Proteins of cupuacu seeds (Theobroma grandiflorum Schum) and changes during fermentation and roasting

Abstract

Cupuacu (Theobroma grandiflorum Schum) is a native fruit from northern Brazil with great economic potential. Its productive chain is currently sustained by the pulp market. The seed, treated as a by-product of the pulp industrialization, presents considerably protein content. However, very little or nothing is known on its eletrophoretic profile and amino acids, the main protein fractions and alterations due to the fermentation and toasting. The objective of this study was to characterize protein changes in cupuacu seeds, fermented beans, and roasted beans, through the analysis of the electrophoresis profiles, aminograms, and protein fractionations based on solubility. Fermentation and roasting promoted a slight reduction in the total protein and amino acid contents. The seeds and fermented beans presented four main protein bands with 15.5, 20.4, 27.1, and 33.6 kDa. The beans submitted to fermentation followed by roasting presented only one strong protein band with an apparent molecular weight of 21.0 kDa. The extractions for protein fractionation based on solubility did not result in pure protein fractions. Four main bands were observed in all isolated protein fractions. The 21.1 kDa band was predominant in all cases. This band is apparently very similar to the albumin fraction of cocoa, whose apparent molecular weight is 21.3 kDa.

Full text

Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas, 28(4): 986-993, out.-dez. 2008
986
ISSN 0101-2061 Ciência e Tecnologia de Alimentos
Recebido para publicação em 20/2/2008
Aceito para publicação em 17/7/2008 (003236)
1 Laboratório de Agroindústria, EMBRAPA Amazônia Oriental, Travessa Enéas Pinheiro, s/n, CEP 66095-100, CP 48, Belém - PA, Brasil, E-mail: anavania@cpatu.embrapa.br
2 Departamento de Tecnologia de Alimentos, Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP, Campinas - SP, Brasil
3 Departamento de Alimentos e Nutrição, Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP, CEP 13083-970, Campinas - SP, Brasil
*A quem a correspondência deve ser enviada
Proteínas da semente de cupuaçu e alterações devidas à fermentação e à torração
Proteins of cupuacu seeds (eobroma grandiorum Schum) and changes during fermentation and roasting
Ana Vânia CARVALHO1*, Nelson Horacio Pezoa GARCÍA2, Jaime Amaya FARFÁN3
1 Introdução
O cupuaçuzeiro é uma árvore típica da região amazô-
nica, cultivada nos estados do Pará, Rondônia, Amazonas,
Acre e Maranhão. É considerada uma das melhores e mais
promissoras árvores fruteiras da Amazônia. O cupuaçu vem
se destacando como um dos frutos regionais amazônicos de
intensa divulgação no território brasileiro e com grande po-
tencial para a industrialização. O seu valor econômico está
baseado, principalmente, na industrialização e comercialização
da polpa, apreciada sob a forma de suco, creme, doces e outros
processamentos culinários. Apesar de constituírem cerca de 20%
do peso do fruto e possuírem alto valor nutritivo, as sementes
são praticamente descartadas no beneciamento do fruto. Em
função de suas propriedades, a semente é considerada valiosa,
pois possui semelhança botânica e química com a semente de
cacau, possibilitando a sua utilização na fabricação de produtos
similares ao chocolate (COHEN; JACKIX, 2005). O processo
de industrialização das sementes de cupuaçu ocorre de modo
semelhante ao das sementes de cacau, que inclui as etapas de
fermentação, secagem e torração.
A etapa de fermentação das sementes é essencial ao pro-
cessamento, pois é a etapa responsável pelo desenvolvimento
dos precursores e inúmeros compostos de sabor. O processo
de fermentação das sementes inicia-se naturalmente pela ação
da atividade microbiana na polpa mucilaginosa, que envolve
a semente. Os produtos do metabolismo dos microrganis-
mos principalmente álcool, ácidos orgânicos e o calor gerado
nos primeiros dias de fermentação provocam a destruição do
Abstract
Cupuacu (eobroma grandiorum Schum) is a native fruit from northern Brazil with great economic potential. Its productive chain is
currently sustained by the pulp market. e seed, treated as a by-product of the pulp industrialization, presents considerably protein content.
However, very little or nothing is known on its eletrophoretic prole and amino acids, the main protein fractions and alterations due to the
fermentation and toasting. e objective of this study was to characterize protein changes in cupuacu seeds, fermented beans, and roasted
beans, through the analysis of the electrophoresis proles, aminograms, and protein fractionations based on solubility. Fermentation and
roasting promoted a slight reduction in the total protein and amino acid contents. e seeds and fermented beans presented four main protein
bands with 15.5, 20.4, 27.1, and 33.6 kDa. e beans submitted to fermentation followed by roasting presented only one strong protein band
with an apparent molecular weight of 21.0 kDa. e extractions for protein fractionation based on solubility did not result in pure protein
fractions. Four main bands were observed in all isolated protein fractions. e 21.1 kDa band was predominant in all cases. is band is
apparently very similar to the albumin fraction of cocoa, whose apparent molecular weight is 21.3 kDa.
Keywords: protein fractions; amino acid; electrophoresis.
