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Jahrbuch der Baumpflege 2013
4 Wissenschaftliche Kurzberichte
252
Möglichkeiten DNA-basierter Methoden
für Baumgutachten
Potential of DNA-based methods in arboriculture
von Aki Michael Höltken, Matthias Fladung, Markus Streckenbach
und Dirk Dujesiefken
Summary
Genetic analysis enables individual identifica-
tions of trees and shrubs, the development of me-
thods to trace back plant material in the case of
false labelling or investigation of damages caused
by tree roots. This individual genetic “barcoding-
procedure” is performed by using the so called
M13-fingerprinting method. A further technique
is highlighted (microsatellites = SSRs) in order to
control the varietal identity of offspring from spe-
cific individuals, crosses and breeding programs.
Zusammenfassung
Genetische Verfahren erlauben die Identifizierung
einzelner Bäume und Sträucher und können zur
Rückverfolgung pflanzlichen Materials bei Fehl-
deklarationen und Etikettenschwindel sowie zur
Ana lyse von Schäden durch Baumwurzeln einge-
setzt werden. Ein solches genetisches „Barcoding-
Verfah ren“ wird anhand der sogenannten
M13-Fingerabdruckmethode vorgestellt. Darüber
hin aus wird die Verwendung von Mikrosatelliten-
DNA-Markern beschrieben, die zur Überprüfung
der Echtheit von Nachkommenschaften einzelner
Individuen oder spezieller Kreuzungen und Züch-
tungen herangezo gen werden können.
1 Einleitung
Die genaue Identifizierung einer Gehölzart bzw. -sorte
stellt oft eine große Herausforderung dar, insbeson-
dere wenn es sich um Jungpflanzen oder nur um
einzelne Pflanzenteile handelt. Brisant wird es, wenn
innerhalb komplizierter Handelsketten eine genaue
Rückverfolgung von pflanzlichem Material erforder-
lich wird (vgl. DEGEN & HÖLTKEN 2011). Gleiches gilt für
die Identifizierung von histo rischen Pflanzen, z. B. in
alten Gartenanlagen.
Ein weiteres Problemfeld stellen durch Wurzeln verur-
sachte Schäden an Rohrleitungen oder Gebäu den dar
(STRECKENBACH et al. 2009; STRECKENBACH 2011). Kost-
spielige Sanierungsmaßnahmen derarti ger Schäden
verlangen nach einer eindeutigen Identifizierung des
„Verursacherbaumes“, damit Haf tungsansprüche gel-
tend gemacht werden können (Abbildung 1). Hierfür
kann eine Wurzelprobe in aller Regel bereits anhand
ihrer anatomischen Merkmale zugeordnet werden
(z. B. CUTLER et al. 1987; SCHWEINGRUBER 1990; KUT-
SCHERA & LICHTENEGGER 2002; STRECKENBACH 2009). Diese
bewährte und effiziente Methode stößt jedoch dann
an ihre Grenzen, wenn mehrere Exemplare einer Art
im Be reich der Schadensstelle, unter Umständen noch
auf verschiedenen Grundstücken, vorkommen. Oft
lassen sich auch botanisch nahe verwandte Arten und
Gattungen, wie zum Beispiel Pappeln (Populus spp.)
und Weiden (Salix spp.), anhand der Wurzelstruktur
nicht sicher unterscheiden (TROCKEN BRODT et al. 2001).
Eine anatomische Untersuchung von Pflanzentei-
len ist ebenfalls nicht zielführend, wenn die Gewebe
durch einen intensiven und langanhaltenden Kontakt
mit zersetzenden Agenzien, wie beispielsweise Abwäs-
sern, nur noch unvollständig erhalten sind. Kommen
mehrere Faktoren zusammen, kann sich die Aussage-
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DNA-basierte Methoden für Baumgutachten
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kraft des Materials soweit verringern, dass eine präzise
Zuordnung der Probe zu einem Gehölz nicht möglich
ist. Diese ungewöhnliche Kombination soll an folgen-
dem realen Beispiel veran schaulicht werden: Einem
Hausbesitzer entstanden durch Wurzeleinwüchse in
die Anschlussleitung seines Hauses wie derkehrend be-
trächtliche Kosten. Die in der Kanalisation wachsen-
den Wurzeln reduzierten den Lei tungsquerschnitt, so
dass sich zunächst der Abfluss der Abwässer verlang-
samte, bevor es schluss endlich zu einem Rückstau
von Fäkalien in das Gebäude kam. Die finanziellen
Aufwendungen umfass ten somit nicht nur jene zur
Instandsetzung der Hausanschlussleitung, sondern
auch die zur Sanie rung der umfangreichen Schäden
am Gebäude. Die Klärung der Frage nach der Scha-
den verursachen den Baumart sollte anhand einer aus
der Leitung geborgenen Wurzelprobe erfolgen. Von
den dort in Frage kommenden Arten waren zwei en-
ger miteinander verwandt (Spitz-Ahorn und Eschen-
Ahorn) mit ähnlichen anatomischen Merkmalen.
