Biologia reprodutiva de serpentes: recomendações para a coleta e análise de dados

Abstract

A biologia reprodutiva de serpentes compreende diversos tópicos como modos reprodutivos, ciclos reprodutivos, fecundidade (tamanho da ninhada, tamanho dos filhotes, massa relativa da ninhada e frequência reprodutiva), idade e tamanho na maturidade, dimorfismo sexual, sistemas de acasalamento e comportamentos reprodutivos como corte e cuidado parental. Assim, estudos sobre reprodução são essenciais para a compreensão da biologia de qualquer es-pécie. Além disso, dados sobre a biologia reprodutiva são importantes para a definição de estratégias de conservação para espécies ameaçadas de extinção. Apesar disso, serpentes da região neotropical eram até pouco tempo relativamente pouco estudadas com relação à reprodução. No entanto, esse cenário mudou consideravelmente ao longo das duas últimas décadas. Diversos estudos, principalmente no Brasil, têm produzido uma quantidade substancial de informação, aumentando assim significativamente nosso conhecimento sobre a reprodução de serpentes neotropicais. Todo esse volume de dados tem permitido a elaboração e teste de hipóteses sobre padrões reprodutivos. No entanto, algumas revisões e evidências recentes têm levantado algumas questões importantes em reprodução de serpentes. Nosso objetivo nesse artigo é chamar atenção para tais questões, discutindo a necessidade de se avaliar mais criticamente a forma como os dados são coletados, examinados e interpretados, bem como apresentar recomendações sobre o tema com o intuito de contribuir para a melhoria da qualidade dos trabalhos produzidos. Dessa forma, os seguintes tópicos são discutidos: anatomia do trato reprodutor, ciclos reprodutivos, fecundidade (tamanho da ninhada, massa relativa da ninhada e produção de múltiplas ninhadas) e dimorfismo sexual, que são os mais comumente abordados em estudos de reprodução.

Full text

Biologia reprodutiva de serpentes: recomendações
para a coleta e análise de dados
Selma M. Almeida-Santos1,4,5, Henrique B. Braz1,4, Lívia C. Santos1,4, Letícia R. Sueiro1,4,
Verônica A. Barros1,2,4, Claudio A. Rojas3,4, Karina N. Kasperoviczus1,4
1 Laboratório de Ecologia e Evolução, Instituto Butantan – Avenida Vital Brazil, 1.500, Butantã, CEP 05503900, São Paulo, SP, Brasil.
2 Universidade Estadual Paulista (UNESP) – Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal – Rua Cristóvão Colombo, 2.265, Jardim Nazareth,
CEP15054000, São José do Rio Preto, SP, Brasil.
3 Departamento de Neurologia Experimental, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). Rua Pedro de Toledo, 669 – Edifício de Pesquisa II (1º e 2º andares),
Vila Mariana, CEP04039032, São Paulo, SP, Brasil.
4 Grupo de Estudos em Reprodução de Squamata (www.reproducaosquamata.com.br).
5 Autor para correspondência: selma.santos@butantan.gov.br
INTRODUÇÃO
A biologia reprodutiva de serpentes compreende diversos
tópicos como modos reprodutivos, ciclos reprodutivos, fecun-
didade (tamanho da ninhada, tamanho dos filhotes, massa
relativa da ninhada e frequência reprodutiva; sensu Seigel e
Ford, 1987), idade e tamanho na maturidade, dimorfismo se-
xual, sistemas de acasalamento e comportamentos reproduti-
vos como corte e cuidado parental (Seigel e Ford, 1987; Shine,
2003; Shine e Bonnet, 2009). Assim, estudos sobre reprodução
são essenciais para a compreensão da biologia de qualquer es-
pécie. Além disso, dados sobre a biologia reprodutiva são im-
portantes para a definição de estratégias de conservação para
espécies ameaçadas de extinção (Shine e Bonnet, 2009). Apesar
disso, serpentes da região neotropical eram até pouco tempo
relativamente pouco estudadas com relação à reprodução (Sei-
gel e Ford, 1987). No entanto, esse cenário mudou considera-
velmente ao longo das duas últimas décadas. Diversos estudos,
principalmente no Brasil, têm produzido uma quantidade subs-
tancial de informação, aumentando assim significativamente
nosso conhecimento sobre a reprodução de serpentes neotro-
picais (e.g., Marques, 1996; Marques e Puorto, 1998; Aguiar e
Di-Bernardo, 2005; Almeida-Santos et al., 2004, 2006; Pinto e
Fernandes, 2004; Alves etal., 2005; Balestrin e Di-Bernardo,
2005; Pizzatto, 2005; Ávila etal., 2006, 2010; Marques e Mu-
riel, 2007; Maschio etal., 2007; López e Giraudo, 2008; Pizzat-
to etal., 2008; Leite etal., 2009; López etal., 2009; Pinto etal.,
2010; Zanella e Cechin, 2010; Oliveira etal., 2011; Mesquita
etal., 2011, 2013; Alencar etal., 2012; Gomes e Marques, 2012;
Bellini et al., 2013; Marques et al., 2013; Panzera e Maneyro,
2013; Siqueira etal., 2013; Sousa etal., 2014). Todo esse volu-
me de dados tem permitido a elaboração e teste de hipóteses
sobre padrões reprodutivos (e.g., Almeida-Santos e Salomão,
2002; Barros et al., 2012).