Resumo
O cupuaçu (eobroma grandiorum Schum) é um fruto típico da região Norte do Brasil, com grande potencial econômico. Atualmente, é a
polpa que mobiliza e sustenta a produção, a industrialização e a comercialização deste fruto. A semente, um subproduto da industrialização da
polpa, apresenta teor considerável de proteínas. Entretanto, muito pouco ou nada se conhece acerca de seu perl eletroforético, de aminoácidos
e de principais frações, uma vez que ocorrem alterações protéicas devidas aos processos de fermentação e torração. O objetivo deste estudo
consiste em caracterizar as alterações da proteína da semente, da amêndoa fermentada e da amêndoa torrada de cupuaçu, mediante a análise
dos pers eletroforéticos, dos aminogramas característicos e do fracionamento da proteína em diferentes solubilidades. A fermentação e a
torração provocaram uma ligeira redução nos teores de proteína total e aminoácidos totais, quando comparados aos teores das sementes não
submetidas a essas etapas do processamento. Observou-se, para a semente e a amêndoa fermentada, a presença de quatro bandas protéicas
principais de 20,4, 33,6 e 38,7 kDa. Para as amêndoas que foram submetidas ao processo de fermentação e, em seguida, à torração, observou-se
a presença de uma única banda protéica forte, com peso molecular aparente de 21,0 kDa. As extrações para fracionamento das proteínas em
diferentes solubilidades não resultaram em frações protéicas puras. Observou-se a presença de quatro bandas principais em todas as frações
protéicas isoladas, sendo a banda de peso molecular próximo a 21,1 kDa a mais abundante em todos os casos. Esta banda é aparentemente
muito semelhante à fração albumina do cacau, que apresenta peso molecular aparente de 21,3 kDa.
Palavras-chave: frações protéicas; aminoácidos; eletroforese.

Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas, 28(4): 986-993, out.-dez. 2008 987
Carvalho; García; Farfán
poder germinativo da semente e desencadeiam importantes
transformações físico-químicas e estruturais. Estas transfor-
mações afetam signicativamente a qualidade do produto nal,
principalmente os aspectos que envolvem a formação de sabor
(SCHWAN, 1996).
Durante a fermentação, observa-se aumento do conteúdo
de aminoácidos livres e peptídios em função da quebra das
moléculas de proteínas. Há também formação de açúcares redu-
tores pela quebra de sacarose. Estes compostos são conhecidos
como os principais precursores do sabor do chocolate ou de
análogos. Brito et al. (2001), em um estudo das amêndoas de
cacau, observaram que, após 72 horas de fermentação, houve
aumento signicativo de quase todos os aminoácidos livres,
com exceção da tirosina e lisina.
O objetivo deste estudo consiste em caracterizar os princi-
pais polipeptídios da semente de cupuaçu antes e após os pro-
cessos de fermentação e torração, em função de sua solubilidade
e peso molecular, além de caracterizar o perl aminoacídico
destes materiais.
2 Material e métodos
2.1 Preparo das sementes in natura, amêndoas fermentadas
e amêndoas fermentadas torradas
As sementes e amêndoas fermentadas foram preparadas
na Cooperativa Agrícola Mista de Tomé-Açú (CAMTA), no
estado do Pará, Brasil. Para a obtenção das sementes in natura,
foi extraído o máximo possível da polpa aderida às sementes,
que foram secas ao sol em barcaças de madeira, até atingir
umidade entre 7 e 8%. As amêndoas fermentadas foram obtidas
segundo a metodologia proposta por Vasconcelos (1999). As
sementes de cupuaçu foram fermentadas em caixa de madeira,
construída de acordo com Grimaldi (1978), com as seguintes
dimensões: 190 cm de comprimento, 120 cm de largura e 60 cm
de altura, com espaço entre as tábuas de fundo de 0,2 cm para
escoamento do líquido gerado durante o processo fermentativo.
A caixa possui três compartimentos com forma e volume ade-
quados para o processo e capacidade para 160 kg de sementes.
A caixa deve ser colocada sob abrigo de chuva e sol, de modo
a proteger as sementes.
Inicialmente, as sementes foram colocadas no primeiro
compartimento da caixa, juntamente com folhas picadas de
bananeira, para proporcionar a inoculação dos microrga-
nismos existentes na superfície dessas folhas; em seguida,
foram cobertas com sacos de aniagem para auxiliar a retenção
de calor gerado durante a fermentação. O tempo total do
processo foi de 7 dias, com revolvimento das sementes após
48 horas para o segundo compartimento e após 72 horas,
para o terceiro compartimento da caixa. Foram determina-
das as temperaturas diárias da massa em diferentes níveis
(superfície, meio e fundo), com o auxílio de um termômetro
de mercúrio. Após a fermentação, as amêndoas foram secas
ao sol em barcaça de madeira, até obtenção de umidade nal
entre 7 e 8%.
A torração das amêndoas fermentadas foi conduzida de
acordo com Carvalho, García e Wada (2005).
As sementes, amêndoas fermentadas secas e amêndoas fer-
mentadas torradas foram quebradas e descascadas manualmente
para a remoção da testa (casca) e do gérmen. Os cotilédones
foram namente moídos em aparelho de cilindros resfriados
(Pilão, Bauru, Brasil) e submetidos à extração da gordura em
aparelho de Soxhlet, por 20 horas.
2.2 Extração das frações protéicas
A extração seqüencial das proteínas de semente desengor-
durada de cupuaçu foi realizada como descrito por Pedó (1996).
Porções de 20 g de semente desengordurada de cupuaçu foram
submetidas à extração por uma hora em solução de NaCl 1M
(1:10, p/v), sob agitação contínua e temperatura de 5 °C. A se-
guir, a suspensão foi centrifugada a 15000 x g por 30 minutos
a 5 °C, obtendo-se o sobrenadante I e o resíduo I.
O sobrenadante I, com albuminas e globulinas solúveis em
soluções levemente salinas, foi dialisado contra água destilada
por 48 horas; neste processo, a redução da força iônica do meio
induziu a precipitação das globulinas. Após centrifugação do
dialisado, o sedimento (fração globulina) e sobrenadante (fração
albumina) foram liolizados.