Insbesondere bei geringen Probenmengen und einer
unzu reichenden Qualität wird die Untersuchung
mehrerer Wurzelproben notwendig, so dass sich erst
aus mehreren Teilen ein komplettes Bild ergibt.
Bei der hier geschilderten Begutachtung ergaben meh-
rere Umstände – eine geringe und schlecht er haltene
Probemenge in einem jungen Entwicklungsstadium
zur Identifizierung einer von zwei nah miteinander
verwandten Baumarten –, dass eine endgültige Fest-
stellung der Artzugehörigkeit auf der Grundlage einer
anatomischen Untersuchung unmöglich war (Abbil-
dung 2). Die entnommene Wur zelprobe hätte in die-
sem Fall direkt einer genetischen Analyse zur exakten
Zuordnung unterzogen werden können.
Diese Arbeit soll zeigen, dass mehrere genetische Ver-
fahren zur Verfügung stehen und diese auch an na-
hezu beliebigen Pflanzenteilen durchgeführt werden
können. Um die Möglichkeiten von Art- und Sortener-
kennung als auch individueller Identifizierung zu tes-
ten, wurden für die Studie Laub- und Na delholzarten
mit unterschiedlichen taxonomischen Verwandt-
schaftsgraden ausgewählt. Außerdem soll auf das o. g.
Beispiel der beiden Ahornarten näher eingegangen
werden.
Abbildung 1: Durchwurzelter Abzweig einer
Mischwasserleitung. Das Einwachsen von
Wurzeln in Leitungssys teme kann zu einem
vollständigen Funktionsverlust des betreffenden
Abschnittes führen und einen Rückstau von
Abwässern in die angeschlossenen Gebäude
nach sich ziehen
Abbildung 2: Wurzelquerschnitte zur Verdeutlichung der Ähnlichkeit gattungsspezifi scher Charakte-
ristika. Links: Referenzprobe von Acer negundo L. (Eschen-Ahorn), mitte: vorgelegte Probe aus dem
Leitungsabschnitt, rechts: Referenzprobe von Acer platanoides L. (Spitz-Ahorn)
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2 Material und Methoden
2.1 Pflanzenmaterial
Um die Möglichkeiten der genetischen Verfahren für
die individuelle Genotypisierung zu testen, wur den
mehrere Individuen einer Art, einer Gattung oder
einer Familie untersucht. Die in dieser Studie unter-
suchten Baumarten umfassen unter anderem auch
einheimische Gehölze, welche im Straßen raum und
im Stadtbild häufig angetroffen werden. In Bezug auf
das einleitend genannte Beispiel haben wir auch die
nah verwandten Arten Acer platanoides L. (Spitz-
Ahorn) sowie Acer negundo L. (Eschen-Ahorn) mit in
die DNA-Analyse aufgenommen.
2.2 DNA-Extraktion
Die DNA wurde ausschließlich nach dem Protokoll
von DUMOLIN et al. (1995) extrahiert. Der Puffer zur
Auflösung der Zellwand- und Zellmembranbestand-
teile enthielt ATMAB (Alkyltrimethylammonium-
bromid)-PVP und zur Fällung von Verunreinigungen
diente Dichlormethan. Das Waschen der DNA er-
folgte in 70 %igem Ethanol. Isolierte DNA wurde bis
zur Analysedurchführung bei –20 °C in TE-Puffer
(10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) gelagert. Die
Endkonzentration der DNA-Lösungen für die weitere
Analytik wurde auf 10 ng/µl eingestellt. Letzteres er-
folgte in HPLC-Wasser.
