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Möglichkeiten DNA-basierter Methoden für Baumgutachten (Potential of DNA-based methods in arboriculture)

Authors:
  • Nordwestdeutsche Forstliche Versuchsanstalt (NW-FVA)
  • Institut für Baumpflege / Institute of Arboriculture

Abstract and Figures

Genetic analysis enables individual identifications of trees and shrubs, the development of methods to trace back plant material in the case of false labelling or investigation of damages caused by roots of trees. This individual genetic “barcodingprocedure” is performed by using the so called M13-fingerprinting method. A further technique is highlighted (microsatellites = SSRs) in order to control the varietal identity of offspring from specific individuals, crosses and breeding programs.
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Jahrbuch der Baumpflege 2013
4 Wissenschaftliche Kurzberichte
252
Möglichkeiten DNA-basierter Methoden
für Baumgutachten
Potential of DNA-based methods in arboriculture
von Aki Michael Höltken, Matthias Fladung, Markus Streckenbach
und Dirk Dujesiefken
Summary
Genetic analysis enables individual identifica-
tions of trees and shrubs, the development of me-
thods to trace back plant material in the case of
false labelling or investigation of damages caused
by tree roots. This individual genetic “barcoding-
procedure” is performed by using the so called
M13-fingerprinting method. A further technique
is highlighted (microsatellites = SSRs) in order to
control the varietal identity of offspring from spe-
cific individuals, crosses and breeding programs.
Zusammenfassung
Genetische Verfahren erlauben die Identifizierung
einzelner Bäume und Sträucher und können zur
Rückverfolgung pflanzlichen Materials bei Fehl-
deklarationen und Etikettenschwindel sowie zur
Ana lyse von Schäden durch Baumwurzeln einge-
setzt werden. Ein solches genetisches „Barcoding-
Verfah ren“ wird anhand der sogenannten
M13-Fingerabdruckmethode vorgestellt. Darüber
hin aus wird die Verwendung von Mikrosatelliten-
DNA-Markern beschrieben, die zur Überprüfung
der Echtheit von Nachkommenschaften einzelner
Individuen oder spezieller Kreuzungen und Züch-
tungen herangezo gen werden können.
1 Einleitung
Die genaue Identifizierung einer Gehölzart bzw. -sorte
stellt oft eine große Herausforderung dar, insbeson-
dere wenn es sich um Jungpflanzen oder nur um
einzelne Pflanzenteile handelt. Brisant wird es, wenn
innerhalb komplizierter Handelsketten eine genaue
Rückverfolgung von pflanzlichem Material erforder-
lich wird (vgl. DEGEN & HÖLTKEN 2011). Gleiches gilt für
die Identifizierung von histo rischen Pflanzen, z. B. in
alten Gartenanlagen.
Ein weiteres Problemfeld stellen durch Wurzeln verur-
sachte Schäden an Rohrleitungen oder Gebäu den dar
(STRECKENBACH et al. 2009; STRECKENBACH 2011). Kost-
spielige Sanierungsmaßnahmen derarti ger Schäden
verlangen nach einer eindeutigen Identifizierung des
„Verursacherbaumes“, damit Haf tungsansprüche gel-
tend gemacht werden können (Abbildung 1). Hierfür
kann eine Wurzelprobe in aller Regel bereits anhand
ihrer anatomischen Merkmale zugeordnet werden
(z. B. CUTLER et al. 1987; SCHWEINGRUBER 1990; KUT-
SCHERA & LICHTENEGGER 2002; STRECKENBACH 2009). Diese
bewährte und effiziente Methode stößt jedoch dann
an ihre Grenzen, wenn mehrere Exemplare einer Art
im Be reich der Schadensstelle, unter Umständen noch
auf verschiedenen Grundstücken, vorkommen. Oft
lassen sich auch botanisch nahe verwandte Arten und
Gattungen, wie zum Beispiel Pappeln (Populus spp.)
und Weiden (Salix spp.), anhand der Wurzelstruktur
nicht sicher unterscheiden (TROCKEN BRODT et al. 2001).
