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Analytik von phenolischen Inhaltsstoffen in Aroniasäften (Aronia melanocarpa)

Authors:
Analytik von phenolischen Inhaltsstoffen in Aroniasäften (Aronia
melanocarpa)
Analysis of phenolic constituents in chokeberry (Aronia
melanocarpa) juices
Tuba Esatbeyoglu, Silke Hillebrand und Peter Winterhalter
Technische Universität Braunschweig, Institut für Lebensmittelchemie, Schleinitzstr. 20, D-
38106 Braunschweig
Keywords: Aroniasaft, Aronia melanocarpa, Gesamtphenolgehalt, antioxidative Aktivität,
Anthocyane, Chlorogensäuren, Quercetin-Derivate, Proanthocyanidine / chokeberry juice,
Aronia melanocarpa, phenolic content, antioxidative capacity, anthocyanins, chlorogenic
acids, quercetin derivatives, proanthocyanins
Zusammenfassung
Von acht verschiedenen Aroniasäften wurde die antioxidative Aktivität, der
Gesamtphenolgehalt, der Monomerindex, der Gehalt an monomeren Anthocyanen,
Chlorogensäuren, Quercetin-Derivaten und polymeren Procyanidinen bestimmt. Die
antioxidative Kapazität (TEAC-Test) liegt im Bereich von 26,8 bis 34,2 mmol Trolox-
Equivalente (TE)/L und der Gesamtphenolgehalt (Folin-Ciocalteu-Methode) je nach
Saftprobe zwischen 3911 bis 5812 mg Gallussäure-Equivalente (GAE)/L. Für den
Monomerindex konnten Werte zwischen 2,6 und 21,7 ermittelt werden. Die untersuchten
Säfte zeigen einen hohen Gehalt an monomeren Anthocyanen (341 – 1163 mg/L), wobei die
Anthocyanzusammensetzung im Wesentlichen durch die Hauptpigmente Cyanidin-3-
galactosid und Cyanidin-3-arabinosid sowie die Minorpigmente Cyanidin-3-glucosid und
Cyanidin-3-xylosid geprägt wird. Aroniasäfte sind eine gute Quelle zur Aufnahme von
Hydroxyzimtsäure-Derivaten. Es sind vor allem die Chlorogensäure (5-Caffeoylchinasäure)
sowie die Neochlorogensäure (3-Caffeoylchinasäure) vertreten (490 – 1412 mg/L).
Quercetin-3-galactosid, Quercetin-3-rutinosid und Quercetin-3-glucosid sind mit einem
Gehalt von 204 bis 656 mg/L die Hauptvertreter unter den Flavonol-Glykosiden. Polymere
Procyanidine, welche ausschließlich aus (-)-Epicatechin-Einheiten zusammengesetzt sind,
konnten in den untersuchten Aroniasäften in hohen Gehalten (bis zu 1693,3 mg/100 g Tr)
nachgewiesen werden.
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Summary
Antioxidative activity, total polyphenols, monomeric index, monomeric anthocyanins,
chlorogenic acids, quercetin derivatives, and polymeric procyanidins were evaluated in eight
different chokeberry juices. All juices show a high antioxidant activity (26.8 34.2 mmol
TE/L) and a high content of polyphenols (3911 – 5812 mg GAE/L) using the TEAC and Folin-
Ciocalteu assay, respectively. The monomeric index ranged from 2.6 to 21.7. According to
the HPLC results it is apparent that chokeberry juices show high monomeric anthocyanin
contents (341 - 1163 mg/L). The anthocyanin composition of all juices consists of the two
major pigments cyanidin 3-galactoside and cyanidin 3-arabinoside, as well as the minor
anthocyanins cyanidin 3-glucoside and cyanidin 3-xyloside, respectively. Chokeberry juices
are also a rich source of hydroxycinnamic acid derivatives mainly represented by 5-
caffeoylquinic acid (chlorogenic acid) and 3-caffeoylquinic acid (neochlorogenic acid). The
total content of chlorogenic acids varied from 490 to 1412 mg/L. The main flavanol
glycosides of chokeberry are quercetin 3-glycosides. The analyzed juices contain high
contents of quercetin 3-galactoside, quercetin 3-glucoside, and quercetin 3-rutinoside. The
total amount of quercetin 3-glycosides ranged from 204 mg/L to 656 mg/L. High
concentrations of polymeric procyanidins were found (up to 1693,3 mg/100 g Tr). With regard
to the composition of the polymers, degradation with phloroglucinolysis revealed that they
almost exclusively consist of (-)-epicatechin units.
