Evaluation of effects to the therapeutical ultrasound on caffeine and the release in vertical diffusion systems

Abstract

Currently, the physiotherapists use the phonoforesis, which consists in the therapeutical ultrasound (US) used to increase the drug molecules migration through the skin, however, the US can shows oxidative effects, and is used, for example, in chemical reactions acceleration. The present study aimed to perform the electrochemical evaluation and the diffusion investigation of gel/caffeine 5% solutions submitted to therapeutical US (continuous mode, 1.0 W cm-2 and 1 MHz). It this study, it has been verified diffusion increase and a possible oxidation of the caffeine molecules, when subjected to therapeutical US.

Full text

Quim. Nova, Vol. 34, No. 9, 1539-1543, 2011
Artigo
*e-mail: stulp@univates.br
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DO ULTRASSOM TERAPÊUTICO SOBRE A CAFEÍNA E VERIFICAÇÃO DA
LIBERAÇÃO EM SISTEMA DE DIFUSÃO VERTICAL
João Alberto Tassinary, Paula Bianchetti e Claudete Rempel
Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Centro Universitário UNIVATES, Av. Avelino Tallini, 171, 95900-000 Lajeado - RS, Brasil
Simone Stülp*
Centro de Ciências Exatas e Tecnológicas, Centro Universitário UNIVATES, Av. Avelino Tallini, 171, 95900-000 Lajeado - RS, Brasil
Recebido em 2/12/10; aceito em 30/4/11; publicado na web em 14/6/11
EVALUATION OF EFFECTS TO THE THERAPEUTICAL ULTRASOUND ON CAFFEINE AND THE RELEASE IN VERTICAL
DIFFUSION SYSTEMS. Currently, the physiotherapists use the phonoforesis, which consists in the therapeutical ultrasound (US)
used to increase the drug molecules migration through the skin, however, the US can shows oxidative effects, and is used, for example,
in chemical reactions acceleration. The present study aimed to perform the electrochemical evaluation and the diffusion investigation
of gel/caffeine 5% solutions submitted to therapeutical US (continuous mode, 1.0 W cm
-2
and 1 MHz). It this study, it has been verified
diffusion increase and a possible oxidation of the caffeine molecules, when subjected to therapeutical US.
Keywords: phonoforesis; therapeutical ultrasound; caffeine.
INTRODUÇÃO
A utilização de ultrassom (US) em diferentes aplicações na área
das ciências experimentais tem ganhado destaque, devido ao fato
do US poder ser usado como fonte de energia para a ocorrência de
reações químicas.
1,2
O US apresenta diferentes formas de uso, nas
mais variadas frequências, sendo que na área da fisioterapia seu uso
ocorre nas frequências de 1 e 3 MHz.
3
Ainda, no âmbito da fisioterapia, a utilização do US terapêutico
pode ocorrer com e sem a conjugação de fármacos, sendo que quando
há esta associação, a técnica é denominada fonoforese.
4
Diversos
estudos têm sido realizados avaliando a ação e os efeitos produzidos
pela ação do US sobre estes fármacos,
5
envolvendo, por exemplo, o
aumento de permeação destes na pele.
6,7
Além destas técnicas, ainda
na área de atuação da fisioterapia, tem-se outra importante técnica,
que igualmente facilita a permeação de fármacos em contato com a
pele, a iontoforese,
8
também amplamente estudada.
Na literatura, há estudos relacionados à aplicação de US in vivo,
dentre os quais se destaca o de Hsieh
9
que, a partir de pesquisas expe-
rimentais com a utilização de diclofenaco em ratos, apresentou uma
diminuição dos sintomas da artrite nestes animais quando da aplicação
da fonoforese, ou seja, US terapêutico associado ao diclofenaco.
