero de Listeria em alimentos prontos para consu-
mo [15]. A adoção do padrão contemplando a ausên-
cia de Listeria spp. em diversos países [36] visa asse-
gurar um produto isento de risco para o consumidor,
pois apesar de uma única célula de L. monocytogenes
provavelmente não ser suficiente para causar listeriose,
sua capacidade de multiplicação em condições de
estocagem, mesmo sob refrigeração, faz com que sua
presença no alimento coloque em risco a saúde dos
consumidores mais susceptíveis (gestantes, crianças,
imunodeprimidos) [22, 40]. A completa exclusão de L.
monocytogenes dos alimentos é irreal, porém em um
futuro próximo, critérios mais convenientes devem ser
estabelecidos e rigorosamente adotados [15].
Nas 75 amostras de leite (in natura e beneficiado)
analisadas neste trabalho, a freqüência de Listeria spp.
(56,0%) foi elevada e dentro deste percentual L.
monocytogenes ocorreu em 61,9%, o que é considera-
do uma porcentagem muito alta. Embora a maioria das
amostras positivas para Listeria spp. (33 amostras) fos-
sem de leite cru, uma quantidade importante (9 amos-
tras) foi de leite beneficiado, sendo 4 de amostras re-
cém-pasteurizadas e 5 de amostras ensacadas. Estes
resultados sugerem fortemente deficiências de condi-
ções higiênico-sanitárias na ordenha, no transporte ou
em ambos. O isolamento em amostras pasteurizadas
indica que a pasteurização não foi suficiente, ou que
houve recontaminação ou, ainda, que ocorreram am-
bos fenômenos.
MOURA, DESTRO, FRANCO [24], investigando a
incidência de Listeria spp. em 220 amostras de leite cru
em São Paulo, observaram 28 (12,7%) positivas, sendo
identificadas as espécies L. innocua, L. monocytogenes,
L. welshimeri e L. grayi. Em outro lote de 220 amostras
de leite pasteurizado, apenas duas (0,9%) foram posi-
tivas para Listeria e em ambas foi isolada a espécie L.
innocua. Analisando-se os resultados desses autores e
os deste estudo, os dados sugerem que é freqüente no
Brasil a incidência de Listeria spp. em leite cru, inde-
pendente da região geográfica. Este panorama não é
exclusivo do Brasil, visto que a ocorrência de Listeria
spp. em leite cru também foi registrada em outros paí-
ses, como Espanha, [8]; Canadá [5, 9]; Suíça [3]; Esta-
dos Unidos da América [21, 32], Irlanda e Japão [41].
Segundo OH, MARSHALL [28], pode haver conta-
minação cruzada de L. monocytogenes entre os alimentos
e os manipuladores, o qual pode ser, nesta pesquisa,
uma das causas da contaminação do leite após pas-
teurizado. Manipuladores com educação sanitária
deficiente poderiam ter recontaminado o produto visto
que eles circulam por todos os setores da usina, desde
a plataforma de recepção (do leite cru), até o ensaca-
mento. De fato, a situação ideal seria prevenir a entra-
da deste patógeno no ambiente da indústria de alimen-
tos, fazendo-se o controle do microrganismo nos pon-
tos de origem da matéria-prima, higienizando-se cui-
dadosamente as plataformas de recepção do leite,
sanitizando-se corretamente os equipamentos, cuidan-
do-se da saúde, da higiene e da educação sanitária dos
manipuladores e funcionários e em geral dentro da in-
dústria, assim como manter programas de controle de
pontos críticos. O conjunto de medidas devem ser orien-
tadas a erradicar ou pelo menos a diminuir as chances
de contaminação.
Uma outra possível via de contaminação do leite
pasteurizado se refere às falhas no controle da tempe-
ratura do pasteurizador, que embora suficientemente
altas para exercer um efeito letal sobre os coliformes,
não teriam atingido a Listeria spp., uma vez que estas
bactérias apresentam alta resistência térmica [10]. En-
tre os fatores relacionados diretamente com a pasteu-
rização (tempo/temperatura) estão: a possibilidade de
que a contaminação tenha como origem às próprias
embalagens ou falta de poder germicida das lâmpadas
ultravioleta (UV) utilizadas no setor de ensacamento (não
havia registros quanto ao seu tempo de uso na usina,
podendo estar com sua ação diminuída), ou ainda ina-
bilidade dos manipuladores.