Einleitung
Aroniabeeren (Aronia melanocarpa), auch Apfelbeere oder Schwarze Eberesche genannt,
gehören zur Familie der Rosengewächse (Rosaceae). Am häufigsten vertreten sind die
beiden Arten Aronia arbutifolia und Aronia melanocarpa. Sie stammen ursprünglich aus dem
Osten Nordamerikas und gelangten seit Mitte des 20. Jahrhunderts nach Osteuropa. Heute
befinden sich die Hauptanbaugebiete der Aroniabeere in Polen, Tschechien, Slowenien und
in einigen ostdeutschen Regionen (Ara, 2002). Der Strauch wächst buschartig und wird ein
bis drei Meter hoch. Im Mai blüht die Aronia mit weißer Blütenpracht und im August sind die
erbsengroßen, violettschwarzen Früchte reif. Die frischen Früchte schmecken herb-
süßsäuerlich und weisen einen adstringierenden Beigeschmack auf. Das Aroma der
Aroniabeeren wird durch den hohen Gerbstoffanteil sowie blausäurehaltige Verbindungen
wie Amygdalin (Lehmann, 1990, Seidemann, 1993) geprägt. Aus diesem Grund ist die
Frucht in rohem Zustand nicht zum Verzehr geeignet. Sie eignet sich besonders gut zur
Färbung von Lebensmitteln und zur Herstellung von Marmeladen oder Säften, wobei die
Saftausbeute der Beeren bei ca. 75-80% liegt.
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Die positiven gesundheitlichen Wirkungen der Aroniabeeren sind in der Naturheilkunde
bereits seit Jahrhunderten bekannt (Slimestad et al., 2005). Für die gesundheitsfördernde
Wirkung der Aronia sind hauptsächlich die sekundären Pflanzenstoffe, insbesondere die
Flavonoide, verantwortlich. Sie wirken antioxidativ, entzündungshemmend, antimikrobiell und
präventiv auf Herz-Kreislauf- sowie Krebserkrankungen (Valcheva-Kuzmanova und
Belcheva, 2006, Kulling und Rawel, 2008).
Der Anteil an phenolischen Verbindungen ist in Aroniabeeren sehr hoch. Sie haben im
Vergleich zu anderen Beeren den höchsten Anthocyan- und Proanthocyanidingehalt (Wu et
al., 2004, Bermudez-Soto und Tomas-Barberan, 2004, Oszmianski und Wojdylo, 2005).
Farbgebende Komponenten sind die Anthocyane. Als Hauptanthocyane sind in den
Aroniabeeren Cyanidin-3-galactosid (65,47%) und Cyanidin-3-arabinosid (29,69%) sowie als
Minorkomponenten Cyanidin-3-glucosid (2,15%) und Cyanidin-3-xylosid (2,69%) enthalten
(Oszmianski und Wojdylo, 2005). Die Hauptvertreter der Phenolcarbonsäuren sind
Chlorogensäure und Neochlorogensäure (Slimestad et al., 2005). Weiterhin konnten in
Aronia diverse Quercetinderivate wie Quercetin-3-galactosid, Quercetin-3-glucosid,
Quercetin-3-vicianosid, Quercetin-3-robinobiosid und Quercetin-3-rutinosid nachgewiesen
werden (Slimestad et al., 2005). Polymere Proanthocyanidine bilden mit einem Anteil von
66% die Hauptgruppe an Polyphenolen in Aronia (Oszmianski und Wojdylo, 2005).
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die phenolischen Bestandteile von kommerziell
erhältlichen Aroniasäften zu analysieren. Es wurden u.a. der Gesamtpolyphenolgehalt nach
Folin-Ciocalteu und die antioxidative Kapazität mittels TEAC (Trolox equivalent antioxidant
capacity) bestimmt und die phenolischen Hauptkomponenten wie Anthocyane,
Proanthocyanidine, Phenolsäuren und Quercetinderivate mittels HPLC-DAD quantifiziert.
Weitere Analysenparameter waren der Gehalt an polymeren Procyanidinen (HPLC, Bate-
Smith) sowie der Anteil monomerer Anthocyane (Monomerindex).