O resíduo I foi ressuspendido em etanol a 70%, agitado
por uma hora na temperatura ambiente e centrifugado a
15000 x g por 30 minutos à temperatura de 5 °C. Após a centri-
fugação, foram obtidos o sobrenadante II e o resíduo II. O sobre-
nadante, após ser liolizado, constituiu a fração prolamina.
O resíduo II foi ressuspendido em solução formada por
dodecil sulfato de sódio 0,5% e 2-mercaptoetanol 0,6%, em
pH 7,6, e agitado por uma hora na temperatura ambiente. Após
centrifugação a 15000 x g por 30 minutos a 5 °C, obteve-se o
sobrenadante III e o resíduo III. O sobrenadante, após ser lio-
lizado, constitui a fração glutelina.
O resíduo III, constituído basicamente de amido, proteínas
insolúveis e substâncias da fração bra alimentar, foi liolizado e
posteriormente analisado juntamente com as demais frações.
2.3 Determinação do teor de proteína nas sementes, amêndoas
fermentadas, amêndoas torradas e nas frações protéicas
O teor de proteína foi determinado pelo método semi micro
Kjeldahl, baseado na digestão e posterior destilação da amostra
(AOAC, 1997).
2.4 Perl de aminoácidos da semente, da amêndoa
fermentada e da amêndoa torrada
Composição de aminoácidos totais
A composição de aminoácidos totais foi determinada por
hidrólise ácida da amostra desengordurada, com HCl 6 N
a 110 °C, a vácuo, por 22 horas. A amostra foi recuperada
em diluente de citrato de sódio pH 2,2, marca Pickering
( SPACKMAN et al., 1958).
As determinações foram feitas utilizando-se cromató-
grafo de troca iônica (ermo Separation Products; Riviera

Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas, 28(4): 986-993, out.-dez. 2008
988
Proteínas da semente de cupuaçu
Beach, Estados Unidos), com bomba degaseicadora acopla-
da a um módulo de pré-reação Pickering Laboratories PCX
3100 post-column reaction module (Mountain View, Canadá),
operando com detector de UV, nos comprimentos de onda de
440 e 570 nm, modelo Spectro System UV2000. Foi utilizada
coluna analítica Pickering Laboratories 1193250 (Na+ 8 μm,
3 mm ID x 250 mm), acoplada a uma pré-coluna Pickering
Laboratories 1192020 (Na+ 8 μm, 2 mm ID x 20 mm). Soluções
de Na (3,15; 7,4 e 0,2 N) foram utilizadas com um uxo de
0,3 mL/min a 55 °C na coluna e 130 °C no reator.
Triptofano
O aminoácido triptofano foi determinado após hidrólise
enzimática com pronase, a 40 °C, por 24 horas, seguida de
reação colorimétrica, na ausência de luz, com dimetilamino
benzaldeído (DAB) e nitrito de sódio, com posterior leitura em
espectrofotômetro, a 540 nm (SPIES, 1967).
2.5 Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)
A determinação do perl eletroforético das proteínas da
semente, da amêndoa fermentada, da amêndoa torrada e das fra-
ções protéicas foi realizada de acordo com Laemmli (1970), com
algumas modicações; utilizou-se, neste processo, o Sistema
Mini-Protean II com fonte Bio Rad (Oregon, Estados Unidos).
As amostras (0,4% de proteína) foram dispersas em 1 mL de
solução tampão, formada por 42,5% de água destilada, 12,5%
de Tris-HCl 0,5M (pH 6,8), 20% de glicerol, 20% de SDS, 5% de
β-mercaptoetanol e 0,1% de bromofenol; a seguir, as amostras
foram aquecidas a 95 °C por 5 minutos e, após resfriamento,
alíquotas de 5 μL de cada amostra foram aplicadas no gel.
Utilizou-se o gel de separação a 12% e o gel de empilhamento a
4%. Após a corrida, os géis foram mantidos em solução corante
de Brillant Blue G a 0,1% em ácido fosfórico por 24 horas e, a
seguir, descorados em água destilada.
Os pesos moleculares da proteína foram determinados
utilizando-se o padrão Pharmacia (17-0446-01): fosforilase b
(97 kDa), albumina sérica bovina (66 kDa), ovalbumina
(45 kDa), anidrase carbônica (30 kDa), inibidor de tripsina
(20,1 kDa) e α-lactalbumina (14,4 kDa).
A densitometria dos géis foi realizada em densitôme-
tro Sharp JX 330, empregando-se o soware Image Master
( Pharmacia) (Upsala, Suécia), para calcular os pesos moleculares
aparentes de cada banda, segundo comparação com os pesos
moleculares da proteína-padrão.
2.6 Eletroforese em sistema SDS-PAGE-tricina
Proteínas e oligopeptídios com massa molecular abaixo de
14 kDa não apresentam boa resolução em sistema SDS-PAGE,
como descrito por Laemmli (1970), e também em sistema de
gradiente de gel.
O procedimento descrito por Schagger e Jagow (1987) no
qual o íon carregador, a glicina, do sistema de Laemmli, é subs-
tituído por tricina apresenta boa resolução para peptídios na
faixa de 1 a 100 kDa. Além desta substituição do íon carregador,
são empregados três géis: gel de separação, gel espaçador e gel
de empilhamento.
Dessa forma, o perfil eletroforético dos peptídios de
peso molecular inferior a 14 kDa foi realizado de acordo com
Schagger e Jagow (1987), utilizando-se o gel de separação a
16,5% de acrilamida e 3% de bis-acrilamida, o gel espaçador
a 10% de acrilamida e 3% de bis-acrilamida e o gel de empi-
lhamento a 4% de acrilamida e 3% de bis-acrilamida. Após a
corrida, os géis foram mantidos em solução corante de Brilhante
Blue G a 0,1% em ácido fosfórico por 24 horas e, a seguir, des-
corados em água destilada.