2.3 Die M13-Fingerprint-Methode
Während der Evolution unterlagen die Genome von
Pflanzen und Tieren einer ständigen Weiterent-
wicklung. Zusätzlich hat auch das Einschleusen frem-
der DNA-Bestandteile, wie beispielsweise DNA-Sequen-
zen des Bakteriophagen M13, zu Veränderungen des
Erbgutes beigetragen. Diese in vielfa cher Ausfertigung
vorliegenden und deshalb auch als „Satelliten-DNA“
bezeichneten DNA-Sequenzen sind im Laufe von Ge-
nerationen innerhalb der Individuen ebenfalls evol-
viert und unterlagen somit ihrerseits Verän derungen,
die sie und damit einzelne Individuen voneinander
unterscheidbar machen (ROGSTAD et al. 1988, 1991).
In dieser Studie haben wir diese hochvariablen DNA-
Fragmente mit Hilfe einer PCR-Reaktion unter Ver-
wendung sogenannter universeller Primer in vitro
vermehrt. Die auf diese Weise vervielfältigten DNA-
Fragmente wurden anschließend in einer Agarose-
Gelelektrophorese aufgetrennt (Abbildung 3) und
mit dem Fluoreszenz-Farbstoff Rotisafe (Firma Roth)
markiert. Danach wurden die erzeugten Bandenmus-
ter unter UV-Licht ausgewertet.
3 Ergebnisse und Diskussion
Die M13-Fingerabdruck-Methode bietet eine zuverläs-
sige Möglichkeit zur genetischen Charakteri sierung
von verschiedenen Individuen der gleichen Art (sie-
Abbildung 3: Beladen eines Agarosegels mit in vitro-(= PCR-)vermehrten DNA-Fragmenten (Farb-
stoff Orange G) sowie mit einem Standard zur Schätzung der Fragmentlängen (Mischung
aus künstlichen DNA-Fragmenten bekannter Länge, blauer Farbstoff)
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he Abbildung 4). Dies steht im Einklang mit Un-
tersuchungen von FLADUNG & ZIEGENHAGEN (1998), die
mit Hilfe dieser Methode verschiedene Indi viduen der
Hainbuche (Carpinus betulus), der Stieleiche (Quer-
cus robur) und der Fichte (Picea abies) zuzüglich
ihrer im gärtnerischen Bereich verwendeten Mutanten
unterscheiden konnten (z. B. Eichen blättrige Hainbu-
che, Weißblattrandige Stieleiche und Zuckerhutfichte).
Besonders interessant sind die Bandenmuster ver-
schiedener Individuen des Feldahorns (Acer cam pes-
tre) in den Bandenreihen 1a bis 1 f von Abbildung 4.
Die einzelnen Individuen unterscheiden sich alle in
ihren Bandenmustern. Ebenfalls gelingt eine sehr kla-
re Abgrenzung zwischen verschiedenen Arten inner-
halb einer Gattung oder einer Familie. So erhalten die
verschiedenen Ahornarten alle ihre eigenen Banden-
muster. Die eingangs erwähnten Arten Acer negundo
L. (Eschen-Ahorn) und Acer pla tanoides L. (Spitz-
Ahorn), welche im oben genannten Beispiel Probleme
in Abwasserleitungen verur sacht haben, können mit
dieser Methode eindeutig identifiziert werden. Auch
die beiden Weidenar ten Salix caprea und S. fragilis,
die Schneeballarten Viburnum opulus und V. lan-
Abbildung 4: Bandenmuster nach in vitro-Vermehrung (PCR) der M13-Bakteriophagensequenz an
34 verschie denen Baum- und Straucharten; S = Längenstandard beginnend bei 200 Basenpaaren
zur Ermittlung der ampli fizierten Fragmentlängen; Pfeilrichtung = Laufrichtung der DNA-Fragmen-
te im Gel nach Anlegen eines elektri schen Feldes
1a Acer campestre (1)
1b Acer campestre (2)
1c Acer campestre (3)
1d Acer campestre (4)
1e Acer campestre (5)
1f Acer campestre (6)
2 Acer carpinifolium
3 Acer negundo
4 Acer platanoides
5 Acer pseudoplatanus
6 Aesculus hippocastanum
7 Aesculus × carnea
8 Alnus glutinosa
9 Betula pendula
10 Salix caprea
11 Salix fragilis
12 Viburnum opulus
13 Viburnum lantana
14 Juglans nigra
15 Juglans cordiformis
16 Carya glabra
17 Clematis vitalba
18 Platanus orientalis
19 Picea abies (1)
20 Picea abies (2)
21 Picea abies (3)
22 Picea abies (4)
23 Picea sitchensis
24 Abies amabilis
25 Abies balsamea
26 Abies homolepis
27 Abies lasiocarpa
28 Cephalotaxus harrigtonia
29 Chamaecyparis lawsoniana
30 Chamaecyparis obtusa
31 Larix gmelinii
32 Metasequoja glyptostroboides
33 Pinus koraiensis
34 Pinus mugo
35 Pinus parviflora
36 Pinus peuce
37 Sequoja sempervirens
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tana sowie die drei Arten aus der Familie der Wal-
nussgewächse (Juglans nigra, J. cordiformis, Carya
glabra (Juglanda ceae) sind klar zu unterscheiden.