Material und Methoden
1.1 Probenmaterial
Bei den untersuchten Proben handelt es sich um kommerziell erhältliche Aroniasäfte von
verschiedenen Herstellern. Zur Untersuchung standen sechs Direktsäfte (Säfte A bis F) und
zwei Konzentrate (Säfte G und H) zur Verfügung. Die Proben wurden in dem Zeitraum Juni
2008 bis Mai 2009 aus dem Handel bezogen. Bei den Säften A und E sowie F bis H handelt
es sich um jeweils denselben Hersteller mit unterschiedlichen Mindesthaltbarkeitsdaten
(MHD) der untersuchten Proben.
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Die Säfte A und E wurden aus Aronia melanocarpa Nero (Kultursorte) hergestellt, während
die Säfte F, G und H aus Aronia melanocarpa (Wildsorte) hergestellt wurden. Die Beeren
(Wildsorte) für die Herstellung des Saftes D stammen aus der Ukraine.
1.2 Antioxidative Kapazität
Die antioxidative Aktivität wird mittels des Trolox Equivalent Capacity Tests (TEAC Assay)
nach Re et al. (1999) bestimmt. Die Versuchsdurchführung erfolgt hierbei wie bei Hillebrand
(2004) beschrieben. Die Säfte wurden 1:20 verdünnt und es wurde von jeder Probe eine
Doppelbestimmung durchgeführt.
1.3 Bestimmung des Gesamtpolyphenolgehaltes
Die Bestimmung des Gesamtphenolgehaltes der verdünnten Saftproben (1:20 Verdünnung)
nach Folin-Ciocalteu (Singleton und Rossi, 1965) erfolgt analog der Beschreibung nach
Hillebrand (2004).
1.4 Monomerindex
Der Monomerindex ist eine photometrische Methode, mit der die Summe der monomeren
und polymeren Anthocyane bestimmt werden kann. Das Verhältnis der monomeren zu den
polymeren Anthocyanen entspricht dem Monomerindex. Bei einem pH-Wert von 1 werden
nur die freien monomeren Anthocyane durch schweflige Säure gebleicht. Die polymeren
Anthocyane werden dagegen nicht entfärbt. Die Bestimmung erfolgt nach der von Bonerz et
al. (2006) publizierten Methode. Zur Bestimmung des Monomerindex wurden die Säfte im
Verhältnis 1:5 mit Wasser verdünnt.
1.5 Butanolyse (Bate-Smith)
Diese Methode dient zur quantitativen Bestimmung oligomerer Proanthocyanidine. Das
Prinzip der Methode nach Bate-Smith (1953, 1977) beruht auf der säurekatalysierten
Spaltung der oligomeren bzw. polymeren Proanthocyanidine, wobei sich die Empfindlichkeit
dieser Methode mit steigendem Polymerisationsgrad erhöht. Die freigesetzten roten
Flavyliumkationen können photometrisch bei 550 nm detektiert werden. Die Quantifizierung
erfolgte als Dimer B1-Equivalente.
Unter sauren Bedingungen werden zunächst die interflavanoiden Bindungen der oligomeren
Proanthocyanidine gespalten. Dabei werden die oberen Monomerbausteine als
Carbokationen freigesetzt, die bei thermischer Umsetzung unter Anwesenheit von Sauerstoff
zu stabilen Flavyliumkationen, den Anthocyanidinen, oxidiert werden. Die terminalen
Einheiten der oligomeren Proanthocyanidine bleiben als ungeladene Flavan-3-ole
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unverändert zurück. Zusätzlich wird bei dieser Reaktion ein Eisen(III)-Salz dazugegeben,
das eine Stabilisierung der Flavyliumkationen durch Komplexbildung bewirkt.
Es werden 4 mL der 1:100 verdünnten Aroniasäfte in braune Gläschen gefüllt und mit jeweils
12 mL der Reaktionslösung versetzt (A). Für die Reaktionslösung werden 167 mL
konzentrierte Salzsäure, 167 mL n-Butanol und 33,81 mg FeCl3 x 6 H2O in einem
Erlenmeyerkolben zusammengegeben. Die Gläschen werden verschlossen und der Inhalt
gemischt. Anschließend wird die Hälfte des Inhalts in ein weiteres Gläschen (B) gefüllt. Die
Gläschen A jeder Probelösung werden für 30 Minuten in ein siedendes Wasserbad gestellt.
Die Gläschen B werden für 30 min an einen dunklen Ort gestellt. Nach 30 min werden die
Extinktionen A1 (Gläschen A) und A2 (Gläschen B) photometrisch bei 550 nm ermittelt. Die
Messung erfolgt gegen Luft. Von jeder Probe wird eine Doppelbestimmung durchgeführt.