Em outros estudos,
10
foram determinadas as condutividades
de 37 meios condutores que são comercialmente utilizados na fo-
noforese, com a finalidade de facilitar e orientar a escolha desses
durante a prática clínica dos fisioterapeutas. O estudo mostrou que,
de maneira geral, os produtos na forma de gel apresentaram valores
de condutividade elevados. Ainda, os fármacos de aplicação tópica
com denominações de gel ou emulgel registraram também valores
altos, contrastando, assim, com cremes, loções e pomadas, que
apresentaram condutividades baixas, não sendo aconselhável a sua
utilização conjuntamente com o US.
Dentre as substâncias que vêm sendo agregadas à onda sônica,
a cafeína (Figura 1) possui destaque, sendo caracterizada,
11
como
um pó ou cristais brancos, pouco solúvel em água e podendo ser
extraída da Coffea arabica. A cafeína está entre as três metilxantinas
de ocorrência natural farmacologicamente ativas e também pode ser
encontrada em chás.
12
É na natureza que o homem busca, desde primórdios de sua
existência, recursos que melhorem sua condição de vida para, as-
sim, aumentar suas chances de sobrevivência pela melhoria de sua
saúde.
13
As plantas medicinais são amplamente pesquisadas, tanto
farmacologicamente quanto para o desenvolvimento de novas drogas
e produtos tópicos, não somente quando os seus constituintes são
usados diretamente como agentes terapêuticos, mas também como
matérias-primas para a síntese, ou modelos para compostos farma-
cologicamente ativos.
14
Assim as plantas medicinais, as preparações fitofarmacêuticas
e os produtos naturais isolados, como a cafeína, são pesquisados e
utilizados em todo o mundo e, desta forma, representam um mercado
que movimenta bilhões de dólares, tanto em países industrializados
como em desenvolvimento.
15
A cafeína, como princípio ativo dermatológico, exerce ação no
tecido adiposo subcutâneo, através da inibição da fosfodiesterase,
tendo um efeito lipolítico. Entretanto, para que a molécula transpo-
nha a principal barreira à penetração cutânea deve ser associada a
promotores de absorção cutânea ou veiculada através de lipossomas.
16
Segundo alguns autores
,17
a cafeína também ocasiona uma redução
da espessura da hipoderme devido ao achatamento nos lóbulos de
tecido adiposo.
Pesquisas in vitro, utilizando células de difusão vertical,
7
suge-
rem que o US acentua e acelera significativamente a permeação da
N
N
N
N
CH
3
O
CH
3
H
3
C
O
Figura 1. Estrutura química da cafeína

Tassinary et al.
1540
Quim. Nova
cafeína através da pele, permitindo a aplicação da fonoforese, não
ocasionando alterações na pele exposta ao US, sendo o estudo reali-
zado por meio de análises histológicas e de microscopia eletrônica.
É fundamental ressaltar que a promoção de permeação de fár-
macos pela pele através da onda sônica pode levar a maior eficácia
da liberação de ativos; aumento do fluxo ou retenção do mesmo,
aumento da liberação localizada; tópica ou dos tecidos alvo através
da pele; ou, ainda, a combinação das hipóteses citadas. No entanto,
esta liberação poderá promover efeitos tóxicos tanto intracelulares
como extracelulares, caso não haja utilização adequada da quantidade
do composto associado,
18
ou, ainda, devido à ocorrência de alteração
da estrutura química do composto.
5
Poderão ocorrer efeitos adversos
e não desejáveis ao tratamento, assim como a utilização adequada
poderá promover redução de possíveis agentes tóxicos ao organis-
mo. Determinações eletroquímicas podem auxiliar na avaliação de
possíveis degradações de princípios ativos, além de possibilitar a
determinação da toxicidade dos mesmos.
19,20
Diante do exposto, o objetivo do presente trabalho foi realizar
estudos da liberação da cafeína, quando adicionada a um gel trans-
missor, com e sem a aplicação do US terapêutico, além de avaliar,
por meio eletroquímico, possíveis reações de oxidação ocorridas após
a aplicação deste. A importância deste trabalho reside na avaliação
da promoção, por parte do US terapêutico, do aumento de liberação
(facilitador) do fármaco para o meio, em ensaios in vitro, investigando
possíveis alterações estruturais ocorridas neste sistema.