Eine anatomische Untersuchung von Pflanzentei-
len ist ebenfalls nicht zielführend, wenn die Gewebe
durch einen intensiven und langanhaltenden Kontakt
mit zersetzenden Agenzien, wie beispielsweise Abwäs-
sern, nur noch unvollständig erhalten sind. Kommen
mehrere Faktoren zusammen, kann sich die Aussage-
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DNA-basierte Methoden für Baumgutachten
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kraft des Materials soweit verringern, dass eine präzise
Zuordnung der Probe zu einem Gehölz nicht möglich
ist. Diese ungewöhnliche Kombination soll an folgen-
dem realen Beispiel veran schaulicht werden: Einem
Hausbesitzer entstanden durch Wurzeleinwüchse in
die Anschlussleitung seines Hauses wie derkehrend be-
trächtliche Kosten. Die in der Kanalisation wachsen-
den Wurzeln reduzierten den Lei tungsquerschnitt, so
dass sich zunächst der Abfluss der Abwässer verlang-
samte, bevor es schluss endlich zu einem Rückstau
von Fäkalien in das Gebäude kam. Die finanziellen
Aufwendungen umfass ten somit nicht nur jene zur
Instandsetzung der Hausanschlussleitung, sondern
auch die zur Sanie rung der umfangreichen Schäden
am Gebäude. Die Klärung der Frage nach der Scha-
den verursachen den Baumart sollte anhand einer aus
der Leitung geborgenen Wurzelprobe erfolgen. Von
den dort in Frage kommenden Arten waren zwei en-
ger miteinander verwandt (Spitz-Ahorn und Eschen-
Ahorn) mit ähnlichen anatomischen Merkmalen.
Insbesondere bei geringen Probenmengen und einer
unzu reichenden Qualität wird die Untersuchung
mehrerer Wurzelproben notwendig, so dass sich erst
aus mehreren Teilen ein komplettes Bild ergibt.
Bei der hier geschilderten Begutachtung ergaben meh-
rere Umstände – eine geringe und schlecht er haltene
Probemenge in einem jungen Entwicklungsstadium
zur Identifizierung einer von zwei nah miteinander
verwandten Baumarten –, dass eine endgültige Fest-
stellung der Artzugehörigkeit auf der Grundlage einer
anatomischen Untersuchung unmöglich war (Abbil-
dung 2). Die entnommene Wur zelprobe hätte in die-
sem Fall direkt einer genetischen Analyse zur exakten
Zuordnung unterzogen werden können.
Diese Arbeit soll zeigen, dass mehrere genetische Ver-
fahren zur Verfügung stehen und diese auch an na-
hezu beliebigen Pflanzenteilen durchgeführt werden
können. Um die Möglichkeiten von Art- und Sortener-
kennung als auch individueller Identifizierung zu tes-
ten, wurden für die Studie Laub- und Na delholzarten
mit unterschiedlichen taxonomischen Verwandt-
schaftsgraden ausgewählt. Außerdem soll auf das o. g.
Beispiel der beiden Ahornarten näher eingegangen
werden.