Os pesos moleculares da proteína foram determinados
utilizando-se o padrão Pharmacia (80-1129-83): globulina
I + II (14404 Da), globulina I + III (10700 Da), globulina
I (8159 Da), globulina II (6214 Da), globulina III (2512 Da).
A densitometria dos géis foi efetuada em densitômetro Sharp
JX 330, empregando-se o soware Image Master (Pharmacia)
(Upsula, Suécia) para calcular os pesos moleculares aparentes
de cada banda, em relação à proteína-padrão.
3 Resultados e discussão
3.1 Eletroforese das frações isoladas da semente de cupuaçu
A Tabela 1 apresenta os valores médios da quantidade de
proteína extraída e o teor protéico de cada uma das frações
obtidas da tentativa de fracionamento da proteína de semente
de cupuaçu, a partir de 20 g de farinha desengordurada. É per-
tinente ressaltar que as extrações não resultaram em frações
protéicas puras. Esta ocorrência é relativamente comum, pois
o maior ou o menor grau de separação é característico de cada
fonte protéica e, neste caso, as proteínas de cupuaçu mostram
ser de difícil separação pelo método empregado. Assim, cada
uma das frações foi corrigida pelo fator de pureza correspon-
dente (teor de proteína da amostra ou resíduo): 54,15 para a
fração albumina; 42,81 para a fração globulina; 11,87 para a
fração prolamina; 17,92 para a fração glutelina, e 20,51 para o
resíduo III.
O perl eletroforético e os pesos moleculares calculados
para cada uma das frações isoladas no fracionamento da pro-
teína de semente de cupuaçu estão apresentados na Figura 1 e
na Tabela 2, respectivamente.
Para ns comparativos de duas espécies similares, foi reali-
zada a eletroforese de semente de cacau, de semente de cupuaçu
e das frações protéicas obtidas a partir da semente de cupuaçu
(Figura 1 e Tabela 2).
Observou-se a presença de quatro bandas principais em
todas as frações protéicas isoladas, com pesos moleculares
próximos a 16,1, 21,2, 34,8 e 40,5 kDa. A banda de peso mole-
cular próximo dos 21,1 kDa foi a mais abundante em todos os
casos. Esta banda é aparentemente muito semelhante à da fração
albumina do cacau, que apresenta peso molecular aparente de
21,3 kDa. Notou-se, ainda, na fração tida como globulina, a
presença de duas bandas fracas com pesos moleculares apa-
rentes de 28,3 e 63,6 kDa. Para o resíduo III, vericou-se, além
das bandas presentes nas demais frações, a presença de quatro

Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas, 28(4): 986-993, out.-dez. 2008 989
Carvalho; García; Farfán
bandas com pesos moleculares maiores e que estão presentes
também na semente de cupuaçu.
Observa-se no perl eletroforético das proteínas ( Figura 1)
que o fracionamento realizado neste estudo resultou em frações
protéicas bastante impuras. Dessa forma, poucas conclusões
podem ser feitas com relação às frações protéicas do cupuaçu.
Voigt, Biehl e Wazir (1993), em um estudo das principais
proteínas do cacau, encontraram que as frações albumina e
globulina ocorriam em proporções de 52 e 43% do total das
proteínas da semente, respectivamente. A mais importante
albumina é um polipeptídio com peso molecular aparente de
19 kDa, presumivelmente idêntico ao polipeptídio de 21 kDa
já relatado em estudos acerca do cacau de outros autores e
cuja seqüência de aminoácidos já foi reportada (SPENCER;
HODGE, 1991).
Diferentemente, a fração globulina contém polipeptídios
com pesos moleculares aparentes de 14,5, 31 e 47 kDa, e possui
globulinas somente do tipo vicilina. Não foi detectada a fração
prolamina e nem conrmada a existência de glutelina, apesar
de, em trabalhos anteriores (ZAK; KEENEY, 1976a,b), a fra-
ção prolamina ter sido identicada em sementes de cacau e a
proporção da fração glutelina apresentar-se consideravelmente
maior ao valor encontrado por Voigt, Biehl e Wazir (1993), que
foi cerca de 5% do total das proteínas.
3.2 Efeito da fermentação e da torração no teor de proteínas
e perl de aminoácidos da semente de cupuaçu
Os pers de aminoácidos totais encontrados na semente,
na amêndoa fermentada e na amêndoa torrada do cupuaçu,
e o teor de proteína total estão apresentados na Tabela 3. Nas
sementes não fermentadas, os teores de proteína encontram-se
superiores quando comparados aos teores do material submeti-
do à fermentação e daquele submetido a fermentação e torração.
Vasconcelos (1999) vericou que o teor de proteína total nas
sementes de cupuaçu varia ligeiramente durante a fermenta-
ção, sendo observado um pequeno decréscimo. Diversamente,
Lerceteau et al. (1999), ao estudarem as proteínas do cacau
durante o processo de fermentação, observaram que o teor
total de proteína diminuiu para 57% do valor inicial durante o
período de fermentação.
As etapas de fermentação e torração provocaram uma
ligeira redução nos teores de aminoácidos totais, quando
comparados aos teores de sementes que não foram submeti-
das a essas etapas de processamento (Tabela 3). Vasconcelos
(1999), ao estudar as transformações físicas e químicas durante
a fermentação de amêndoas de cupuaçu, observou uma pe-
quena redução no teor da maioria dos aminoácidos durante
o processo fermentativo, à exceção dos aminoácidos serina,
glicina, metionina, fenilalanina e arginina, que apresentaram
uma discreta elevação. Brito et al. (2001) constataram que
o perl de aminoácidos de amêndoas de cacau permanecia
praticamente inalterado quando comparado ao perl da se-
mente, apesar das importantes alterações ocorridas durante
o processo fermentativo.