PARTE EXPERIMENTAL
Reagentes e preparo das amostras
Nos ensaios de incidência de onda sônica, as amostras utilizadas
para a análise foram obtidas a partir de gel condutor
21
da marca Mercur
(hidrogel) com fabricação em 13/09/08 e validade até 09/2011, lote
237 506-403, com adição de cafeína a 5%, produzido pelo labora-
tório Sigma-Aldrich, lote 029k 1023, com data de fabricação em
31/08/2009 e com validade até 14/09/2014. As amostras de cafeína
foram preparadas a partir de gel condutor e cafeína na concentração
de 5%. Esta concentração de cafeína foi utilizada por ser a comumente
encontrada em géis comerciais para aplicações fisioterapêuticas.
Para garantir a homogeneidade da amostra utilizou-se um agitador
mecânico da marca Fisatom modelo 703 D.
Aplicação do ultrassom terapêutico in vitro
Foi montado um sistema sobre uma mesa agitadora (Figura 2) da
marca Tecnal modelo TE – 140, que foi ajustada em 23 rpm,
22
com
a finalidade de simular a aplicação in vivo sem a formação de ondas
estacionárias, que ocorrem como resultado da sobreposição das ondas
refletidas com as ondas incidentes,
23
sendo necessária a movimentação
contínua do transdutor. Acoplada à mesa agitadora estava uma célula
receptora contendo água/álcool etílico 1:1 (solução receptora), em
contato com uma membrana e esta com o gel contendo o fármaco,
e o transdutor de US.
No acompanhamento deste experimento in vitro foram analisados
parâmetros eletroquímicos, a partir da técnica de voltametria cíclica,
onde se utilizou uma célula convencional de três eletrodos, com o
auxílio de um potenciostato modelo PGSTAT128N da marca Autolab/
Ecochemie, com velocidade de varredura de 20 mV s
-1
. A célula ele-
troquímica continha um eletrodo de trabalho de platina com área de
0,385 cm
2
, um contraeletrodo de platina e um eletrodo de referência
sendo constituído de um fio de prata revestido com cloreto de prata.
Todos os experimentos eletroquímicos foram realizados em triplicata
e apresentaram repetibilidade entre os diferentes experimentos, sen-
do que os dados apresentados são médias das triplicatas realizadas.
Os gráficos foram obtidos no software Origin
®
. A determinação do
percentual de cafeína oxidada foi feita por espectrofotometria UV/
Vis (Cary 100 Bio).
Análise de liberação da cafeína em sistema de difusão vertical
Os experimentos de liberação foram realizados em uma célula
de difusão vertical, contendo uma membrana de acetato de celulose
(Sartorius Stedim com porosidade de 0,45 mm), demonstrada na
Figura 3. Preparou-se o sistema, sobre uma chapa agitadora (Velp
Scientifica), contendo uma célula de camisa dupla de volume 200 mL
da marca Germany, contendo água aquecida a 37 ºC por um banho
ultratermostatizado (MA-184 Marconi), simulando a temperatura
corporal; dentro desta foi inserida a célula de difusão (100 mL) com
solução receptora de água e álcool etílico 99,5% (Nuclear) 1:1 e uma
barra agitadora magnética para manter a homogeneidade da amostra.
Em contato com a área exposta da membrana de acetato de celulose
foi adicionado o agente acoplador (hidrogel) e acima o transdutor do
US.