Abbildung 1: Durchwurzelter Abzweig einer
Mischwasserleitung. Das Einwachsen von
Wurzeln in Leitungssys teme kann zu einem
vollständigen Funktionsverlust des betreffenden
Abschnittes führen und einen Rückstau von
Abwässern in die angeschlossenen Gebäude
nach sich ziehen
Abbildung 2: Wurzelquerschnitte zur Verdeutlichung der Ähnlichkeit gattungsspezifi scher Charakte-
ristika. Links: Referenzprobe von Acer negundo L. (Eschen-Ahorn), mitte: vorgelegte Probe aus dem
Leitungsabschnitt, rechts: Referenzprobe von Acer platanoides L. (Spitz-Ahorn)
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2 Material und Methoden
2.1 Pflanzenmaterial
Um die Möglichkeiten der genetischen Verfahren für
die individuelle Genotypisierung zu testen, wur den
mehrere Individuen einer Art, einer Gattung oder
einer Familie untersucht. Die in dieser Studie unter-
suchten Baumarten umfassen unter anderem auch
einheimische Gehölze, welche im Straßen raum und
im Stadtbild häufig angetroffen werden. In Bezug auf
das einleitend genannte Beispiel haben wir auch die
nah verwandten Arten Acer platanoides L. (Spitz-
Ahorn) sowie Acer negundo L. (Eschen-Ahorn) mit in
die DNA-Analyse aufgenommen.
2.2 DNA-Extraktion
Die DNA wurde ausschließlich nach dem Protokoll
von DUMOLIN et al. (1995) extrahiert. Der Puffer zur
Auflösung der Zellwand- und Zellmembranbestand-
teile enthielt ATMAB (Alkyltrimethylammonium-
bromid)-PVP und zur Fällung von Verunreinigungen
diente Dichlormethan. Das Waschen der DNA er-
folgte in 70 %igem Ethanol. Isolierte DNA wurde bis
zur Analysedurchführung bei –20 °C in TE-Puffer
(10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) gelagert. Die
Endkonzentration der DNA-Lösungen für die weitere
Analytik wurde auf 10 ng/µl eingestellt. Letzteres er-
folgte in HPLC-Wasser.
2.3 Die M13-Fingerprint-Methode
Während der Evolution unterlagen die Genome von
Pflanzen und Tieren einer ständigen Weiterent-
wicklung. Zusätzlich hat auch das Einschleusen frem-
der DNA-Bestandteile, wie beispielsweise DNA-Sequen-
zen des Bakteriophagen M13, zu Veränderungen des
Erbgutes beigetragen. Diese in vielfa cher Ausfertigung
vorliegenden und deshalb auch als „Satelliten-DNA“
bezeichneten DNA-Sequenzen sind im Laufe von Ge-
nerationen innerhalb der Individuen ebenfalls evol-
viert und unterlagen somit ihrerseits Verän derungen,
die sie und damit einzelne Individuen voneinander
unterscheidbar machen (ROGSTAD et al. 1988, 1991).
In dieser Studie haben wir diese hochvariablen DNA-
Fragmente mit Hilfe einer PCR-Reaktion unter Ver-
wendung sogenannter universeller Primer in vitro
vermehrt. Die auf diese Weise vervielfältigten DNA-
Fragmente wurden anschließend in einer Agarose-
Gelelektrophorese aufgetrennt (Abbildung 3) und
mit dem Fluoreszenz-Farbstoff Rotisafe (Firma Roth)
markiert. Danach wurden die erzeugten Bandenmus-
ter unter UV-Licht ausgewertet.
3 Ergebnisse und Diskussion
Die M13-Fingerabdruck-Methode bietet eine zuverläs-
sige Möglichkeit zur genetischen Charakteri sierung
von verschiedenen Individuen der gleichen Art (sie-
Abbildung 3: Beladen eines Agarosegels mit in vitro-(= PCR-)vermehrten DNA-Fragmenten (Farb-
stoff Orange G) sowie mit einem Standard zur Schätzung der Fragmentlängen (Mischung
aus künstlichen DNA-Fragmenten bekannter Länge, blauer Farbstoff)
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he Abbildung 4). Dies steht im Einklang mit Un-
tersuchungen von FLADUNG & ZIEGENHAGEN (1998), die
mit Hilfe dieser Methode verschiedene Indi viduen der
Hainbuche (Carpinus betulus), der Stieleiche (Quer-
cus robur) und der Fichte (Picea abies) zuzüglich
ihrer im gärtnerischen Bereich verwendeten Mutanten
unterscheiden konnten (z. B. Eichen blättrige Hainbu-
che, Weißblattrandige Stieleiche und Zuckerhutfichte).