No entanto, algumas revisões e evidências recentes (Ma-
thies, 2011; Barros et al., 2012, 2014; Mesquita etal., 2013; Ro-
jas etal., 2013; Braz etal., 2014) têm levantado algumas ques-
tões importantes em reprodução de serpentes. Nosso objetivo
nesse artigo é chamar atenção para tais questões, discutindo a
necessidade de se avaliar mais criticamente a forma como os
dados são coletados, examinados e interpretados, bem como
apresentar recomendações sobre o tema com o intuito de con-
tribuir para a melhoria da qualidade dos trabalhos produzidos.
Dessa forma, os seguintes tópicos são discutidos: anatomia do
trato reprodutor, ciclos reprodutivos, fecundidade (tamanho
da ninhada, massa relativa da ninhada e produção de múltiplas
ninhadas) e dimorfismo sexual, que são os mais comumente
abordados em estudos de reprodução.
ANATOMIA MACROSCÓPICA
A ampla maioria dos estudos de reprodução de serpentes
feitos no Brasil resulta da dissecção e exame do trato reprodu-
tor de espécimes preservados em coleções científicas. Assim, a
correta identificação e caracterização macroscópica das estru-
turas anatômicas do trato reprodutivo é imprescindível para
uma coleta de dados passível de gerar dados confiáveis. Quan-
do não há familiaridade com a anatomia, pode haver erros de
identificação entre diferentes estruturas anatômicas.
O sistema reprodutivo de fêmeas de serpentes é composto
por dois ovários alongados, dispostos assimetricamente, e um
par de ovidutos situados lateralmente aos ovários. Em algumas
espécies de serpentes basais, o oviduto esquerdo é reduzido ou
ausente (Aldridge, 1992; Blackburn, 1998). Os ovidutos apre-
sentam regiões macroscopicamente e histologicamente distin-
tas. Há algumas propostas de nomenclatura para estas regiões
(Girling, 2002; Siegel et al., 2011) e neste trabalho seguiremos
a proposta de Siegel et al. (2011), que propõem a divisão do
oviduto em infundíbulo anterior, infundíbulo posterior, útero
glandular e útero aglandular. Sem conhecimento prévio, alças
intestinais e lobos dos rins podem, por exemplo, ser confun-
didos com folículos ovarianos em desenvolvimento (Fig. 1),
especialmente em espécimes mal preservados ou fixados há
muito tempo, que podem apresentar estruturas anatômicas
com deformidades.
O sistema reprodutor de machos de serpentes compre-
ende um par de testículos quase sempre alongados e cilíndri-
cos, dispostos assimetricamente (Gribbins e Rheubert, 2011;
Fig. 2). Ao deixar os testículos, os espermatozoides passam
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pelos ductos da bainha epididimal (rete testis, dúctulos efe-
rentes e ductos epididimários) (Sever, 2010; Trauth e Sever,
2011), chegando então ao ducto deferente (Fig.2), um túbulo
visível macroscopicamente que se estende em direção caudal
até se abrir na cloaca (Volsøe, 1944; Trauth e Sever, 2011). É
importante notar que em alguns trabalhos há uma confusão na
nomenclatura, com o ducto deferente sendo nomeado equivo-
cadamente como ducto eferente (Shine, 1978a, 1980a; 1988a;
Shine e Covacevich, 1983; Marques, 1996; Shine et al., 1996;
Marques e Puorto, 1998; Keogh etal., 2000; Hartmann etal.,
2002; Cottone e Bauer, 2009; Ávila etal., 2010; Zanella e Ce-
chin, 2010; Ahmadzadeh etal., 2011).
CICLOS REPRODUTIVOS
O ciclo reprodutivo de machos e fêmeas de serpentes abran-
ge diversos eventos como gametogênese, crescimento folicular,
acasalamento, estocagem de esperma, ovulação, gravidez/ges-
tação e época de nascimento dos filhotes. Todos esses eventos
devem ser considerados para um completo entendimento do
ciclo de qualquer espécie.
Fêmeas
Os folículos ovarianos observáveis a olho nu são categoriza-
dos em dois estágios: folículos em vitelogênese primária e folí-
culos em vitelogênese secundária (Aldridge, 1979). Os folículos
Figura1: Fêmea de Bothrops sp. apresentando folículos em vitelogênese secun-
dária. Foto: Otavio A. V. Marques.
Figura2: Macho de Xenodon sp. ilustrando todo o trato urogenital (A). Em detalhe observa-se os testículos (B) e ductos deferentes enovelados (C). Barra de escala =
1 cm. Foto: Henrique B. Braz.
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primários, de crescimento lento, contêm grandes quantidades
de proteínas e lipídios e pequena quantidade de cálcio. Quando
o oócito inicia sua fase de acúmulo de vitelo (i.e., vitelogênese
secundária), ocorre o acréscimo de cálcio, lipídios, proteínas
e fosfoproteínas (Aldridge, 1979). Dessa forma, o início da
fase de vitelogênese secundária pode ser averiguado por meio
de análises histológicas e histoquímicas (e.g., Kasperoviczus,
2009; Santos, 2009).