24
A aplicação do US terapêutico foi realizada com o auxílio de um
equipamento da marca DGM Eletrônica Ltda. e foi aplicado em cada
uma das amostras analisadas, na seguinte modulação: modo contínuo,
1 MHz, intensidade de 1,0 W cm
-2
e tempo de 10 min de aplicação,
obtido através do cálculo área de aplicação/era do transdutor. Após,
Figura 2. Sistema para aplicação do ultrassom terapêutico in vitro
Figura 3. Célula de difusão utilizada nos ensaios de liberação, no detalhe,
área exposta para aplicação do US sobre membrana de acetato de celulose

Avaliação dos efeitos do ultrassom terapêutico sobre a cafeína 1541
Vol. 34, No. 9
foram realizadas análises de varreduras espectrofotométricas (195 a
990 nm) de alíquotas retiradas da célula de difusão, para a verificação
da presença do substrato na solução receptora. Os ensaios foram ob-
tidos através de um espectrofotômetro Cary 100 Bio UV/Vis. Todas
as análises foram realizadas em triplicata.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Análise de voltametria cíclica
A partir do sistema que simulou a aplicação in vivo, montado
sobre a mesa agitadora, foram realizados os ensaios de caracteriza-
ção eletroquímica, por meio da utilização da técnica de voltametria
cíclica. Estes experimentos foram realizados em amostras de hidrogel
e hidrogel + cafeína 5%, antes e após a aplicação de US terapêutico,
por 10 min, com velocidade de varredura de 20 mV s
-1
, sendo que os
potenciais são referenciados em relação ao eletrodo de Ag/AgCl. Na
Figura 4, tem-se um voltamograma cíclico do hidrogel antes e após
a aplicação de US por 10 min.
Avaliando a Figura 4, verifica-se que houve alteração eletroquí-
mica no sistema, após exposição por 10 min ao US terapêutico, pela
visualização da alteração da área do voltamograma. Confirmando a
análise, o cálculo da carga evidencia um acréscimo de Q = 5,291 x
10
-2
C cm
-2
para Q = 9,991 x 10
-2
C cm
-2
, do hidrogel bruto para o
tratado, respectivamente.
Além da alteração nos valores de carga, há a presença de um
potencial de pico (E
p
) em valores próximos a 0,9 V, sendo que
sistemas contendo compostos orgânicos normalmente apresentam
picos de oxidação nesta região
25-27
e o hidrogel estudado contém
em sua formulação carbopol (polímero vinílico) e propilenoglicol,
compostos orgânicos amplamente utilizados em formulações der-
matológicas.
21,28,29
Na Figura 5, tem-se o voltamograma cíclico característico do
sistema hidrogel + cafeína 5%, com velocidade de varredura de
20 mV s
-1
, com e sem a aplicação do US terapêutico.
Avaliando a Figura 5, verifica-se que houve alteração eletroquí-
mica do sistema hidrogel/cafeína, após exposição por 10 min ao US
terapêutico, em função da área do voltamograma, sendo acrescida
após a aplicação da onda sônica. Em termos de valores de carga, há
um acréscimo de Q = 8,080 x 10
-2
C cm
-2
para Q = 1,005 x 10
-1
C
cm
-2
, do sistema hidrogel/cafeína bruta para a tratada, respectiva-
mente, sendo este de uma ordem de grandeza. Os resultados obtidos
(voltamogramas) neste estudo são semelhantes aos obtidos em outro
estudo de determinação eletroquímica de cafeína,
30
porém neste caso
com eletrodos de pasta de carbono e a cafeína em solução aquosa.
Esse aumento nos valores de carga, após exposição ao US tera-
pêutico pode evidenciar uma maior susceptibilidade à oxidação do
sistema após a aplicação do US terapêutico.
5
Além deste efeito, avaliando-se a Figura 5, verifica-se que em
potenciais próximos a 1,1 V, tem-se um pico anódico, com corrente
de pico (I
p
) da ordem de 610 µA, sendo que esta onda é no potencial
eletroquímico característico da cafeína.
30,31
Em trabalhos publicados
envolvendo a determinação voltamétrica da cafeína, os autores
encontraram também picos de oxidação nesta região de potenciais
e verificaram que, dependendo do eletrodo de trabalho utilizado, há
pequenos deslocamentos nos potenciais medidos.