OH, MARSHAL [28] ressaltam a importância do tra-
tamento da embalagem à base de ácido lático e ácido
monoláurico sobre a L. monocytogenes, destacando que
0
1
10
100
1000
10000
5/3
13/3
21/3
29/3
6/4
14/4
22/4
30/4
8/5
16/5
24/5
1/6
9/6
17/6
25/6
3/7
11/7
19/7
27/7
4/8
12/8
Datas
NMP
E.col
i/mL
Recém-pasteurizado Ensacado
1º Período 2º Período
Amostras Nº de Amostras Analisadas Amostras Fora dos Padrões (Nº e %)
CT CF
IV 15 7 (46,6%) 9 (60,0%)
V 15 8 (53,3%) 10 (66,6%)
T
T
o
o
t
t
a
a
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3
0
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1
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1
9
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6
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3
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%
%
)
)

286 Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas, 21(3): 281-287, set-dez. 2001
estes ácidos reduzem também a carga global de mi-
crorganismos. Seria interessante que esta medida fos-
se adotada pela indústria, através de um setor de con-
trole de qualidade destinado ao processamento. Tam-
bém deveriam ser adotadas medidas de controle sani-
tário do ambiente e do pessoal técnico.
Os valores de CT e CF foram bastante elevados,
evidenciando a contaminação na maioria das amostras.
Valores elevados de CT e CF também foram documen-
tados por outros autores que analisaram leite tipo C
tanto na região Nordeste como na região Sul do país.
Estudos efetuados, em João Pessoa-PB, registraram
98% das amostras pasteurizadas e ensacadas fora dos
padrões [25] e em Campinas-São Paulo, OLIVEIRA [29]
constatou que 77% das amostras analisadas estavam
contaminadas.
Entretanto, na legislação não há registros de valo-
res-limites para E. coli que permitam avaliar o grau de
contaminação do leite por este microrganismo. Deve-
se considerar que as tendências mais modernas sobre
o uso de bactérias indicadoras de contaminação fecal
sugerem E. coli como indicador mais específico, por-
que seria o único membro do grupo dos CF de origem
exclusivamente fecal [14].
4 – CONCLUSÕES
• Listeria spp. esteve presente em porcentagens ele-
vadas de amostras de leite cru de todos os forne-
cedores, as quais também apresentaram elevados
níveis de contaminação fecal.
• No leite cru houve grande diversidade de espécies
de Listeria, com predominância de L. monocytogenes,
seguida por L. innocua, e em menores porcenta-
gens, L. ivanovii e L. grayi.
• A redução dos níveis de contaminação avaliada pela
concentração de coliformes nas amostras de leite
pasteurizado mostrou que melhorias na higieniza-
ção/sanitização, introduzidas na linha de proces-
samento, não foram suficientes para eliminar a pre-
sença destes microrganismos, uma vez que foram
detectadas porcentagens significativas de amos-
tras fora dos padrões para CT e CF (11,1% das
amostras recém-pasteurizadas e 22,2% das
ensacadas).
• As amostras ensacadas apresentaram índices de
CT e CF mais elevados que as recém-pasteuriza-
das, sugerindo contaminação pós-pasteurização ou
falhas no armazenamento após pasteurização.
• A positividade para Listeria spp. nas amostras de
leite pasteurizado, de 66,6% no primeiro período
e 11,1% no segundo, demonstraram que a pas-
teurização não foi suficiente para eliminação da
Listeria ou que a contaminação ocorreu pós-pro-
cessamento. Entretanto, a diminuição das porcen-
tagens de amostras positivas, sugere que a
sanitização da usina melhorou a qualidade
bacteriológica do leite beneficiado, apesar de não
ter eliminado a contaminação.
5 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
[1] APHA. American Public Health Association. In: Compedium
of methods for the microbiological examination of
foods. Ed.:Vanderzant, C.; Splittstoesser, D. F. 3ed Wa-
shington, 1992.
[2] BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância Sanitá-
ria, Divisão Nacional de Vigilância Sanitária de Alimen-
tos. Portaria nº 451. Diário Oficial da União, Brasília, p.
8-15, 22 de set., 1997.
[3] BREER, C. & SCHOPFER, K. Listeria and food. Lancet., 29:
1022, 1988.
[4] CERQUEIRA, M. M. O. P. & LEITE, M. O. Doenças
Transmissíveis pelo Leite e Derivados. Cad. Esc. Téc.
Vet. UFMG, 13:39-62, 1995.
[5] DAVIDSON, R.J.; SPRUNG, D. W.; PARK, C. E. & RAYMAN,
M. K. Occurence of Listeria monocytogenes,
Campylobacter spp. and Yersinia enterocolitica in Manitoba
raw milk. Can. J. Food Technol., 22: 70-74, 1989.
[6] DESTRO, M. T.; SERRANO, A. M. & KABUKI, D. Y. Isolation
of Listeria species from some Brazilian meat and dairy
products. Food Control. 2: 110-112, 1991.