Für die Berechnung des Polymergehaltes wird die Extinktionsdifferenz der Extinktion A1
(Gläschen A) und A2 (Gläschen B) ermittelt.
21 AA
EEE
=
Zur Erstellung der Regressionsgeraden werden die Extinktionsdifferenzen ΔE gegen die
Konzentrationen aufgetragen. Die Standardlösungen werden aus einer Stammlösung der
Dimer B1-Konzentration 97,5 mg/L hergestellt und liegen im Konzentrationsbereich von
9,75 mg/L bis 97,5 mg/L.
1.6 Charakterisierung und Quantifizierung von Polyphenolen mittels HPLC-DAD und
HPLC-ESI-MSn
2.6.1 Kalibrierlösungen für die Anthocyanbestimmung
Zur Erstellung einer Kalibriergeraden wird das Anthocyan Cyanidin-3-glucosid (Cy-3-glc
Chloridsalz; Reinheit 99 %) verwendet. Aus der Stammlösung (440,6 mg Cy-3-glc/L) werden
Kalibrierlösungen im Konzentrationsbereich von 22,03 bis 176,24 mg Cy-3-glc/L hergestellt.
Die Aufnahme der Chromatogramme erfolgt bei einer Wellenlänge von 520 nm, wobei der
Standard bei den unter 2.6.4 angegebenen Bedingungen bei einer Retentionszeit von
24,1 min eluiert.
2.6.2 Kalibrierlösungen für die Chlorogensäurebestimmung
Zur Bestimmung des Gehaltes an Chlorogensäuren wird eine Stammlösung aus
Chlorogensäure (5-Caffeoylchinasäure bzw. 5-CQA) mit einer Konzentration von 1 g
Chlorogensäure/L hergestellt. Von dieser Lösung werden Kalibrierlösungen im
Konzentrationsbereich von 20 bis 180 mg 5-CQA/L hergestellt, wobei die Aufnahme der
Chromatogramme bei einer Wellenlänge von 320 nm erfolgt und der Standard bei einer
Retentionszeit von 17,4 min eluiert.
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2.6.3 Kalibrierlösungen für die Bestimmung von Quercetin-Derivaten
Zur quantitativen Bestimmung des Gehaltes an Quercetin-Derivaten werden ausgehend von
einer Rutin-Stammlösung (Quercetin-3-rutinosid, 1 g/L) Kalibrierlösungen zwischen 20 und
180 mg Rutin/L hergestellt und bei einer Wellenlänge von 360 nm detektiert, wobei der
eingesetzte Standard bei einer Retentionszeit von 39,9 min eluiert.
2.6.4 Versuchsdurchführung
Die vorliegenden Aroniasäfte (1:10 Verdünnung) wurden membranfiltriert (Chromafil® PET-
45/25, Macherey Nagel) und die HPLC-DAD-Analysen zur Quantifizierung des Gehaltes an
Anthocyanen, Chlorogensäuren sowie Quercetin-Derivaten wurden unter Verwendung einer
Jasco PU-980 HPLC Pumpe, einem Niederdruckgradientenformer Jasco LG 980-02, ternary
Gradient Unit, einem Jasco MD-910 Multiwavelength Detector sowie einem Jasco DG-980-
50-3-Line-Degaser durchgeführt. Als Säule wurde eine Luna 3µ C18 (2), 250 × 4,6 mm
(Phenomenex, Aschaffenburg) mit einer Flussrate von 0,5 mL/min verwendet. Zur Injektion
der Probe wurde eine 20 µL Probenschleife (Rheodyne 7125) verwendet. Die Auswertung
erfolgte mittels Borwin-PDA Version 1.0. Das Fließmittelsystem besteht aus Fließmittel A
(Wasser/Acetonitril/Ameisensäure 87/3/10 (v:v:v)) und Fließmittel B (Wasser/Acetonitril/
Ameisensäure 40/50/10 (v:v:v)). Gradient: 0 min 6% B, 20min 20% B, 35 min 40% B, 40 min
60% B, 45 min 90% B, 55 min 6% B, 60 min 6% B. Zur quantitativen Bestimmung des
Anthocyangehaltes wird die Summe aller bei 520 nm detektierten Peaks (ab einer
Retentionszeit von 15 min) bestimmt und der Anthocyangehalt in mg Anthocyan/L (berechnet
als Cyanidin-3-glucosid-Equivalente) angegeben. Zur Berechnung des Gehaltes an
Chlorogensäuren werden bei einer Wellenlänge von 320 nm die Peaks bei einer
Retentionszeit von 10,8 min (3-CQA), 17,4 min (5-CQA) sowie 18,6 min (4-CQA) addiert und
in mg/L berechnet als 5-Caffeoylchinasäure (5-CQA) bestimmt. Die Quercetin-Derivate
(Detektionswellenlänge λ= 360 nm) werden als Quercetin-3-rutinosid berechnet, wobei die
Summe der Peaks zwischen 37,0 bis 41,1 min zur quantitativen Bestimmung herangezogen
wird.