31-34
Além do efeito
do eletrodo de trabalho, outro aspecto importante é o valor de pH
das amostras analisadas, sendo que este pode também influenciar nos
deslocamentos dos potenciais de pico (E
p
); avaliando-se a Figura 5,
verifica-se um pequeno deslocamento quando comparadas as amostras
com e sem submissão à onda sônica, sendo que o pH do sistema após
incidência de radiação também tende a uma acidificação.
Ainda segundo alguns trabalhos envolvendo o estudo de soluções
contendo cafeína,
30,32
o mecanismo proposto de eletro-oxidação
(Figura 6) envolve 4 elétrons e 4 prótons e ocorre em duas etapas. A
primeira etapa envolve a perda de 2 elétrons e 2 prótons, ocorrendo a
oxidação da molécula no carbono 8 e nitrogênio 9, obtendo-se assim
um ácido úrico substituído (composto intermediário). Este composto
intermediário é oxidado em uma segunda etapa que envolve a perda
de mais 2 elétrons, formando então um análogo ao ácido úrico, di-
hidroxilado nas posições 4 e 5. Esta molécula, segundo a literatura,
32
é rapidamente fragmentada. Desta forma, após sua fragmentação,
provavelmente há a formação de ureia substituída.
Aplicando critérios de diagnóstico para o sistema estudado como,
por exemplo, a determinação do número de elétrons envolvidos a
partir do valor de carga Q sob o pico voltamétrico e da corrente de
pico (I
p
),
35,36
tem-se que o número de elétrons a partir dos voltamo-
gramas cíclicos analisados é próximo a 4, para a reação de oxidação
da cafeína, no potencial de pico de 1,1 V, confirmando os resultados
obtidos na literatura.
Além disso, verifica-se que o tratamento com US terapêutico
Figura 4. Voltamograma cíclico do hidrogel antes e após a aplicação de
ultrassom (10 min), v = 20 mV s
-1
Figura 5. Voltamograma cíclico do sistema hidrogel/cafeína antes e após a
aplicação de ultrassom (10 min), v = 20 mV s
-1
N
N
N
N
CH
3
O
CH
3
H
3
C
O
N
N
H
N
N
CH
3
O
CH
3
H
3
C
O
O
N
N
H
N
N
CH
3
O
CH
3
H
3
C
O
O
OH
OH
-2e
-
, -2H
+
2H
2
-2e
-
, -2H
+
O
Figura 6. Mecanismo de eletro-oxidação da cafeína

Tassinary et al.
1542
Quim. Nova
promove um deslocamento da reação de desprendimento de oxigênio
(RDO) para valores de potenciais mais negativos, no sistema hidrogel
e hidrogel + cafeína após a aplicação do US terapêutico, indicando
que a oxidação do sistema é facilitada após a aplicação do US, pe-
las características da onda sônica.
1
Cabe destacar que o ultrassom
promove efeitos térmicos e não térmicos quando da sua aplicação.
Dentre estes efeitos, destaca-se a corrente acústica, ou cavitação,
37
que
promove mudanças no arranjo da camada córnea da epiderme quando
da aplicação terapêutica in vivo do US. Este é o principal mecanismo
para o fonoforese,
4
pela indução de desordem na bicamada lipídica da
camada córnea, aumentando o transporte através da membrana, e este
efeito sobre os tecidos alvo se deve ao efeito tixotrópico, facilitando
assim a absorção de fármacos. A cavitação tem por consequência a
formação de cavidades
1
com dimensões de micrômetros em fluidos
contendo gases. Tal fenômeno pode, inclusive, ocasionar a alteração
de interações intermoleculares, bem como ligações duplas também
podem ser afetadas pela agitação do sistema.
38
Após a realização dos experimentos voltamétricos, foram re-
alizadas medidas espectrofotométricas, da solução antes e após o
tratamento com ultrassom terapêutico, e determinada a concentra-
ção de cafeína na amostra, em comprimento de onda de 272 nm.
31
Desta forma, verificou-se que em torno de 11% da cafeína contida
na amostra foi oxidada.