[7] DESTRO, M. T.; SERRANO, A. M.; KABUKI, D. Y. Comparison
of two plating media for the isolation of Listeria sp from
some brazilian dairy and meat products. Rev.Microbiol,
São Paulo, 23(4):256-259, 1992.
[8] DOMINGUEZ-RODRIGUEZ, L.; FERNANDEZ GARAYZABAL,
J. F.; VELASQUEZ BOLAND, J. A. Isolation de
microorganisms de Listeria a partir de lait cru destiné a le
consommation humaine. Can. J. Microbiol., 31:938, 1985.
[9] FARBER, J. M.; SANDERS, G. W.; JOHNSTON, M. A. A survey
of various foods for the presence of Listeria species. J.
Food Protect., 52 (7): 456-458, 1988.
[10] FRANCO, B. D. G. H. & LANDGRAF, M. Microbiologia de
Alimentos. Ed. Atheneu. São Paulo, 46-50. 182p, 1996.
[11] FRASER, J. A. & SPERBER, W. H. Rapid detection of Listeria
spp in food and enviromental samples by esculin hidrolydis.
J. Food Protect., 51 (10): 762-765, 1988.
[12] FRAZIER, W. C. Microbiologia de los alimentos. Acribia,
4ªed. Zaragoza, España, 681p., 1993.
[13] FURLANETTO, S. M.P.; SANTOS, M.A.A. & HARA, C. Listeria
spp. Avaliação da eficiência de quatro meios de plaqueamento
no seu isoalmento. Hig. Alim., 10 (46):30-34, 1996.
[14] GARBOGGINI, I. L. A. & GALLO, C. R. Pesquisa de Salmonella,
Campylobacter, Coliformes totais e Escherichia coli em
Águas de Nascentes (Bicas) em Piracicaba – SP. In: XVI
Cong. Bras. Cien. Tec. Alim., Rio de Janeiro-RJ. Anais
2: 982-985, 1998.
[15] GILBERT, R. J. Zero tolerance for Listeria monocytogenes in
foods – Is it necessary or realistic? In: XII International
Symposium on Problems of Listeriosis. pages 351-
356. Perth Western. Austrália, 1995.
[16] HAYES, P.; GRAVES, L. W.; SWAMINATHAN, B.; AJELLO,
W. G.; MALCOLM, G.B.; WEAVER, E.R.; RANSOM, R.;
DEAVER, K.; PLIKAYTIS, B.D.; SCHUCHAT, ª; WENGER,
J.D.; PINNER, R. W.; BROOME, C. V. The Listeria study
group. Comparisson of three seletive enrichmente methods
for the isolation of Listeria monocytogenes from naturally
contaminated foods. J. Food Protect., 5 (12): 952-959,
1992.
[17] JENSEN, A. Listeria monocytogenes isolation from human
faecal specimens: experiments with the seletive media,
Palcam and L-Palcamy. Lett. Appl. Microbiol., 16: 32-
35, 1993.

Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas, 21(3): 281-287, set.-dez. 2001 287
[18] JONHSON, J. L.; DOYLE, M. P. & CASSENS, R. G. Listeria
monocytogenes and other Listeria spp. in meat and meat
products. A review. J. Food Protect., 53: 81-91, 1990.
[19] KONEMAN, E. K; ALLEN, S. D.; JANDA, W. M.;
SCHRECKENBERGER, P. C.; Jr.WINN, W. C. Color Atlas
and Textbook of Diagnostic. Microbiology. 5ª ed.
Lippincott. NY, 1395p., 1997.
[20] LANDGRAF, M. Novos patógenos de interesse em alimen-
tos. Bol. SBCTA, 31 (1):5-7, 1997.
[21] LUND, A. M.; ZOTTOLA, E. A & PUSCH, D. J. Comparison
of methods for isolation of Listeria from raw milk. J. Food
Protect., 54: 602-606, 1991.
[22] MADDEN, J. M. Concerns Regarding the Occurrence of Listeria
monocytogenes, Campylobacter jejuni, and Escherichia
coli 0157:H7 in Foods Regulated by the U.S. Food and
Drug Administration. Dairy, Food and Environmental
Sanatization, 14 (5):262-267, 1994.
[23] MIMS, C. A.; PLAYFAIR, J. H. L.; ROITT, I. M.; WILLIAMS,
R. Microbiologia Médica. 1ª ed. Manole. São Paulo, 1995.
[24] MOURA, S. M.; DESTRO, M.T. & FRANCO, B. D. G. M.
Incidence of Listeria species in raw and pasteurized milk
produced in São Paulo, Brazil. Int.J. Food Microbiol. 19:
229-237, 1993.