A destruição de alguns aminoácidos durante a hidrólise
ácida limita sua quanticação para avaliação do ponto de vista
nutricional, pois alguns aminoácidos essenciais são parcial (me-
tionina, cisteína, treonina e tirosina) ou totalmente destruídos
(triptofano).
De acordo com os dados apresentados, a valina e a histidina
foram os aminoácidos limitantes para sementes de cupuaçu,
conforme o padrão de referência para crianças na faixa etária
de 1 a 3 anos (IMA, 2002). Para as amêndoas fermentadas e
amêndoas fermentadas e torradas, além da valina e da histidi-
na, observou-se redução nos teores do aminoácido lisina, que
passa também a ser considerado limitante após os processos de
fermentação e torração.
Lopes, Pezoa-García e Amaya-Farfán (2008), em um estu-
do das amêndoas fermentadas e torradas de cupuaçu e cacau,
relataram como aminoácidos limitantes para o cupuaçu a
lisina e histidina; observaram, no entanto, teores superiores ao
Tabela 1. Quantidade de proteína extraída e teor protéico em cada uma das frações isoladas no fracionamento da proteína de semente de cupuaçu,
a partir de 20 g de farinha desengordurada.
Frações protéicas
Albumina Globulina Prolamina Glutelina Resíduo III
Proteína extraída (%) 3,5 ± 0,11 0,65 ± 0,10 2,75 ± 0,83 1,50 ± 0,19 11,70 ± 0,44
Proteína na amostra (%) 54,15 ± 0,22 42,81 ± 0,17 11,87 ± 0,13 17,92 ± 0,17 20,51 ± 0,23
kDa
14,4
30,0
20,1
66,0
45,0
97,0
1 2 3 4 5 6 7 8
Figura 1. Perl eletroforético das frações protéicas de cupuaçu, em gel
de poliacrilamida - SDS. Coluna 1: padrão Pharmacia (17-0446-01);
coluna 2: semente de cacau; coluna 3: semente de cupuaçu; coluna 4:
albumina; coluna 5: globulina; coluna 6: prolamina; coluna 7: lutelina;
e coluna 8: resíduo III.

Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas, 28(4): 986-993, out.-dez. 2008
990
Proteínas da semente de cupuaçu
teor encontrado neste trabalho para o aminoácido valina. Os
Autores observaram ainda que o cupuaçu apresentou, para os
aminoácidos indispensáveis, teores mais elevados que o cacau,
com exceção de lisina, histidina e fenilalanina. Eles constataram
também que as proteínas da semente do cupuaçu possuem
composição aminoacídica que supera a composição das se-
mentes do cacau no que diz respeito aos aminoácidos leucina,
isoleucina e tirosina, que são aminoácidos limitantes para o
cacau. O fato de terem relatado um maior valor biológico para
as proteínas do cupuaçu em comparação às proteínas do cacau
incrementou os estudos com ratos, o que indica a pesquisa e a
busca da vericação de um considerável potencial nutricional
das proteínas da semente deste fruto.
3.3 Eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS-PAGE e em
gel de poliacrilamida-SDS-tricina da semente, da amêndoa
fermentada e da amêndoa fermentada e torrada de cupuaçu
O perl eletroforético da proteína da semente, da amêndoa
fermentada e da amêndoa fermentada e torrada de cupuaçu
pode ser observado na Figura 2.
Observou-se, para a semente de cupuaçu, a presença de
um total de nove bandas protéicas, sendo três bandas princi-
pais, com pesos moleculares aparentes próximos a 20,4, 33,6 e
38,7 kDa. Notou-se também a presença de mais seis bandas
fracas de maior peso molecular (15,5, 38,7, 44,3, 54,4, 60,8, e
83,4 kDa).
Tabela 2. Pesos moleculares aparentes (kDa) das proteínas de semente de cacau, de semente de cupuaçu e das frações isoladas de semente de
cupuaçu, calculados por densitometria.
Espécime
Cacau Cupuaçu Albumina S-I Globulina R-I Prolamina S-II Glutelina S-III Resíduo R-III
17,7 16,2 16,1 16,4 16,2 17,1 17,3
21,3 21,7 21,1 21,5 21,5 22,2 22,3
* 27,8 * 28,3 * * 29,2
37,3 35,3 34,8 35,6 35,6 36,5 35,8
55,3 40,5 39,5 41,4 41,7 42,3 *
* 45,9 * * * * 47,9
* 54,9 * * * * 56,9
* 61,8 * 63,6 * * 64,6
* 88,9 * * * * 90,9
*Bandas não detectadas.
Tabela 3. Teor de proteína total (%) e aminoácidos totais (mg.g–1 proteína) das sementes, amêndoas fermentadas, amêndoas fermentadas e
torradas de cupuaçu, em base seca e desengordurada, e padrão de referência (IMA, 2002).