Devido ao crescimento pronunciado na fase de vitelogênese
secundária, o comprimento aproximado dos folículos no início
do depósito secundário de vitelo também pode ser estimado
por meio de um gráfico de dispersão. Dados do comprimento
do maior folículo encontrado em cada fêmea dissecada são plo-
tados em um gráfico no qual o eixo Y representa os compri-
mentos foliculares e o eixo X as datas de morte dos exemplares
amostrados. A distribuição obtida normalmente mostrará uma
concentração de pontos na parte inferior do gráfico, composta
essencialmente por folículos primários, e pontos mais disper-
sos a partir de uma certa faixa de comprimento, indicando folí-
culos com maior taxa de crescimento, os folículos secundários.
A análise desse gráfico permite distinguir entre folículos pri-
mários e secundários além de identificar o comprimento folicu-
lar e a época em que a vitelogênese secundária tem início, bem
como sua extensão. Porém, é relativamente comum encontrar
na literatura a determinação do estágio vitelogênico de um fo-
lículo baseada em medidas pré-estabelecidas para outras espé-
cies, como acima de 5 ou 10mm (e.g., Marques, 1996; Aguiar e
Di-Bernardo, 2005; Pizzatto, 2005; Maschio etal., 2007; Mes-
quita etal., 2011; Alencar etal., 2012; Bellini etal., 2013), o que
pode incorrer em erros na avaliação da fase reprodutiva em que
se encontra uma fêmea, pois o comprimento folicular no qual
se inicia a vitelogênese secundária varia entre as espécies. Isso
pode levar a interpretações equivocadas dos ciclos reprodutivos
e do tamanho em que a maturidade sexual é atingida nas fême-
as, uma vez que muitos estudos utilizam o comprimento ros-
tro-cloacal (CRC) da menor fêmea em vitelogênese secundária
como critério para avaliação da maturidade em toda população.
Por exemplo, a Fig.3 ilustra o ciclo reprodutivo de uma espé-
cie hipotética. Se partirmos de valores estabelecidos a priori de
que a vitelogênese ocorre com folículos a partir de 5 ou 10mm
(como frequentemente observado na literatura) iremos inferir
erroneamente que ela acontece ao longo do ano ou a partir de
agosto, respectivamente, quando na verdade ela tem início em
maio, quando os folículos começam a aumentar de tamanho (a
partir de 7mm) e se estende até o início de janeiro (Fig.3). As-
sim, o tamanho dos folículos secundários deve ser determinado
para cada espécie estudada e somente após a coleta de dados,
construção e análise do gráfico de folículos e não a priori (e.g.,
Leite et al., 2009; Mesquita etal., 2013; Braz etal., 2014).
Durante a dissecção de uma fêmea com oócitos muito au-
mentados, é importante ter cautela para determinar correta-
mente se essas estruturas se localizam nos ovidutos ou nos
ovários, e assim definir se a fêmea examinada apresenta ovos
ou folículos pré-ovulatórios em vitelogênese avançada (Fig.4).
Quando se observam folículos aumentados no ovário, é pos-
sível notar folículos primários intercalados aos secundários,
e o oviduto pode ser localizado ao lado do agrupamento de
folículos, facilitando a confirmação de que esses são pré-ovula-
tórios (Fig.4A). Quando se observam ovos nos ovidutos, pode-
-se localizar o prolongamento dos ovidutos após a região onde
se encontram os ovos, e os ovários podem ser encontrados pa-
ralelamente a essas estruturas (Fig.4B).
Outro fator importante a ser considerado no ciclo reprodu-
tivo de fêmeas é a estocagem de esperma. A ocorrência de esto-
cagem de esperma em uma espécie pode ser sugerida por dados
indiretos, como a ocorrência de posturas ou parturições em fê-
meas mantidas isoladas de machos ou pela dissociação entre as
épocas de acasalamento e ovulação (Almeida-Santos e Salomão,
1997, 2002; Hartmann et al., 2004; Booth e Schuett, 2011; Ro-
jas etal., 2013; Silva etal., 2014). Porém, é importante destacar
que a confirmação de estocagem só pode ser obtida com o uso
de técnicas de microscopia. Fêmeas de serpentes podem esto-
car esperma em duas regiões diferentes do oviduto. No infun-
díbulo posterior, podem ocorrer túbulos de estocagem, no in-
terior dos quais os espermatozoides são mantidos (Fox, 1977;
Saint Girons, 1985; Blackburn, 1998; Siegel et al., 2011; Rojas,
2013). Já a estocagem no útero aglandular ocorre por meio de
uma contração da musculatura uterina (Uterine Muscular Twis-
ting, UMT), documentada em crotalíneos e facilmente identi-
ficável macroscopicamente (Almeida-Santos e Salomão, 1997,
2002; Barros et al., 2012, 2014).
A época de recrutamento (i.e., o período em que os recém-
-nascidos são incorporados na população) é outro componente
importante do ciclo reprodutivo. Essa informação é algumas
vezes inferida indiretamente, observando-se a época em que
indivíduos com tamanho corpóreo de recém-nascidos são co-
letados na natureza (Maschio et al., 2007; Orofino etal., 2010;
Braz et al., 2014). De forma direta, a época de recrutamento
é determinada utilizando-se dados de eclosão ou nascimen-
tos em laboratório ou na natureza (Balestrin e Di-Bernardo,
2005; Oliveira et al., 2011; Barros et al., 2012). No entanto,
a temperatura experimentada pelos ovos/embriões durante o
Figura3: Variação sazonal no diâmetro do maior folículo ovariano (círculos pre-
tos) e ovos (círculos brancos) de uma espécie hipotética. As linhas tracejadas se-
param os folículos primários (inferior) e secundários (superior) de acordo com
valores pré-estabelecidos de 5 ou 10mm. A linha pontilhada separa os folículos
primários e secundários a partir da observação do aumento real dos folículos,
no início de maio.