Análises espectrofotométricas
O gráfico apresentado na Figura 7 foi obtido a partir da análise
da absorbância das diferentes amostras de hidrogel e hidrogel +
cafeína 5%, com e sem a aplicação do US, nos ensaios de liberação
com membrana de acetato de celulose, através de varredura em toda a
faixa espectral (195-990 nm), sendo considerados os valores próximos
a 280 nm como a região de absorbância máxima.
Segundo a literatura,
39
alguns componentes do café verde (cru),
tais como proteínas, peptídeos, aminoácidos aromáticos livres, trigo-
nelina e cafeína, apresentam absorção em 280 nm. Porém, a análise
da cafeína no comprimento de onda específico de 272 nm aumenta a
seletividade do método e, portanto, sua precisão e exatidão.
26
Na Figura 7 tem-se espectro UV/Vis das amostras de hidrogel e
hidrogel + cafeína 5%, com e sem exposição ao US terapêutico no
modo contínuo.
A Figura 7 permite a visualização da diferença de absorbância
entre as amostras, sendo que o hidrogel e o hidrogel após aplicação
de US não apresentaram incremento da banda (l = 272 nm), já o
sistema hidrogel + cafeína mostrou uma discreta absorbância por
volta da faixa de 0,2 (de absorbância) e quando este foi associado
ao tratamento com US terapêutico revelou um maior incremento da
banda na região de absorbância característico da cafeína por volta
dos 272 nm, sugerindo então uma liberação mais acentuada do ativo
para o meio, provavelmente por conta da ação física da onda sônica,
com valores de absorbância por volta de 0,4. Em termos de concen-
tração, a partir de curva de calibração realizada com soluções de
cafeína em solução água/álcool 1:1, tem-se que, antes da aplicação de
US, a concentração de cafeína na solução receptora é de 5,25 x 10
-5
mol L
-1
, enquanto que após a aplicação de US terapêutico, ocorre a
liberação de 1,73 x 10
-4
mol L
-1
de cafeína, sendo o aumento de uma
ordem de grandeza, estando estes valores abaixo dos níveis tóxicos,
em termos plasmáticos, que são da ordem de concentrações milimo-
lares.
40,41
Ou seja, o gráfico evidenciou incrementos de absorbância
nas bandas características da cafeína, sugerindo uma maior liberação
do ativo quando associado à onda sônica terapêutica, portanto, o US
se apresentou como facilitador no processo de liberação da cafeína.
Diante dos resultados obtidos, percebe-se que há a ocorrência de
um aumento de liberação de cafeína para o sistema receptor, devido
à aplicação do US terapêutico, sendo este um aspecto positivo para
aplicações fisioterapêuticas, porém, há o indicativo de oxidação, ou
seja, alteração da estrutura da molécula de cafeína, sendo este um
aspecto negativo, já que a aplicação da cafeína, em termos terapêuti-
cos, ocorre devido às características que a molécula possui em função
de sua estrutura química. Estudos posteriores são necessários para
verificar se a atividade da cafeína é mantida após a ação da onda
sônica como, por exemplo, a atividade anti-inflamatória.
CONCLUSÃO
Os resultados obtidos elucidaram a possibilidade de detecção
da degradação da cafeína através da técnica de voltametria cíclica.
Sugere-se então que a ação física do US, no modo contínuo, tem a
capacidade de oxidar os sistemas analisados. As amostras de hidro-
gel e hidrogel + cafeína apresentaram um deslocamento da reação
de desprendimento de oxigênio (RDO), apresentando também pico
característico de sistemas que contêm cafeína, em potenciais em
torno de 1,1 V.