Aminoácidos Teor de aminoácidos
Semente de cupuaçu Cupuaçu fermentado Cupuaçu torrado Cupuaçu torrado* Cacau torrado* IMAa
Indispensáveis
Treonina 59,20 ± 0,4 57,21 ± 1,5 56,66 ± 1,1 53 36 27
Valina 72,60 ± 1,5 63,36 ± 3,7 60,63 ± 0,3 56 51 32
Metionina 4,59 ± 1,1 4,26 ± 1,1 2,49 ± 0,6 16 11 25b
Cistina 23,31 ± 0,4 22,70 ± 1,2 22,86 ± 1,2 19 12
Isoleucina 45,8 ± 0,3 41,61 ± 0,4 42,24 ± 0,8 43 35 25
Leucina 84,4 ± 1,5 77,07 ± 1,5 79,52 ± 1,5 70 53 55
Tirosina 37,06 ± 0,7 43,50 ± 1,5 42,74 ± 1,1 36 30
Fenilalanina 45,47 ± 0,3 41,13 ± 0,4 40,26 ± 0,3 37 38 47c
Lisina 53,11 ± 1,5 45,39 ± 4,7 43,74 ± 0,3 46 54 51
Histidina 14,52 ± 0,7 12,77 ± 1,5 11,43 ± 1,2 14 14 18
Triptofano 12,99 ± 0,1 14,60 ± 0,7 12,92 ± 0,4 - - 8
Não indispensáveis
Arginina 56,55 ± 1,5 56,74 ± 3,7 52,68 ± 0,4 - - -
Ácido aspártico 123,81 ± 2,6 144,21 ± 3,4 151,59 ± 1,5 - - -
Serina 53,11 ± 3,4 59,57 ± 2,3 58,15 ± 2,2 - - -
Ácido glutâmico 148,26 ± 1,1 141,37 ± 3,7 147,11 ± 3,4 - - -
Prolina 44,33 ± 2,2 52,01 ± 1,5 51,19 ± 8,9 - - -
Glicina 57,70 ± 0,3 60,99 ± 6,1 62,13 ± 0,8 - - -
Alanina 47,76 ± 0,3 45,86 ± 2,2 47,22 ± 0,8 - - -
Amônia 15,28 ± 0,7 14,66 ± 0,4 14,41 ± 0,8 - - -
Proteína total 26,17 ± 0,3 21,15 ± 0,8 20,12 ± 0,5 - - -
*Fonte: Lopes, Pezoa-García e Amaya-Farfán (2008); aPerl de avaliação (scoring pattern) para crianças de 1 a 3 anos (INSTITUTE OF MEDICINE, 2002); bmetionina + cisteína; e
cfenialanina + tirosina.

Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas, 28(4): 986-993, out.-dez. 2008 991
Carvalho; García; Farfán
Para a amêndoa submetida à fermentação, vericou-se
também a presença de três principais bandas protéicas, com
pesos moleculares aparentes similares ao observado para a
semente: 20,7, 34,0 e 39,2 kDa, e duas bandas tênues, de pesos
moleculares próximos a 15,9 e 27,2 kDa.
Na Tabela 4, estão indicados os pesos moleculares das pro-
teínas e, na Tabela 5, a área de cada banda protéica.
Em relação às amêndoas que foram submetidas ao processo
de torração, observou-se, no perl eletroforético das proteínas
(Figura 2), a presença de uma única banda protéica forte, com
peso molecular aparente de 21,0 kDa. Para as demais bandas, seu
desaparecimento pode ser atribuído provavelmente à ocorrência
de reações durante o processo de torração, como a reação de
Maillard complexação de proteínas com compostos polifenó-
licos, além da possível formação de diversos polímeros. Estas
várias reações que ocorrem durante a torração podem produzir
insolubilização e menor extratibilidade da proteína, por ocasião
do preparo da amostra a ser aplicada no gel. Além disso, não se
descarta a possibilidade de que as reações tenham produzido
polímeros de grande peso molecular, incapazes de penetrar no
gel e, assim, serem excluídos da corrida eletroforética.
Pettipher (1990), ao estudar a extração e a parcial purica-
ção das proteínas de reserva do cacau, encontrou, por meio da
SDS-PAGE, a presença de duas proteínas de reserva, S1 e S2, com
pesos moleculares aparentes de 28 e 48 kDa, respectivamente.
Estes pesos moleculares estão próximos aos encontrados por
Biehl, Wewetzer e Passern (1982), de 26 e 44 kDa. Segundo
Pettipher (1990), estas proteínas de reserva estão presentes nas
sementes, porém são ausentes nas folhas e nas sementes ger-
minadas. A densitometria do gel mostrou que as proteínas de
reserva S1 e S2 representam aproximadamente 19 e 17% do total
da proteína, respectivamente. Segundo o Autor, outra importan-
te proteína — não considerada uma proteína de reserva, uma
vez que ela não foi utilizada durante a germinação — representa
cerca de 20% do total de proteína. Similarmente ao ocorrido
na germinação, durante a fermentação do cacau observou-se
também uma perda total das proteínas de reserva S1 e S2. Este
fato indica que estas proteínas são preferencialmente degradadas
por ocasião do processo fermentativo.
Lerceteau et al. (1999), em um estudo das proteínas da
semente de cacau, encontraram resultados diferentes: cinco
grupos predominantes de polipeptídios, com pesos molecula-
res de 14,5; 16,5; 21; 31, e 47 kDa. Os Autores relatam que, ao
nal da fermentação, os polipeptídios com pesos moleculares
de 14,5, 31,0 e 47 kDa estavam ausentes, fato indicativo de que
estes, provavelmente, sejam polipeptídios de armazenamento
e que foram clivados em subunidades menores.
Na Figura 3, é possível observar o perl eletroforético dos
peptídios.
Tabela 4. Pesos moleculares aparentes (kDa) das proteínas da semente,
da amêndoa fermentada e da amêndoa fermentada e torrada de cupuaçu,
calculados através da densitometria do gel.
Semente Amêndoa fermentada Amêndoa torrada
15,5 15,9 *
20,4 20,7 21,1
27,0 27,2 *
33,6 34,0 *
38,7 39,2 *
44,3 * *
54,4 * *
60,8 * *
83,4 * *
*Abaixo do limite de quanticação.
Tabela 5. Área de cada banda protéica relativa à área total da prote-
ína da semente, da amêndoa fermentada e da amêndoa fermentada e
torrada, calculada a partir da densitometria do gel.