Ähnlich dem M13-Fragment werden auch durch an-
dere molekulare Marker Bandenmuster erzeugt, wie
z. B. den RAPDs (Random Amplified Polymorphic
DNA), wobei die Stabilität der Analyseergebnisse je-
doch sehr unzureichend ist, so dass gerichtsfeste
Gutachten so kaum erzeugt werden können. Dieses
Problem besteht bei der M13-Methode nicht. Dieser
Sachverhalt wurde durch die Verwen dung unter-
schiedlicher PCR-Reaktionsansätze überprüft (vgl.
FLADUNG & ZIEGENHAGEN 1998).
Mit der M13-Methode steht ein ökonomisches Verfah-
ren für die Rückverfolgbarkeit von pflanzlichem Ma-
terial bereit. In Zweifelsfällen und zur Beantwortung
einer Vielzahl weiterer Fragestellungen kann darüber
hinaus auf die Analyse von Mikrosatelliten zurückge-
griffen werden. Das hierzu notwendige Verfahren ist
zwar kostenintensiver, dieser Markertyp steht aber
mittlerweile für die meisten Gehölz arten zur Verfü-
gung und bietet noch mehr Informationsmöglichkei-
ten.
Mikrosatelliten (syn. SSR = Simple Sequence Re-
peats) sind kurze, in der Regel nicht kodierende
DNA-Sequenzen, die im Genom eines Organismus
oft wiederholt werden. Oftmals konzentrieren sich
viele Wiederholungen am selben „Locus“ (Ort einer
Sequenz im Genom). Die wiederholte Sequenz in ei-
nem Mikrosatelliten ist sehr einfach. Sie besteht aus
zwei bis vier Nukleotiden und kann 10- bis 100-mal
wiederholt auftreten. Sequenziert man eine Mikro-
satellitensequenz, so erhält man Sequen zen wie zum
Beispiel „AGAGAGAGAGAGAGAGAG...“. Mikrosatelliten
weisen einige Charakteristika auf, die ihnen eine her-
vorragende Eignung als molekulare Marker verlei-
hen. Sie unterlagen im Laufe der Evolution ebenfalls
häufigen Mutationen, die dazu führen, dass solche
repetitiven Elemente (hier im Beispiel: AG) hinzu-
gefügt werden oder auch wieder verschwinden kön-
nen (Insertion/Deletion). Damit gehören nukleare
Mikrosatelliten zu den variabelsten DNA-Sequenzen
überhaupt (Längenpoly morphismen). Sie kommen
in großer Anzahl in allen bisher untersuchten Ge-
nomen höher entwickel ter Lebewesen vor und sind
daher ebenfalls geeignete Marker für die Erstellung
eines „genetischen Fingerabdrucks“, um eine De-
terminierung von Individuen oder Klonen zweifels-
frei zu erreichen. Eine weitere Eigenschaft ist ihre
„Kodominanz“. Dieses Charakteristikum ermöglicht
Vaterschafts- und Mutterschaftstests oder allgemein
Elternschaftsanalysen (Nachkommenschaftsnach-
weise). Ein Eti ket tenschwindel bei Sorten, speziellen
Kreuzungen und besonderen Herkünften kann somit
aufge deckt werden.
Vielfältige Erfahrungen mit Mikrosatelliten gibt es un-
ter anderem bereits bei der geographischen Herkunfts-
identifizierung von forstlichem Vermehrungsgut.