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desenvolvimento influencia diretamente na sua duração. Ti-
picamente, temperaturas mais elevadas diminuem o período
necessário para a conclusão do desenvolvimento (Andrews,
2004). Por exemplo, ovos da serpente Phalotris lativittatus incu-
bados em 24°C requereram 119 dias de incubação ao passo que
ovos mantidos em 28°C requereram 73 dias; uma diminuição
Figura4: Fêmeas de serpentes (Helicops sp.) apresentando (A) folículos ovarianos em vitelogênese secundária e (B) embriões no oviduto. V1: Vitelogênese primária.
V2: Vitelogênese secundária. Barra de escala = 1 cm. Fotos: Camilla M. de Carvalho.
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de aproximadamente um mês e meio na duração da incubação
(Braz et al., 2009). Essa relação é observada mesmo em táxons
vivíparos. Apesar de fêmeas vivíparas poderem regular sua
temperatura corpórea durante a gestação (Shine, 2012), a tem-
peratura disponibilizada em laboratório para as mães durante
esse período também influencia a duração do desenvolvimento
(Ji et al., 2007). Contudo, essa informação é frequentemente
negligenciada em diversos estudos (e.g., Bizerra et al., 2005;
Hauzman et al., 2005). É de extrema importância que dados
(média, amplitude) do ambiente térmico disponibilizado aos
ovos ou às mães durante o estudo sejam monitorados e apre-
sentados na publicação (e.g., Travaglia-Cardoso e Albuquerque,
2006), possibilitando assim a contextualização da época de
recrutamento no ciclo reprodutivo e facilitando a comparação
dos resultados com outros estudos.
Em paralelo, o aspecto do oviduto é algumas vezes levado
em consideração como indicativo de desova ou parturição re-
cente. Alguns autores consideram a presença de oviduto com
aspecto frouxo ou alargado como indicativo de condição pós-
-parto ou pós-desova (e.g., Mesquita et al., 2013). No entanto,
deve-se ressaltar que já durante a fase final de vitelogênese se-
cundária os ovidutos começam a apresentar dobras, possivel-
mente preparando-se para o recebimento dos oócitos na ovula-
ção. Sendo assim, a inferência de condição pós-parto com base
na observação de pregas nos ovidutos deve ser feita com caute-
la, a partir de um bom conhecimento da anatomia da espécie
estudada. Em paralelo, análises histológicas do útero glandular
podem auxiliar nessa distinção. Na fase pré-ovulatória o útero
apresenta diversas glândulas (envolvidas na formação da casca
do ovo ou membrana da casca em vivíparos), ao passo que em
fêmeas pós-parto tais glândulas encontram-se esvaziadas ou
ausentes (Stewart et al., 2010). Além disso, pode-se considerar
também a condição corpórea do animal. A presença de baixos
níveis de gordura abdominal pode estar relacionada ao consu-
mo dessa fonte energética ao longo dos eventos reprodutivos,
especialmente a vitelogênese secundária e a gestação (Braña
et al., 1992; Friggens, 2003; Schneider, 2004).
Machos
O ciclo reprodutivo dos machos apresenta vários compo-
nentes que devem ser estudados simultaneamente para se che-
gar a um consenso sobre como esse sistema funciona na espécie
ou população de interesse. No estudo da atividade reprodutiva
de machos de vertebrados, o exame dos testículos ocupa um
lugar de destaque quando comparado aos ductos genitais (Ro-
mer e Parsons, 1986). O testículo das serpentes geralmente au-
menta de tamanho durante a espermatogênese (Volsøe, 1944;
Gribbins e Rheubert, 2011), de forma que medidas macroscó-
picas como tamanho e volume (Pleguezuelos e Feriche, 1999)
são comumente utilizadas como indicador da atividade esper-
matogênica (Alves et al., 2005; Pizzatto, 2005; Pizzatto etal.,
2008; Leite etal., 2009; López etal., 2009; Scartozzoni et al.,
2009; Nunes etal., 2010; Pinto etal., 2010; Gomes e Marques,
2012; Bellini etal., 2013). No entanto, trabalhos recentes que
levaram em consideração técnicas histológicas têm mostrado
que medidas macroscópicas podem não ser bons indicadores de
atividade testicular para animais preservados em coleções zoo-
lógicas (Barros et al., 2012, 2014; Rojas etal., 2013; Braz etal.,
2014). Fatores como compressão, desidratação e fixação inade-
quadas podem mudar o formato e tamanho da gônada resul-
tando em conclusões equivocadas sobre a sazonalidade do ciclo
reprodutivo. Por exemplo, uma análise do ciclo reprodutivo
dos machos de dormideira (Sibynomorphus mikanii) utilizando
somente o tamanho do testículo como indicador da época de
espermatogênese concluiu que os machos desta espécie apre-
sentavam ciclo reprodutivo contínuo por não haver variação
desse parâmetro ao longo do ano (Pizzatto et al., 2008). No
entanto, análises histológicas demonstraram mais tarde que o
ciclo reprodutivo desta espécie é na verdade sazonal, havendo
produção de espermatozoides durante apenas três meses por
ano (Rojas et al., 2013). Resultados semelhantes têm sido en-
contrados para outras espécies (Barros et al., 2012, 2014; Braz
et al., 2014). Portanto, para estudar adequadamente o ciclo
reprodutivo de machos de serpentes é indispensável o uso da
histologia para caracterização do ciclo de desenvolvimento do
epitélio seminal (Mathies, 2011). As análises microscópicas
mais frequentemente utilizadas para tanto incluem o estudo
dos estágios celulares (espermatogônias, espermatócitos, es-
permátides e espermatozoides) observados nos túbulos se-
miníferos ao longo do ano (Volsøe, 1944; Goldberg e Parker,
1975; Gribbins e Gist, 2003; Rojas et al., 2013) e avaliação de
mudanças estruturais como diâmetro e altura do epitélio dos
túbulos seminíferos (Rojas etal., 2013). Cabe também ressal-
tar que o uso do termo “ciclo espermatogênico” é totalmente
inadequado quando a abordagem abrange unicamente dados
macroscópicos.