Considerando que a onda sônica terapêutica associada a agentes
com princípios ativos é uma técnica diariamente elencada na prática
clínica fisioterapêutica e sabendo-se que houve uma degradação dos
sistemas estudados, após a aplicação da técnica de fonoforese por
10 min no modo contínuo, torna-se fundamental o desenvolvimento
de um conhecimento aprofundado de seus efeitos ao interagir com
tecidos, ou seja, a ação anti-inflamatória e lipolítica dos ativos estu-
dados, cientificamente comprovadas, podem ser discutidas, uma vez
que a onda sônica pode ocasionar a alteração da estrutura química
dos ativos.
Outro fator relevante na prática clínica é a permeação dos ativos
nos tecidos superficiais; como fase inicial para tal análise identificou-
se a capacidade de liberação das substâncias. Os resultados sugerem
uma maior liberação da cafeína quando associada à onda sônica
terapêutica, ou seja, o US se apresentou como facilitador no processo
de liberação da cafeína para o meio.
REFERÊNCIAS
1. Garbellini, G. S.; Salazar-Banda, G. R.; Avaca, L. A.; Quim. Nova 2008,
31, 123.
2. Martines, M. U.; Davolos, M. R.; Jafelicci Júnior, M.; Quim. Nova 2000,
23, 251.
3. Matheus, J. P. C.; Oliveira, F. B.; Gomide, L. B.; Milani, J. G. P. O.;
Volpon, J. B.; Shimano, A. C.; Rev. Bras. Fisioter. 2008, 12, 241.
Figura 7. Espectro UV/Vis das amostras de hidrogel e hidrogel + cafeína 5%,
com e sem exposição ao US terapêutico no modo contínuo

Avaliação dos efeitos do ultrassom terapêutico sobre a cafeína 1543
Vol. 34, No. 9
4. Mitragotri, S.; Kost, J.; Adv. Drug Delivery Rev. 2004, 56, 589.
5. Bianchetti, P.; Tassinary, J. A. F.; Cerutti, D. G. U.; Barnes, D.; Ethur,
E. M.; Stülp, S.; Revista Liberato 2009, 10, 139.
6. Mutoh, M.; Ueda, H.; Nakamura, Y.; Hirayama, K.; Atobec, M.; Ko-
bayashia, D.; Morimoto, Y.; J. Controlled Release 2003, 92, 137.
7. Boucaud, A.; Machet, L.; Arbeille, B.; Machet, M. C.; Sournac, M.;
Mavon, A.; Patat, F.; Vaillant, L.; Int. J. Pharm. 2001, 228, 69.
8. Gratieri, T.; Gelfuso, G. M.; Lopez, R. F. V.; Quim. Nova 2008, 31, 1490.
9. Hsieh, Y. L.; Phys Ther. 2006, 86, 39.
10. Ferreira, L.; Stattmiler, C.; Belo, F.; Pinheiro, H.; Pedrosa, L.; Gaspar,
P.; Coutinho, I.; Dias, N.; Arquivos de Fisioterapia 2006, 1, 14.
11. Korolkovas, A.; Química farmacêutica, Guanabara Koogan: Rio de
Janeiro, 1988.
12. Rang, H. P.; Farmacologia, 4
a
ed., Guanabara Koogan: Rio de Janeiro,
2001.
13. http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/fitoterapia_no_sus.pdf,
acessada em Abril 2011.
14. Who; Guidelines on Good Agricultural and Collection Practices
(GACP) for Medicinal Plants, 1
st
ed., World Health Organization:
Geneve, 2003.
15. Calixto, J. B. Em Plantas medicinais sob a ótica da Química Medicinal
Moderna; Yunes, R. A.; Calixto, J. B., eds.; Argos: Chapecó, 2001, cap.
7.
16. Frézard, F.; Schettini, D. A.; Rocha, O. G. F.; Demicheli, C.; Quim. Nova
2005, 28, 511.
17. Chorilli, M.; Carvalho, L. S.; Pires-de-Campos, M. S. M.; Leonardi,
G. R.; Ribeiro, M. C. A. P.; Polacow, M. L. O.; Acta Farm. Bonaerense
2005, 24, 14.
18. Rogero, S. O.; Lugão, A. B.; Ikeda, T. I.; Cruz, A. S.; Mat. Res. 2003, 6,
317.