[25] NASCIMENTO, D. Contribuição ao conhecimento das condi-
ções bacteriológicas de amostras de leite tipo C, antes e
após pasteurização, vendido na cidade de João Pessoa-
PB, 1977/78. 1982, 88p. Tese de Doutorado. Faculdade
de Ciências Farmacêuticas de São Paulo.
[26] NOJIMOTO, I. T. I.; SOUZA, S. R.; VALADÃO, L. M. Ocor-
rência de Listeria spp em crianças da cidade de Goiânia-
Goiás. RBAC, 29 (2):73-74, 1997.
[27] NOJIMOTO, I. T. I.; CENTENO, A. J.; YANAGUITA, R. M.;
WATANABE, K.; KAMUMOTO, M. & MACHADO, M. R.
Susceptibilidade aos antimicrobianos de Listeria spp. iso-
ladas de pacientes com aborto repetitivo. Rev. Bras. Anál.
Clín., 26 (3): 71-74, 1994.
[28] OH, D. H. & MARSHALL, D. L. Infuencie of packaging method,
lactic and monolaurin on Listeria monocytogenes in crawfish
tail meat homogenate. Food Microbiology, 12:159-163,
1995.
[29] OLIVEIRA, J. S. Qualidade microbiológica do leite. Rev. Inst.
Laticínios Cândido Tostes, 31 (186): 15-20, 1976.
[30] PAPAGEORGIOU, D. K. & MARTIN, E. H. Fate of Listeria
monocytogenes during the manufacture, ripening and
storage of feta cheese. J. Food Protect., 52 (2): 82-87,
1989.
[31] PEREIRA, M.L. & ROCOURT, J. Listeria monocytogenes –
Uma revisão sobre aspectos taxonômicos, importância
médica e em alimentos. Rev. Higien. Alim., 7 (26):5-12,
1993.
[32] REA, M. C.; COGAN, T. M. & TOBIN, S. Incidence of pathogenic
bacteria in raw milk in Ireland. J. Appl. Bact., 73:331-
336, 1992.
[33] RIEDEL, G. Controle Sanitário dos Alimentos. 2ª ed. São
Paulo: Atheneu, 320p., 1992.
[34] ROCOURT, J.; SCHRETTENBRUNNER, A. & SEELIGER,
H. P.R..Differénciation biochimique des grupes génomiques
de Listeria monocytogenes (sensu lato). Ann. Microbiol.
(Institut Pasteur, Paris) 134 A: 65-71, 1983.
[35] RYSER, E. T. & MARTH, E. H. Listeria, listeriosis and food
safety. New York: Marcel Dekker. 632p., 1991
[36] SCHLECH, W. F. Overview of listeriosis. Food Control, 7 (4/
5): 183-185, 1996.
[37] SEELIGER, H. P. R. & JONES, D. Genus Listeria pirie 1940.
In: Bergey, s Manual of Systematic Bacteriology. P.
H. A. Sneath; N. S. Mair; M. E. Sharpe & J. G. Holt (eds).
Williams & Wilkins Co., Baltimore, 1235-1245, 1989.
[38] SILVA, M. C. D. Listeria monocytogenes em queijos: ocor-
rência, avaliação de métodos e caracterização de cepas
isoladas de queijos. 1997, 117p. (Tese de Doutoramento)
– Instituto de Microbiologia – Universidade Federal do Rio
de Janeiro (UFRJ).
[39] SILVA, M. C. D.; HOFER, E. & TIBANA, A. Incidence of Listeria
monocytogenes in cheese produced in Rio de Janeiro,
Brazil. J. Food Protect., 61 (3): 354-356, 1998.
[40] SILVA, M. C. D.; VILARDI, T.C.C. & TIBANA, A. Avaliação
de métodos para a detecção de Listeria em queijos. Ciênc.
Tecnol. Aliment., 18 (2): 150-155, 1998.
[41] YOSHIDA, T.; SATO, M.; HIRAI, K. Prevalence of Listeria
species in raw milk from farm bulk tanks in Nagano
prefecture. J. Vet. Med. Sci., 60 (3): 311-314, 1998.
[42] VAN DENDER, A. G. F. Listeria monocytogenes: um proble-
ma em leite e produtos lácteos. Inf Agopec., 13 (155):
19-23, 1995.
6 – AGRADECIMENTOS
À CAPES, pela bolsa PICD/UEPB concedida e pelo
apoio financeiro; à Indústria de Laticínios de Campina
Grande-PB, por ter gentilmente permitido a realização
deste estudo nas suas instalações e, em particular, ao
Prof. Dr. Ernesto Hofer, da Fundação Oswaldo Cruz,
pelas valiosas sugestões na revisão deste artigo.