Após saírem dos túbulos seminíferos, os espermatozoides
passam pela rete testis, dúctulos eferentes e ductos epididimá-
rios e adentram o ducto deferente (Volsøe, 1944; Sever, 2010;
Trauth e Sever, 2011). Talvez por sua fácil observação e iden-
tificação anatômica, o ducto deferente é bastante estudado na
determinação do ciclo reprodutivo de serpentes neotropicais
(e.g., Alves et al., 2005; Scartozzoni etal., 2009; Sueiro et al.,
2010; Pinto etal., 2010; Gomes e Marques, 2012). Diversos tra-
balhos têm mostrado que essa estrutura apresenta um aumen-
to macroscópico de diâmetro em sua porção distal e sugerem
que esse aumento esteja relacionado à estocagem de esperma
(Almeida-Santos et al., 2004, 2006). No entanto, apenas por
meio de cortes histológicos ou esfregaço é possível confirmar a
presença de espermatozoides nesses ductos.
Em serpentes, o ducto deferente também pode apresentar
uma estrutura conhecida como ampola, a qual tem um papel
importante na estocagem de gametas (Sever, 2004; Siegel et al.,
2009; Trauth e Sever, 2011). Em mamíferos, a ampola é relacio-
nada à maturação, nutrição, estocagem e fagocitose de esper-
matozoides (Cooper e Hamilton, 1977; Bergerson et al., 1994).
Contudo, poucos estudos abrangendo esse tópico foram reali-
zados em serpentes (Sever, 2004; Siegel et al., 2009; Trauth e
Sever, 2011). Outro ponto crítico no estudo do ducto deferente
é a utilização unicamente da porção distal para aferir variações
durante o ciclo reprodutivo, sendo que o estudo das porções
cranial e medial podem também auxiliar na compreensão do
processo de estocagem.
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Em serpentes, assim como em outros Squamata, o rim
(Fig.2) desempenha uma função sexual secundária por meio
do segmento sexual renal (SSR). Dependendo da espécie, esta
estrutura é formada por uma região diferenciada dos túbulos
contorcidos distais, ductos coletores e ureter (Saint Girons,
1972). Nos machos maduros, hipertrofia-se e torna-se secre-
tora, sendo facilmente distinguível dos túbulos adjacentes em
cortes histológicos. Sua atividade é andrógeno-dependente,
e observa-se hipertrofia dessa região quando há aumento da
concentração de testosterona na corrente sanguínea do animal.
Na maioria dos ofídios, o aumento na atividade secretora do
SSR está ligado à época de acasalamento (Volsøe, 1944; Bishop,
1959; Fox, 1977; Schuett et al., 2002). Assim, uma pesquisa
morfofuncional sobre ciclo reprodutivo masculino em serpen-
tes deve considerar a atividade secretora e estado de hipertrofia
do SSR, que pode ser avaliada com base em medidas de diâme-
tro e de altura do epitélio dos túbulos néfricos que compõem
essa estrutura (Rojas e Almeida-Santos, 2008; Rojas et al.,
2013). Tais medidas, juntamente com análises de densidade e
intensidade de coloração dos grânulos de secreção por técnicas
histoquímicas, consistem nas variáveis mais frequentemente
analisadas no estudo das variações sazonais do SSR (Aldridge e
Brown, 1995; Krohmer et al., 2004). Colorações histoquímicas
como Ácido Periódico de Schiff, Alcian Blue, Azul de Bromo-
fenol e Sudan Black são utilizadas para determinar o tipo de
secreção produzida pelo SSR (Kunhel e Krisch, 1974; Saint Gi-
rons, 1972; Sever e Hopkins, 2005; Sever et al., 2008; Rojas e
Almeida-Santos, 2008; Rojas etal., 2013), e a associação dessas
técnicas às medidas microscópicas dos túbulos pode fornecer
resultados mais precisos quanto à variação sazonal principal-
mente em relação aos grânulos secretados pelo SSR.