19. Oliveira-Brett, A. M.; Goulart, M. O. F.; Abreu, F. C.;
Bioelectrochemistry 2002, 56, 53.
20. Ferreira, S. B.; Gonzaga, D. T. G.; Santos, W. C.; Araújo, K. G. L.;
Ferreira, V. F.; Rev. Virtual Quim. 2010, 2, 140.
21. Bolfe, V. J.; Guirro, R. R. J.; Rev Bras Fisioter. 2009, 13, 499.
22. Kramer, J. F.; Arch. Phys. Med. Rehabil. 1984, 65, 223.
23. Low, J.; Reed, A.; Eletroterapia explicada: princípios e prática, 3
a
ed.,
Manole: Barueri, 2001.
24. Mendonça, C. C.; Silva, I. C. L.; Rodrigues, K. A.; Campos, M. A. L.;
Medeiros, M. C. M.; Casteli, V. C.; Ferrari, M.; Musis, C. R.; Machado,
S. R. P.; Rev. Ciênc. Farm. Básica Apl. 2009, 30, 26.
25. Lavagnoli, L. V.; Navarro, M.; Giovani, W. F.; Romero, J. R.; Quim.
Nova 1995, 18, 157.
26. Profeti, L. P. R.; Profeti, D.; Olivi, P.; Ecl. Quím. 2005, 30, 75.
27. Noel, M.; Vasu, K. I.; Cyclic Voltammetry and the Frontiers of Electro-
chemistry, 4
th
ed., Aspect Publications Ltd.: London, 1990.
28. Martins, M. R. F. M.; Veiga, F.; Rev. Bras. Cienc. Farm. 2002, 38, 33.
29. Baby, A. R.; Filho, C. A. H.; Sarruf, F. D.; Júnior, C. R. T.; Pinto, C. A.
S. O.; Zague, V.; Arêas, E. P. G.; Kaneko, T. M.; Velasco, M. V. R.; Braz.
J. Pharm. Sci. 2008, 44, 233.
30. Sanghavi, B. J.; Srivastava, A. K.; Electrochim. Acta 2010, 55, 8638.
31. de Maria, C. A. B.; de Moreira, R. F. A.; Quim. Nova 2007, 30, 99.
32. Lourenção, B. C.; Medeiros, R. A.; Rocha-Filho, R. C.; Mazo, L. H.;
Fatibello-Filho, O.; Talanta 2009, 78, 748.
33. Zen, J.-M.; Ting, Y.-S.; Anal. Chim. Acta 1997, 342, 175.
34. Aklilu, M.; Tessema, M.; Redi-Abshiro, M.; Talanta 2008, 76, 742.
35. Bard, A. J.; Faulkner, L. R.; Electrochemical methods: Fundamentals
and applications, 2
nd
ed., John Wiley & Sons: Hoboken, 2000.
36. Chaves, J. A. P.; Araújo, M. F. A.; Varela Júnior, J. J. G.; Tanaka, A. A.;
Ecl. Quím. 2003, 28, 9.
37. Koeke, P. U.; Parizotto, N. A.; Carrinho, P. M.; Salete, A. C. B.;
Ultrasound Med Biol. 2005, 31, 345.
38. Péres, V. F.; Saffi, J.; Melecchi, M. I. S.; Abad, F. C.; Jacques, R. A.;
Martinez, M. M.; Oliveira, E. C.; Caramão, E. B.; J. Chromatogr., A
2006, 1105, 115.
39. Santos, M. H.; Batista,
B. L.; Duarte, S. M. S.;
Abreu, C. M. P.; Gouvêa,
C. M. C. P.; Quim. Nova 2007, 30, 604.
40. Garrett; B. E.; Griffiths, R. R.; Pharmacol., Biochem. Behav. 1997, 57,
533.
41. Kerrigan, S.; Lindsey, T;. Forensic Sci. Int. 2005, 153, 67.