Besonders interessant sind die Bandenmuster ver-
schiedener Individuen des Feldahorns (Acer cam pes-
tre) in den Bandenreihen 1a bis 1 f von Abbildung 4.
Die einzelnen Individuen unterscheiden sich alle in
ihren Bandenmustern. Ebenfalls gelingt eine sehr kla-
re Abgrenzung zwischen verschiedenen Arten inner-
halb einer Gattung oder einer Familie. So erhalten die
verschiedenen Ahornarten alle ihre eigenen Banden-
muster. Die eingangs erwähnten Arten Acer negundo
L. (Eschen-Ahorn) und Acer pla tanoides L. (Spitz-
Ahorn), welche im oben genannten Beispiel Probleme
in Abwasserleitungen verur sacht haben, können mit
dieser Methode eindeutig identifiziert werden. Auch
die beiden Weidenar ten Salix caprea und S. fragilis,
die Schneeballarten Viburnum opulus und V. lan-
Abbildung 4: Bandenmuster nach in vitro-Vermehrung (PCR) der M13-Bakteriophagensequenz an
34 verschie denen Baum- und Straucharten; S = Längenstandard beginnend bei 200 Basenpaaren
zur Ermittlung der ampli fizierten Fragmentlängen; Pfeilrichtung = Laufrichtung der DNA-Fragmen-
te im Gel nach Anlegen eines elektri schen Feldes
1a Acer campestre (1)
1b Acer campestre (2)
1c Acer campestre (3)
1d Acer campestre (4)
1e Acer campestre (5)
1f Acer campestre (6)
2 Acer carpinifolium
3 Acer negundo
4 Acer platanoides
5 Acer pseudoplatanus
6 Aesculus hippocastanum
7 Aesculus × carnea
8 Alnus glutinosa
9 Betula pendula
10 Salix caprea
11 Salix fragilis
12 Viburnum opulus
13 Viburnum lantana
14 Juglans nigra
15 Juglans cordiformis
16 Carya glabra
17 Clematis vitalba
18 Platanus orientalis
19 Picea abies (1)
20 Picea abies (2)
21 Picea abies (3)
22 Picea abies (4)
23 Picea sitchensis
24 Abies amabilis
25 Abies balsamea
26 Abies homolepis
27 Abies lasiocarpa
28 Cephalotaxus harrigtonia
29 Chamaecyparis lawsoniana
30 Chamaecyparis obtusa
31 Larix gmelinii
32 Metasequoja glyptostroboides
33 Pinus koraiensis
34 Pinus mugo
35 Pinus parviflora
36 Pinus peuce
37 Sequoja sempervirens
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tana sowie die drei Arten aus der Familie der Wal-
nussgewächse (Juglans nigra, J. cordiformis, Carya
glabra (Juglanda ceae) sind klar zu unterscheiden.
Ähnlich dem M13-Fragment werden auch durch an-
dere molekulare Marker Bandenmuster erzeugt, wie
z. B. den RAPDs (Random Amplified Polymorphic
DNA), wobei die Stabilität der Analyseergebnisse je-
doch sehr unzureichend ist, so dass gerichtsfeste
Gutachten so kaum erzeugt werden können. Dieses
Problem besteht bei der M13-Methode nicht. Dieser
Sachverhalt wurde durch die Verwen dung unter-
schiedlicher PCR-Reaktionsansätze überprüft (vgl.
FLADUNG & ZIEGENHAGEN 1998).
Mit der M13-Methode steht ein ökonomisches Verfah-
ren für die Rückverfolgbarkeit von pflanzlichem Ma-
terial bereit. In Zweifelsfällen und zur Beantwortung
einer Vielzahl weiterer Fragestellungen kann darüber
hinaus auf die Analyse von Mikrosatelliten zurückge-
griffen werden. Das hierzu notwendige Verfahren ist
zwar kostenintensiver, dieser Markertyp steht aber
mittlerweile für die meisten Gehölz arten zur Verfü-
gung und bietet noch mehr Informationsmöglichkei-
ten.