FECUNDIDADE
Tamanho da ninhada
Dados sobre o tamanho da ninhada (quantidade de ovos
ou filhotes produzidos) certamente compõem a informação
reprodutiva mais encontrada para serpentes (Fitch, 1970; Sei-
gel e Ford, 1987). O tamanho da ninhada é facilmente obtido
contando o número de ovos/embriões presentes no oviduto de
diversas formas como: apalpação abdominal de fêmeas grávi-
das (Fitch, 1987), dissecção de exemplares (e.g., Scartozzoni
et al., 2009) ou observação do produto expelido (Gregory etal.,
1992). Além disso, é frequente encontrar na literatura estimati-
vas do tamanho da ninhada feitas considerando também o nú-
mero de folículos em vitelogênese secundária em fêmeas não
grávidas (e.g., Marques, 2001; Scartozzoni et al., 2009; Gomes e
Marques, 2012). Quando da utilização de folículos secundários,
poucos estudos deixam explícito a utilização desse tipo de dado
(e.g., Balestrin e Di-Bernardo, 2005; Oliveira et al., 2011; Mes-
quita etal., 2013). Embora em algumas espécies o número de
folículos secundários e o número de ovos/embriões seja similar
(Maschio et al., 2007; Oliveira etal., 2011), em outras o núme-
ro de folículos secundários produzidos por uma fêmea é maior
que o número de ovos/embriões observados no oviduto (Shine,
1977; Ford e Karges, 1987; Mesquita etal., 2013). Assim, nem
todos os folículos secundários produzidos são ovulados e con-
vertidos em ovos/embriões, o que pode levar a estimativas
equivocadas do tamanho da ninhada.
Diante disso, sugerimos que o tamanho da ninhada obtido
pelo número de folículos secundários e pelo número de ovos/
embriões no oviduto sejam considerados separadamente e
comparados entre si (e.g., Balestrin e Di-Bernardo, 2005; Oli-
veira etal., 2011; Mesquita etal., 2013). Além disso, recomen-
damos que folículos secundários sejam utilizados alternativa-
mente apenas como estimativa do tamanho da ninhada nos
casos em que o número de fêmeas grávidas na amostra é muito
baixo ou inexistente. Nesses casos, a opção de utilizar fêmeas
com folículos vitelogênicos em estágios bem avançados (em vez
de folículos em todos os graus de vitelogênese) pode ser uma
saída mais aconselhável para minimizar erros (e.g., Braz et al.,
2014).
Massa Relativa da Ninhada
A massa relativa da ninhada (Relative Clutch Mass, RCM) é
uma estimativa operacional do investimento reprodutivo de
uma determinada espécie (Bonnet et al., 2003). Outras manei-
ras de estimar o esforço reprodutivo podem ser encontradas na
literatura (e.g., Vitt e Congdon, 1978). Contudo, a massa rela-
tiva da ninhada (MRN) é a mais comumente utilizada, princi-
palmente pela facilidade em se obter esse tipo de informação,
sendo empregada em uma gama de estudos descrevendo pa-
drões de investimento reprodutivo em Squamata (e.g., Vitt e
Congdon, 1978; Vitt e Price, 1982; Seigel e Fitch, 1984; Shine,
1988b, 1992; Shine e Schwarzkopf, 1992).
Duas formas de calcular a MRN são frequentemente en-
contradas na literatura: (1) massa total da ninhada/(massa
da mãe após a desova ou parturição + massa total da ninhada)
(Vitt e Congdon, 1978; Seigel e Fitch, 1984) e (2) massa total
da ninhada/massa da mãe após desova ou parturição (Shine,
1980b). Apesar de alguns autores argumentarem que a segun-
da opção é mais adequada como estimativa do esforço repro-
dutivo, além de evitar problemas estatísticos (Shine, 1980b;
Setser et al., 2010), tanto a primeira (Balestrin e Di-Bernardo,
2005; Oliveira et al., 2011) quanto a segunda (Scartozzoni
etal., 2005; Pizzatto e Marques, 2006; Braz etal., 2009) são re-
correntemente observadas em estudos de reprodução. Alguns
autores optam até mesmo por apresentar os valores calculados
utilizando os dois modos (Braz e Almeida-Santos, 2008; Setser
et al., 2010). Porém, os autores nem sempre deixam claro como
a MRN foi calculada (e.g., Costa et al., 2005; Hauzman etal.,
2005; Travaglia-Cardoso e Albuquerque, 2006), o que acaba di-
ficultando a interpretação dos resultados pelo leitor, bem como
comparações futuras. A despeito da opção por um ou outro mé-
todo, é importante que a escolha do autor seja claramente ex-
plicitada no texto (e.g., Scartozzoni et al., 2005; Oliveira etal.,
2011). Mais importante, nós encorajamos que os dois valores
envolvidos no cálculo da MRN (i.e., massa total da ninhada e
massa da mãe após desova/parturição) sejam apresentados
no texto (e.g., Brown e Shine, 2002; Braz e Almeida-Santos,
2008). Assim, outros autores podem futuramente reaproveitar
Herpetologia Brasileira - Volume 3 - Número 1 - Março de 2014
Métodos em Herpetologia 19

ou reavaliar os dados em contextos comparativos (e.g., Seigel
e Fitch, 1984; Shine, 1992; Shine e Schwarzkopf, 1992). Além
disso, algumas recomendações com relação à coleta desses da-
dos são necessárias. Todo o produto reprodutivo expelido pelas
mães deve ser pesado e incluído como massa da ninhada. Isso
envolve ovos viáveis e inviáveis em táxons ovíparos e filhotes
vivos, natimortos, vitelo e anexos embrionários nos táxons vi-
víparos (Gregory et al., 1992). Recomendações adicionais para
a coleta de dados de MRN podem ser encontradas em Seigel e
Ford (1987).