Bandas
(PM)
Bandas (%)
Semente Amêndoa fermentada Amêndoa torrada
15,5-15,9 9,79 10,79 *
20,4-21,1 40,77 47,99 100,00
27,0-27,2 4,92 23,56 *
33,6-34,0 14,47 10,02 *
38,7-39,2 11,57 7,64 *
44,3 5,43 * *
54,4 4,09 * *
60,8 6,61 * *
83,4 2,34 * *
*Abaixo do limite de quanticação.
Figura 2. Perl eletroforético da proteína da semente, da amêndoa
fermentada e da amêndoa fermentada e torrada de cupuaçu, em gel de
poliacrilamida-SDS; coluna 1: padrão Pharmacia (17-0446-01); coluna
2: semente de cupuaçu; coluna 3: amêndoa fermentada de cupuaçu; e
coluna 4: amêndoa fermentada e torrada de cupuaçu.
kDa
14,4
20,1
30,0
45,0
66,0
97,0
1 2 3 4

Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas, 28(4): 986-993, out.-dez. 2008
992
Proteínas da semente de cupuaçu
sugerem que as globulinas, possivelmente, sejam a fonte dos
precursores para a formação do sabor característico do cacau.
Amin, Jinap e Jamilah (1997), ao estudarem sementes de
cacau, também observaram a degradação da fração vicilina
(39,2 e 47,1 kDa) durante a fermentação do cacau, e a fração
albumina como a mais resistente à proteólise. Ao nal da fermen-
tação, o polipeptídio de 39,2 kDa foi completamente degradado,
mas o de peso molecular de 47,1 kDa ainda estava presente em
baixa intensidade, o que indica que ambos são importantes para
a formação de precursores do sabor do cacau. A fração de peso
molecular 21 kDa tem sido caracterizada como um inibidor de
tripsina (SPENCER; HODGE, 1991; TAI et al., 1991; DODÔ;
FRITZ; FURTEK, 1992).
4 Conclusões
• Osprocessosdefermentaçãoetorraçãodassementesde
cupuaçu provocaram redução nos teores da maioria dos
aminoácidos indispensáveis, com destaque para a lisina
e a valina, que apresentaram perdas em torno de 15%.
Com relação à metionina, observou-se, em média, 40%
de perdas devido ao processo de torração;
• Assementeseamêndoasdecupuaçuapresentaramboa
composição aminoacídica. A valina e a histidina foram
os aminoácidos limitantes para as sementes in natura.
Nas amêndoas fermentadas e amêndoas fermentadas e
torradas, além da valina e da histidina, a lisina também
se apresentou como limitante;
• Paraasproteínasdasementeedaamêndoafermentada
de cupuaçu, vericou-se a presença de três bandas ele-
troforéticas principais, com pesos moleculares próximos
a 20,4, 33,6 e 39 kDa. Nas amêndoas fermentadas e tor-
radas, observou-se perl eletroforético das proteínas com
somente uma banda protéica forte, com peso molecular
aparente de 21,1 kDa; e
• Asextraçõesparafracionamentodasproteínasemdiferen-
tes meios de solubilidades resultaram em frações protéicas
impuras. A presença de quatro bandas principais em todas
as frações protéicas isoladas (16,1; 21,2; 34,8, e 40,5 kDa)
foi observada, sendo a banda de peso molecular próximo a
21,1 kDa a mais abundante em todos os casos. Esta banda
é muito semelhante à da fração albumina do cacau, que
apresenta peso molecular aparente de 21,3 kDa.
Agradecimentos
Os autores agradecem à Fundação de Apoio à Pesquisa
do Estado de São Paulo (FAPESP), pela concessão da bolsa de
doutorado para Ana Vânia Carvalho.
Referências bibliográcas
AOAC. Offic ial met hod s of analysis of the Assoc iati on of
OcialAOAC. Ocial methods of analysis of the Association of
Ocial Analytical Chemists. 16 ed. Washington, 1997.
AMIN, I.; JINAP, S; JAMILAH, B. Vicilin-class globulins and their
degradation during cocoa fermentation. Food Chemistry, v. 59,
n. 1, p. 1-5, 1997.
Observou-se no perl eletroforético da semente e da amên-
doa fermentada (Figura 3), a presença de cinco bandas fracas
com pesos moleculares aparentes próximos a 7,2; 8,6; 10,1; 12,0,
e 14,0 kDa, que provavelmente correspondam a fragmentos
protéicos ou peptídios (Tabela 6). Diferentemente, nas amên-
doas submetidas a fermentação e torração, houve diminuição
progressiva de todas as bandas, especialmente das de maior peso
molecular. Na medida em que estas bandas não foram detectadas
na densitometria do gel, suspeita-se que, no caso dessas bandas
corresponderem a peptídios, os mesmos tenham participado da
reação de Maillard por serem mais reativos. Formariam dessa
forma, polímeros de maior peso molecular durante o processo
de torração.
Voigt, Biehl e Wazir (1993), em um estudo das principais
proteínas do cacau durante o processo fermentativo, observa-
ram uma perda quase total das globulinas, fato que indica uma
digestão proteolítica seletiva, uma vez que a fração albumina
praticamente não sofreu alteração quantitativa. Os Autores
Tabela 6. Pesos moleculares aparentes (kDa) dos peptídios da semen-
te, da amêndoa fermentada e da amêndoa fermentada e torrada de
cupuaçu, calculados da densitometria do gel.
Pesos moleculares (kDa)
Semente Amêndoa fermentada Amêndoa torrada
7,3 7,2 *
8,6 8,6 *
10,0 10,2 *
11,3 12,6 *
13,8 14,4 *
*Abaixo do limite de quanticação.