Mikrosatelliten (syn. SSR = Simple Sequence Re-
peats) sind kurze, in der Regel nicht kodierende
DNA-Sequenzen, die im Genom eines Organismus
oft wiederholt werden. Oftmals konzentrieren sich
viele Wiederholungen am selben „Locus“ (Ort einer
Sequenz im Genom). Die wiederholte Sequenz in ei-
nem Mikrosatelliten ist sehr einfach. Sie besteht aus
zwei bis vier Nukleotiden und kann 10- bis 100-mal
wiederholt auftreten. Sequenziert man eine Mikro-
satellitensequenz, so erhält man Sequen zen wie zum
Beispiel „AGAGAGAGAGAGAGAGAG...“. Mikrosatelliten
weisen einige Charakteristika auf, die ihnen eine her-
vorragende Eignung als molekulare Marker verlei-
hen. Sie unterlagen im Laufe der Evolution ebenfalls
häufigen Mutationen, die dazu führen, dass solche
repetitiven Elemente (hier im Beispiel: AG) hinzu-
gefügt werden oder auch wieder verschwinden kön-
nen (Insertion/Deletion). Damit gehören nukleare
Mikrosatelliten zu den variabelsten DNA-Sequenzen
überhaupt (Längenpoly morphismen). Sie kommen
in großer Anzahl in allen bisher untersuchten Ge-
nomen höher entwickel ter Lebewesen vor und sind
daher ebenfalls geeignete Marker für die Erstellung
eines „genetischen Fingerabdrucks“, um eine De-
terminierung von Individuen oder Klonen zweifels-
frei zu erreichen. Eine weitere Eigenschaft ist ihre
„Kodominanz“. Dieses Charakteristikum ermöglicht
Vaterschafts- und Mutterschaftstests oder allgemein
Elternschaftsanalysen (Nachkommenschaftsnach-
weise). Ein Eti ket tenschwindel bei Sorten, speziellen
Kreuzungen und besonderen Herkünften kann somit
aufge deckt werden.
Vielfältige Erfahrungen mit Mikrosatelliten gibt es un-
ter anderem bereits bei der geographischen Herkunfts-
identifizierung von forstlichem Vermehrungsgut.
Dieses Verfahren ist bereits an Saatgut der Stieleiche
(Quercus robur L.) in Nordrhein-Westfalen erfolg-
reich getestet worden (DEGEN et al. 2010). Es gibt auch
Erfahrungen mit der Analyse von Wildobstarten und
daraus gezüchteter Sorten (HÖLTKEN 2005; HÖLTKEN &
GREGORIUS 2006; JOLIVET et al. 2011, 2012; REIM et al.
2012). Da die vor gestellten Methoden auch in anderen
Bereichen, wie z. B. in der forensischen Humangene-
tik, schon seit längerem erfolgreich eingesetzt werden,
hat dieses Verfahren auch vor Gericht Bestand.
Für Baumgutachten bieten diese DNA-Methoden jetzt
neue Möglichkeiten der Analyse und Beweis führung.
Das o. g. Fallbeispiel zeigt den Einsatz bei Wurzelein-
wuchs in Leitungssysteme. Außer der genauen Art-
und Sortenbestimmung kann auch ein Pflanzenteil
(hier eine Wurzel) einem be stimm ten Individuum
zugeordnet werden. Es sind somit Methoden, die spe-
ziell bei Versicherungs schäden bzw. Gerichtsverfahren
zum Einsatz kommen können. Ein anderes mögli-
ches Einsatzgebiet ist die Re konstruktion historischer
Parkanlagen zur Identifizierung des ursprünglichen
Baumbestands zur Diffe renzierung von den später
gepflanzten umen. Als weiteres Beispiel sei der
Einsatz bei der Nach zucht von besonderen Bäumen
(Stichwort „Junge Riesen“, KOENIES 2011) genannt.