Produção de múltiplas ninhadas
A possibilidade de produção de mais de uma ninhada em
uma única estação reprodutiva é uma característica que há
tempos tem sido atribuída a fêmeas de serpentes que habitam
regiões tropicais (Fitch, 1970, 1982; Seigel e Ford, 1987). No
entanto, evidências diretas para essa suposição, ou seja, obser-
vação de duas ou mais desovas/parturições dentro de uma mes-
ma estação reprodutiva por uma mesma fêmea, raramente têm
sido demonstrada na natureza ou em espécimes recém-captu-
rados (Seigel e Ford, 1987; Brown e Shine, 2002). A maior parte
dos registros deriva de exemplares mantidos em cativeiro cujas
condições estáveis (disponibilidade de alimento e temperatura
constantes) podem modificar o potencial reprodutivo (Seigel e
Ford, 1987). Na ausência de informações na natureza, muitos
autores vêm utilizando o encontro de fêmeas contendo simul-
taneamente folículos vitelogênicos e ovos/embriões no oviduto
como sugestão de que a espécie (ao menos potencialmente) se
reproduz mais de uma vez em uma estação reprodutiva (e.g.,
Vitt, 1983; Aguiar e Di-Bernardo, 2005; Marques e Muriel,
2007; Pinto et al., 2010; Mesquita etal., 2013). Embora essa
seja uma hipótese plausível, a natureza indireta dessa inferên-
cia a torna passível de interpretações alternativas. Outras pos-
sibilidades merecem ser consideradas paralelamente antes de
se assumir a potencialidade de múltiplas ninhadas.
Antes de tudo, é preciso assegurar que os folículos ovaria-
nos estejam de fato em vitelogênese (veja tópico sobre ciclos
reprodutivos de fêmeas). Além disso, considerando que em
algumas espécies o número de folículos secundários produzi-
dos é maior que o número de oócitos efetivamente ovulados
(conforme discutido no tópico sobre tamanho da ninhada), a
presença de folículos secundários em fêmeas grávidas poderia,
em vez de sugerir ninhadas múltiplas, representar tão somente
folículos remanescentes, que mais tarde sofrerão processo de
regressão ainda no ovário (Lourdais et al., 2003; Mathies etal.,
2004; García-Valdez et al., 2011). Por exemplo, Shine (1977,
p.658) relata que, em alguns elapídeos, “um ou dois folículos
que tinham atingido tamanho ovulatório não foram ovulados,
tornaram-se atrésicos e começaram a regredir”.
Pode-se argumentar que tais folículos remanescentes po-
deriam ser usados na produção de uma ninhada adicional.
Contudo, os folículos são normalmente referidos apenas como
“vitelogênicos” ou “aumentados”, de forma que as medidas de
tais folículos raramente são apresentadas. Nas poucas ocasiões
em que dados quantitativos são apresentados (e.g., Aguiar e Di-
-Bernardo, 2005; Pizzatto e Marques, 2006; Pinto et al., 2010)
não é incomum notar que tais folículos ainda não atingiram ta-
manho pré-ovulatório. Em outras palavras, ainda carecem de
deposição de vitelo para a produção de ninhada adicional. Nes-
se contexto, é importante ter em mente que a taxa de desenvol-
vimento folicular pode não ser constante ao longo do ano (veja
discussão em Mathies, 2011).
Além disso, cabe ressaltar que a reprodução envolve cus-
tos (Shine, 2003), e entre a observação de uma fêmea grávida
portando folículos secundários e a efetiva produção de uma
ninhada adicional existe uma série de requisitos a serem con-
siderados, como a necessidade de energia (adquirida prévia ou
simultaneamente à reprodução, capital breeders vs. income bree-
ders; Drent e Daan, 1980; Bonnet et al., 2002), preparação fisio-
lógica, estocagem de esperma nas fêmeas ou cópula adicional,
tempo para formação da casca do ovo e retenção dos ovos (de
duas a quatro semanas; Andrews e Mathies, 2000). Dependen-
do da época em que for observada uma fêmea portando ovos/
embriões no útero e folículos vitelogênicos, é provável que não
haja tempo para a produção de outra ninhada na mesma esta-
ção. Por fim, características como o modo reprodutivo podem
fornecer pistas contra a hipótese de múltiplas ninhadas. A vi-
viparidade apresenta elevados custos associados à manutenção
dos embriões (Shine, 1985; Bleu et al., 2012) e, de fato, a maior
parte das espécies vivíparas se reproduz a intervalos de pelo
menos dois anos (Seigel e Ford, 1987). Assim, a probabilida-
de de uma espécie vivípara produzir uma segunda ninhada em
uma mesma estação reprodutiva (e.g., Aguiar e Di-Bernardo,
2005) é bastante baixa.
Estudos monitorando populações naturais representam as
melhores oportunidades de encontrarmos evidências de múl-
tiplas ninhadas. Por exemplo, após monitorarem indivíduos
de Tropidonophis mairii ao longo de 18 meses, Brown e Shine
(2002) encontraram evidência inequívoca de produção de múl-
tiplas ninhadas na natureza em uma única estação reprodutiva.
Com base nisso, os autores propõem que a produção de múl-
tiplas ninhadas seja bastante difundida em táxons tropicais,
mas que a raridade de observações na natureza possivelmente
reflita a falta de estudos monitorando a história reprodutiva
de populações naturais (Brown e Shine, 2002). Nesse senti-
do, algumas espécies no Brasil sugeridas como produtoras de
múltiplas ninhadas (e.g., Liophis poecilogyrus: Pinto e Fernan-
des, 2004; Xenodon dorbignyi: Oliveira et al., 2011) parecem ser
bastante abundantes em determinadas áreas, uma vez que um
grande número de indivíduos foram coletados em um período
relativamente curto (Maciel etal., 2003; Oliveira etal., 2011),
oferecendo imenso potencial para revelar outros exemplos ine-
quívocos de produção de múltiplas ninhadas.