Figura 3. Perl eletroforético dos peptídios da semente, da amêndoa
fermentada e da amêndoa fermentada e torrada de cupuaçu, em gel de
poliacrilamida-SDS-tricina; coluna 1: padrão Pharmacia (80-1129-3);
coluna 2: semente de cupuaçu; coluna 3: amêndoa fermentada de
cupuaçu; e coluna 4: amêndoa torrada de cupuaçu.
14404
10700
8159
6214
Da
1 2 3 4

Ciênc. Tecnol. Aliment., Campinas, 28(4): 986-993, out.-dez. 2008 993
Carvalho; García; Farfán
(Mestrado em Ciência da Nutrição), Faculdade de Engenharia de
Alimentos, Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP.
PETTIPHER, G. L. e extraction and partial purication of cocoa
storage proteins. Café Cacao é, v. 34, n. 1, p. 23-26, 1990.
SCHAGGER, H.; JAGOW, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-
polyacrylamide gel eletrophoresis for the separation of proteins
in the range from 1 to 100 kDa. Analytical Biochemistry, v. 166,
p. 368-379, 1987.
SCHWAN, R. F. Microbiology of cocoa fermentation: a study to
improve quality. In: CONFERÊNCIA INTERNACIONAL DE
PESQUISA EM CACAU, 12, Salvador, BA, nov. 1996. Anais...
Salvador: CEPLAC, 1996.
SPACKMAN, D. H.; STEIN, W. H.; MOORE, S. Automatic recording
apparatus for use in the chromatography of amino acids. Analytical
Chemistry, v. 30, n. 3, p. 1190-1206, June 1958.
SPENCER, M. E.; HODGE, R. Cloning and sequencing of the cDNA
encoding the major albumin of eobroma cacao. Planta, v. 183,
p. 528-535, 1991.
SPIES, J. R. Determination of tryptophan in proteins. Analytical
Chemistry, Washington, v. 39, p. 1412-1415, 1967.
TAI, H. et al. Nucleic acid sequence of a 21 kDa cocoa seed protein
with homology to the soybean trypsin inhibitor (Kunitz) family
of protease inhibitors. Plant Molecular Biology, v. 16, p. 913-915,
1991.
VASCONCELOS, M. A. M. Transformações físicas e químicas
durante a fermentação de amêndoas de cupuaçu (eobroma
grandiflorum Schum). Campinas, 1999. 114p. Dissertação -
(Mestrado em Tecnologia de Alimentos), Faculdade de Engenharia
de Alimentos, Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP.
VOIGT, J.; BIEHL, B.; WAZIR, S. K. S. e major seed proteins of
eobroma cacao L. Journal Food Chemistry, v. 47, p. 145-151,
1993.
ZAK, D. K.; KEENEY, P. G. Extraction and fractionation of cocoa
proteins as applied to several varieties of cocoa beans. Journal of
Agricultural and Food Chemistry, v. 24, p. 479-482, 1976a.
______. Changes in cocoa proteins during ripening of fruit,
fermentation, and further processing of cocoa beans. Journal of
Agricultural and Food Chemistry, v. 24, p. 483-486, 1976b.
BIEHL, B.; WEWETZER, C.; PASSERN, D. Vacuolar (Storage) proteins
of cocoa seeds and their degradation during germination and
fermentation. Journal of the Science of Food and Agriculture,
v. 33, p. 1291-1304, 1982.
BRITO, E. S. et al. Structural and chemical changes in cocoa
(eobroma cacao L) during fermentation, drying and roasting.
Journal of the Science of Food and Agriculture, v. 81, n. 2,
p. 281-288, 2001.
CARVALHO, A. V.; GARCÍA, N. H. P.; WADA, J. K. A. Caracterização
físico-química e curvas de solubilidade protéica de sementes,
amêndoas fermentadas e torradas de cupuaçu (Theobroma
grandiorum Schum). Brazilian Journal of Food Technology, v. 8,
n. 2, p. 127-134, 2005.
COHEN, K. O.; JACKIX, M. N. H. Estudo do liquor de cupuaçu.
Ciência e Tecnologia de Alimentos, v. 25, n. 1, p. 182-190, 2005.
DODO, H. W.; FRITZ, P. J.; FURTEK, D. B. A cocoa 21 kilodalton
seed protein has trypsin inhibitory activity. Café Cacao é, v. 36,
p. 279-284, 1992.
GRIMALDI, J. Les possibilités D’amélioration des techniques
D’ecabossage et de fermentation dans le processus artisanal de la
préparation du cacao. Café Cacao é, v. 22, p. 303-316, 1978.
INSTITUTE OF MEDICINE OF THE NATIONAL ACADEMIES.
Protein and amino acids. In: Dietary reference intakes for energy,
carbohydrate, ber, fat, fatty acids, cholesterol, protein, and
amino acids. Washington: e National Academies Press, 2002.
Part 2, chap 10, p. 1-143.
LAEMMLI, U. K. Clevage of structural proteins during the assembly of
the head of bacteriophage T4. Nature, v. 227, p. 680-685, 1970.
LERCETEAU, E. et al. Evolution of cacao bean proteins during
fermentation: a study by two-dimensional electrophoresis. Journal
of the Science of Food and Agriculture, v. 79, n. 4, p. 619-625,
1999.
LOPES, A. S.; PEZOA-GARCÍA, N. H.; AMAYA-FARFÁN, J. Qualidade
nutricional das proteínas de cupuaçu e de cacau. Ciência e
Tecnologia de Alimentos, v. 28, n. 2, p. 1-6, 2008.
PEDÓ, I. Caracterização química e nutricional de novos cultivares
de aveia (Avena sativa, L.). Campinas, 1996. 112p. Dissertação -