Immer wenn Zwei fel an der Echtheit eines Baumes,
eines Pflanzenteils oder einer Nachkommenschaft
bestehen oder wenn Teile von Bäumen einander zuge-
ordnet werden müssen (z. B. Wurzeln zu bestimmten
Bäu men), können diese Methoden relativ schnell und
sicher einen Nachweis erbringen.
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DNA-basierte Methoden für Baumgutachten
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Autoren
Dr. Aki Michael Höltken (Dipl.-Forstwirt) ist Ge-
schäftsführer der Firma ,Plant Genetic Diagnostics‘
GmbH und entwickelt DNA-basierte Metho den für den
praktischen Einsatz. Dazu zählen unter anderem ge-
netische Barcoding-Verfahren sowie Rückverfolgbar-
keitssysteme für biologisches Material.
Dr. Aki Michael Höltken
Plant Genetic
Diagnostics GmbH
Alte Landstraße 26
22927 Großhansdorf
Tel. (0 41 02) 2 01 89 18
Mobil (01 739 2 72 60 74
pgd-hoeltken@vodafone.de
Priv. Doz. Dr. Matthias Fladung (Dipl.-Biologe) ist
stellvertretender Leiter des Instituts für Forstgenetik,
Großhansdorf, mit venia legendi im Fach „Bota nik“
an der Universität Hamburg. Seine wissenschaftlichen
Arbeits schwer punkte liegen in der Entwicklung mo-
lekularer Marker, der Genom analyse von Bäumen
und der Biosicherheit von gentechnisch veränderten
Bäumen.
PD Dr. Matthias Fladung
Thünen-Institut
für Forstgenetik
Sieker Landstraße 2
22927 Großhansdorf
Tel. (0 41 02) 69 61 07
matthias.fladung@
ti.bund.de
Dr. Markus Streckenbach (Dipl.-Biologe) leitet das
Sachverständigenbüro für urbane Vegetation in Bo-
chum und ist bundesweit für private und öffentli che
Auftraggeber tätig.
Dr. Markus Streckenbach
Sachverständigenbüro
für urbane Vegetation
Ehrenfeldstraße 25
44789 Bochum
Tel. (02 34) 3 79 83 23
Mobil (01 76) 22 66 65 59
info@streckenbach.org
Prof. Dr. Dirk Dujesiefken ist Leiter des Instituts für
Baumpflege, Hamburg und ist ö.b.v. Sachverständiger
für holzbiologische Baumanalysen, Baumpflege und
-sanierung der Landwirtschaftskammer Schleswig-
Holstein.
Prof. Dr. Dirk Dujesiefken
Institut für Baumpflege
Brookkehre 60
21029 Hamburg
Tel. (0 40) 7 24 13 10
Fax (0 40) 7 21 21 13
info@institut-fuer-
baumpflege.de
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Article
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Der Beitrag zeigt auf, dass es möglich ist, Baumwurzeln anhand der Strukturmerkmale von Holz und Rinde bis zur Gattung sicher zu bestimmen.
Article
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In the present study genetic diversity and hybridization with cultivars were investigated in a population of the endangered European wild apple species Malus sylvestris (L.) Mill. with the aim to establish a basis for the implementation of conservation activities and to ensure its long-term preservation. A total of 284 putative M. sylvestris trees located in the East Ore Mountains were investigated along with a standard set of reference apple genotypes proposed by the European Cooperative Program for Plant Genetic Resources (ECPGR) and 13 old apple cultivars often cultivated in Saxony. The genetic analysis was performed using 12 microsatellite markers also recommend by the ECPGR. To differentiate 'true type' M. sylvestris individuals, hybrids and apple cultivars (Malus x domestica Borkh.) a model-based cluster analysis was performed using STRUCTURE. Two clusters were identified consisting of M. sylvestris and M. x domestica genotypes. About 40 % of the putative M. sylvestris showed an admixture of the species-specific allele frequencies and were defined as hybrids. The genetic diversity of the 'true type' M. sylvestris population was still high but slightly lower than in the apple cultivars especially since some SSR loci were fixed on one or few alleles in the M. sylvestris population. The differentiation parameters between 'true type' wild apple and cultivars indicated a clear discrimination between the wild and cultivated apple individuals. This fact confirms our expectation of the existence of 'true type' M. sylvestris individuals in the East Ore Mountains and argues for the realization of preservation measures in this area.