Dieses Verfahren ist bereits an Saatgut der Stieleiche
(Quercus robur L.) in Nordrhein-Westfalen erfolg-
reich getestet worden (DEGEN et al. 2010). Es gibt auch
Erfahrungen mit der Analyse von Wildobstarten und
daraus gezüchteter Sorten (HÖLTKEN 2005; HÖLTKEN &
GREGORIUS 2006; JOLIVET et al. 2011, 2012; REIM et al.
2012). Da die vor gestellten Methoden auch in anderen
Bereichen, wie z. B. in der forensischen Humangene-
tik, schon seit längerem erfolgreich eingesetzt werden,
hat dieses Verfahren auch vor Gericht Bestand.
Für Baumgutachten bieten diese DNA-Methoden jetzt
neue Möglichkeiten der Analyse und Beweis führung.
Das o. g. Fallbeispiel zeigt den Einsatz bei Wurzelein-
wuchs in Leitungssysteme. Außer der genauen Art-
und Sortenbestimmung kann auch ein Pflanzenteil
(hier eine Wurzel) einem be stimm ten Individuum
zugeordnet werden. Es sind somit Methoden, die spe-
ziell bei Versicherungs schäden bzw. Gerichtsverfahren
zum Einsatz kommen können. Ein anderes mögli-
ches Einsatzgebiet ist die Re konstruktion historischer
Parkanlagen zur Identifizierung des ursprünglichen
Baumbestands zur Diffe renzierung von den später
gepflanzten Bäumen. Als weiteres Beispiel sei der
Einsatz bei der Nach zucht von besonderen Bäumen
(Stichwort „Junge Riesen“, KOENIES 2011) genannt.
Immer wenn Zwei fel an der Echtheit eines Baumes,
eines Pflanzenteils oder einer Nachkommenschaft
bestehen oder wenn Teile von Bäumen einander zuge-
ordnet werden müssen (z. B. Wurzeln zu bestimmten
Bäu men), können diese Methoden relativ schnell und
sicher einen Nachweis erbringen.
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Autoren
Dr. Aki Michael Höltken (Dipl.-Forstwirt) ist Ge-
schäftsführer der Firma ,Plant Genetic Diagnostics‘
GmbH und entwickelt DNA-basierte Metho den für den
praktischen Einsatz. Dazu zählen unter anderem ge-
netische Barcoding-Verfahren sowie Rückverfolgbar-
keitssysteme für biologisches Material.
Dr. Aki Michael Höltken
Plant Genetic
Diagnostics GmbH
Alte Landstraße 26
22927 Großhansdorf
Tel. (0 41 02) 2 01 89 18
Mobil (01 739 2 72 60 74
pgd-hoeltken@vodafone.de
Priv. Doz. Dr. Matthias Fladung (Dipl.-Biologe) ist
stellvertretender Leiter des Instituts für Forstgenetik,
Großhansdorf, mit venia legendi im Fach „Bota nik“
an der Universität Hamburg. Seine wissenschaftlichen
Arbeits schwer punkte liegen in der Entwicklung mo-
lekularer Marker, der Genom analyse von Bäumen
und der Biosicherheit von gentechnisch veränderten
Bäumen.
PD Dr. Matthias Fladung
Thünen-Institut
für Forstgenetik
Sieker Landstraße 2
22927 Großhansdorf
Tel. (0 41 02) 69 61 07
matthias.fladung@
ti.bund.de
Dr. Markus Streckenbach (Dipl.-Biologe) leitet das
Sachverständigenbüro für urbane Vegetation in Bo-
chum und ist bundesweit für private und öffentli che
Auftraggeber tätig.
Dr. Markus Streckenbach
Sachverständigenbüro
für urbane Vegetation
Ehrenfeldstraße 25
44789 Bochum
Tel. (02 34) 3 79 83 23
Mobil (01 76) 22 66 65 59
info@streckenbach.org
Prof. Dr. Dirk Dujesiefken ist Leiter des Instituts für
Baumpflege, Hamburg und ist ö.b.v. Sachverständiger
für holzbiologische Baumanalysen, Baumpflege und
-sanierung der Landwirtschaftskammer Schleswig-
Holstein.
Prof. Dr. Dirk Dujesiefken
Institut für Baumpflege
Brookkehre 60
21029 Hamburg
Tel. (0 40) 7 24 13 10
Fax (0 40) 7 21 21 13
info@institut-fuer-
baumpflege.de