DIMORFISMO SEXUAL
Espécies de serpentes podem apresentar diferenças entre
os sexos em diversas caraterísticas ecológicas e morfológicas
(Shine, 1978b, 1994, Fitch, 1981, King, 1989, Vincent et al.,
2004). O dimorfismo no tamanho do corpo e no tamanho da
cauda estão entre os mais abordados em estudos de reprodu-
ção. A diferença intersexual no tamanho da cauda (tipicamente
Herpetologia Brasileira - Volume 3 - Número 1 - Março de 2014
Métodos em Herpetologia
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maior em machos) é frequentemente associada à acomodação
dos hemipênis e músculos retratores (King, 1989), embora a
causa exata de sua evolução permaneça incerta (Shine et al.,
1999). A análise do dimorfismo sexual no tamanho do corpo
é especialmente importante pois pode fornecer pistas sobre o
sistema de acasalamento da espécie como a presença de comba-
te entre machos (Shine, 1978b, 1994).
Para comparações sobre o tamanho do corpo é utilizado o
índice de dimorfismo sexual de tamanho (Sexual Size Dimor-
phism, SSD). Esse índice pode ser calculado com base em dife-
rentes tipos de dados: (1) utilizando a média do comprimento
rostro-cloacal (CRC) de machos e fêmeas, (2) considerando o
tamanho corporal (CRC) máximo atingido por cada um dos se-
xos, (3) comparando o CRC com que machos e fêmeas atingem
a maturidade sexual, ou até mesmo (4) comparando a massa
corpórea, embora este último parâmetro esteja sujeito a flutu-
ações em um curto espaço de tempo e seja raramente descrito
em detalhe (Shine, 1994). Há ainda variadas fórmulas para o
cálculo do índice de dimorfismo sexual propostas na literatura
(veja revisão em Lovich e Gibbons, 1992). Considerando essa
variedade, é importante deixar explícito no trabalho de que
forma o SSD foi calculado. Assim, os dados poderão ser utili-
zados em diferentes contextos comparativos, como por exem-
plo, para a análise da evolução de sistemas de acasalamento,
especialmente com respeito à comparação entre espécies que
apresentam ou não ritual de combate entre machos (Shine,
1994). As análises abrangentes sobre este tema disponíveis na
literatura não incluem uma amostragem significativa de espé-
cies da região neotropical (Shine, 1978b, 1994), o que reforça a
importância da apresentação dos dados utilizados no cálculo do
SSD, para que uma análise comparativa englobando as espécies
da região neotropical possa ser realizada no futuro.
CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS
O conhecimento sobre reprodução de serpentes neotropi-
cais tem avançado bastante nos últimos vinte anos, especial-
mente no Brasil. Esse avanço, reconhecido inclusive interna-
cionalmente (Mathies, 2011), resultou do esforço de diferentes
pesquisadores espalhados pelo país e tem proporcionado conhe-
cimento de aspectos reprodutivos básicos como ciclos reprodu-
tivos, fecundidade e comportamento reprodutivo. Entretanto,
as questões aqui abordadas destacam algumas inconsistências
na execução de estudos em reprodução de serpentes que envol-
vem a identificação das estruturas anatômicas do trato repro-
dutor (fundamentais para a coleta de dados), a coleta e análise
dos dados bem como a apresentação dos resultados. Isso posto,
muitas oportunidades de estudos permanecem disponíveis em
reprodução de serpentes.
As divergências entre análises macro e microscópicas no es-
tudo da reprodução indicam que os ciclos reprodutivos de ma-
chos descritos apenas por caracterização macroscópica (diâme-
tro do ducto deferente, volume ou comprimento dos testículos)
em diversas espécies carecem ainda de confirmação histológica.
Tais análises podem ser realizadas tanto em parceria com labo-
ratórios de histologia de universidades e institutos de pesquisa
como em laboratórios comerciais privados. Estudos em campo
monitorando populações naturais são necessários para a reso-
lução de pontos relacionados não só à frequência reprodutiva
abordados aqui, mas também para o esclarecimento de diver-
sas questões relacionadas aos ciclos reprodutivos e à história
de vida. Informações oriundas de cativeiro podem complemen-
tar dados obtidos em campo ou de animais preservados em co-
leção, especialmente aqueles difíceis de serem registrados na
natureza, e fornecer informações comportamentais e fisiológi-
cas que possibilitam a elucidação da dinâmica e evolução das
estratégias reprodutivas. Por fim, cabe ressaltar a necessidade
de buscarmos integrar os estudos em reprodução de machos e
fêmeas de serpentes de modo que alcancemos uma maior com-
preensão da biologia reprodutiva da espécie em questão como
um todo.
AGRADECIMENTOS
Nós agradecemos a Hipócrates M. Chalkidis, Marcos A. Car-
valho e Francisco L. Franco por permitir o exame dos espécimes
aqui ilustrados e à Camilla M. de Carvalho e a Otavio A. V. Mar-
ques pelas fotografias. Agradecemos também à Fundação de
Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), Conselho
Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
e à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Supe-
rior (CAPES) pelo auxílio financeiro.
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