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The restriction patterns of two chloroplast fragments and one mitochondrial DNA fragment, amplified by PCR with universal primers, were studied to determine the mode of inheritance of these organelles in 143 progeny of five intraspecific crosses in pedunculate oak (Quercus robur L.). The results indicate that both genomes are maternally inherited, an observation which agrees with the commonly observed pattern of inheritance in angiosperms. They confirm that both chloroplast DNA and mitochondrial DNA can be used as a source of seed-specific markers for the study of the geographic structure of oaks. This is the first report of organelle inheritance within the Fagaceae, an important and widespread tree family.
Article
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Well-adapted, high quality reproductive material is key to the success of forest plantations. Consequently in many countries the collection and trade of forest reproductive material is regulated. Paper documents are usu-ally the only evidence for the origin of forest reproductive material. Certification schemes already established in Germany use genetic inventories to compare reference samples collected at different steps of the chain-ofcustody. A new approach using DNA-fingerprints efficiently controls the origin of seed sources without these multiple reference samples. Only a sample of adult trees within the seed stands is needed. The control is directly made for each suspicious plant or a group of suspicious plants by use of multilocus genotype assignment. We made a field test with samples of adults and seedling from 5 registered seed stands of Quercus robur in Western Germany. Eight highly variable nuclear microsatellites were used to genotype each individual. We found in total 255 different alleles at all loci in the adult populations. The observed levels of genetic variation (A e= 9.18), genetic differentiation (delta = 0.187) and population fixation (F ST = 0.01) were slightly higher than results of similar studies. Individual and group assignment tests were performed with the Bayesian multi-locus approach. The proportion of correctly assigned seedlings was 65% for individuals with completely scored genotypes. In all 5 cases the groups of seedlings were assigned to the correct seed stand and an additional sample of seedlings from another stand could be successfully excluded with a probability test. The conclusion of the field study is that a large scale application of this new approach to control of the origin of forest reproductive material is feasible.
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Although pollen dispersal has been extensively studied in trees, parameters influencing between-population variation are still poorly understood. In this study, we conducted paternity analyses on open-pollinated seeds in four natural populations of wild cherry (Prunus avium) with contrasting density and clonal propagation, using eight microsatellite loci and one self-incompatibility system locus. We also measured four quantitative traits and spatial positions as potential correlates of reproductive success. Levels of polyandry differed among populations and 30% of the seed families exhibited unequal paternal contributions, suggesting variation in reproductive success rather than variation in mate availability. Mating occurred preferentially among neighbours in all populations, suggesting that it is a common pattern in wild cherry and probably results from pollinator behaviour. Paternal success was positively correlated with diameter at breast height, as indicated in previous studies and tree dominance only resulted in higher paternal success in low density plots. Mating patterns were thus also affected by both density and tree size. Large-scale studies are needed to disentangle relative influences of these factors on the mating system and pollination success.
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 This paper reports on a PCR-RFLP analysis in a chloroplast DNA region consisting of coding and intergenic spacer sequences of trnS and the adjacent psbC gene. This region was PCR-amplified in 62 woody plant species, predominantly tree species, that represent a broad systematic range in both gymnosperms and dicotyledonous angiosperms. The amplification products were digested by the restriction endonuclease HaeIII (GG↓CC). Fourteen different restriction patterns occurred, 5 of which characterised representatives of the gymnosperms, and 9 angiosperm representatives. A single restriction site polymorphism revealed most of the species to share restriction patterns. Groups formed which showed relationships to plant systematic units. This phenomenon is discussed with regard to the psbC gene and the GGCC motif for tracing species’ relationships on a high taxonomic level of gymnosperms and angiosperms.
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A recently developed class of DNA endonuclease fragment probes (variously termed minisatellite, DNA fingerprinting, or variable number tandem repeat loci probes) has detected extensive intraspecific genetic variation in tetrapods. Here we use one probe from this class, the M 13 repeat probe (shown previously to yield DNA fingerprints in humans) to examine genetic diversity in the quaking aspen. Comparisons of endonuclease fragment profiles of individuals separated by at least 6km reveals that diversification of alleles in this species has occurred to such an extent that the likelihood of two randomly chosen individuals having indistinguishableHaeIII fragment profiles is c. 3.17 10–4. Based on this finding, members of interdigitating clones can be assigned to one or another clone with high statistical confidence. Interdigitating, morphologically cryptic clones were also identifiable. These results demonstrate that some minisatellite probes can be applied to very distant taxa to obtain useful information about genetic variation.
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Conservation of forest genetic resources requires intensive knowledge of the spatial arrangement of genetic diversity. In this study, we used four natural Prunus avium stands in Germany with contrasting for densities to understand patterns of spatial genetic structure. To this end, we genotyped adults and saplings at eight microsatellite markers, 54 AFLP loci and at the gametophytic incompatibility locus. We estimated levels of clonal propagation, spatial genetic structure and gene dispersal. High mortality occurred among young clonal individuals, as depicted by the lower clonal diversity in saplings. Contrasting levels of spatial genetic structure were observed among markers, ontogenic stages and populations. AFLP were more efficient for detecting spatial autocorrelation but did not allow us to differentiate low and high density populations, while high density populations showed substantially stronger spatial genetic structure at microsatellite loci. Furthermore, kinship decreased with tree age only in low density stands. We discuss the present results in terms of population history, pollen and seed dispersal and population density. Although conspecific density seems to be an interesting indicator of genetic diversity for conservation programmes, we still need to disentangle the relative influence of clonal propagation and density on the strength of spatial genetic structure. Simulation studies are needed to further address this question. KeywordsSpatial genetic structure–Microsatellite–AFLP–Gametophytic incompatibility system–Density–Clonal propagation
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 Solitary revertants which have been observed on single mutant tree individuals have up to now been believed to be grow-through cells belonging to the rootstock on which they are commonly grafted. In this study three different phenotypically visible mutants revealing revertant shoots on the same tree were chosen for genetic analysis. The mutant Quercus robur L. ‘argenteomarginata’ was grafted on a normal rootstock, an individual of Carpinus betulus L. var. quercifolia Desf. as well as an individual of Picea glauca (Moench) Voss. ‘conica’ are supposed to have grown from seeds. By means of a highly specific M13 PCR fingerprinting technique the mutant and revertant tissues were analysed in comparison to different individuals of each of the species. With the grafted mutant, cambium tissue of the rootstock was also investigated. Whereas conspecific individuals could be clearly distinguished from each other, mutant and revertant tissues revealed the same banding patterns for each of the three trees. In case of the grafted mutant, the fingerprint obtained from cambium tissue of the rootstock was clearly different from the pattern of mutant and revertant tissue. Results demonstrate the potential of the tool for genetic differentiation between individuals of three tree species hence in the case of the grafted mutant, the hypothesis that the observed reversion is caused by a grow-through of the rootstock is rejected. Furthermore, identical fingerprints of mutant and revertant tissue support identical genetic background of the tissues excluding the gene(s) responsible of the mutation. Possible causes of mutations and reversions regarding the three mutant trees are discussed.