Die HPLC-ESI-MS-Analysen erfolgen mit einem Bruker Esquire-LC-MS/MS Gerät. Dabei
wurden folgende Parameter verwendet: positive bzw. negative mode; capillary -2500V bzw.
+2500V; capillary exit offset 70V; end plate offset -500V; skimmer 1 20V; skimmer 2 10V;
dry gas, N2 11 L/min; dry temperature 300 °C; nebulizer 10 psi; scan range 50-2200 m/z. Zur
HPLC-Analytik wurde ein System bestehend aus Pumpe (1100 series) und Autosampler
(1200 series) der Firma Agilent Technologies verwendet. Die Spektrenauswertung erfolgt
mittels HP Kayat XA, HP Chemstation, Esquire Control. Chromatographische Bedingungen
sind analog der oben beschriebenen.
6
1.7 Quantifizierung des Polymergehaltes mittels HPLC
Die Quantifizierung der polymeren Proanthocyanidine erfolgte gemäß einer modifizierten
Methode nach Hammerstone et al. (1999). Zur Quantifizierung der oligomeren bzw.
polymeren Proanthocyanidine wurde eine Agilent 1100 Series HPLC-Anlage bestehend aus
einer binären Pumpe, Säulenofen, Dioden-Array-Detektor und Autosampler
(Injektionsvolumen 20 µL) sowie eine Luna Silica (2), 100 Å, 250 x 4,6 mm Säule von
Phenomenex (Aschaffenburg) und eine Flussrate von 1,6 mL/min eingesetzt. Als
Fließmittelsystem wurden Fließmittel A: Dichlormethan/Methanol/Essigsäure/Wasser
(82:14:2:2, v/v/v/v) und Fließmittel B: Dichlormethan/Methanol/Essigsäure/Wasser
(10:86:2:2, v/v/v/v) verwendet. Gradient: 0 min 0% B, 30min 20% B, 63 min 75% B, 65 min
100% B, 70 min 100% B, 75 min 0% B, 80 min 0% B. Die Säulenofen-Temperatur betrug
37 °C. Die Chromatogramme wurden bei 280 nm mit der Software ChemStation V. 6.0
aufgezeichnet. Der Polymergehalt wurde mittels einer Regressionsgerade (480 bis 5000
mg/L) als (+)-Catechin-Equivalente ermittelt.
1.8 Charakterisierung von Proanthocyanidinen mittels HPLC-DAD und HPLC-ESI-MSn
Die Qualifizierung der Proanthocyanidine erfolgte mittels einer Jasco-Anlage bestehend aus
einer binären Pumpe, Degasser, Gradientenmischer, Säulenofen, Dioden-Array-Detektor
und Autosampler (Injektionsvolumen 20 µL). Als Software wurde ChromPass
Chromatography Data System (Version 1.8.6.1) verwendet. Zur Analytik wurde eine Aqua
5 µ C-18, 250 x 4,60 mm Säule (Phenomenex, Aschaffenburg) und eine Flussrate von
0,8 mL/min verwendet. Das Fließmittel bestand aus 2%iger Essigsäure (Fließmittel A) und
Acetonitril (Fließmittel B). Gradient: 0 min 3% B, 25 min 10% B, 45 min 35% B, 50 min 75%
B, 55 min 75% B, 60 min 3% B, 70 min 3% B. Die Säulenofen-Temperatur betrug 25 °C. Die
Chromatogramme wurden bei einer Wellenlänge von 280 nm aufgenommen. Die Zuordnung
der Proanthocyanidine erfolgte mittels zuvor isolierter Standardsubstanzen durch Vergleich
der Retentionszeit und der UV/VIS Spektren.
Für die HPLC-ESI-MSn-Bestimmungen stand ein Bruker Esquire LC-MS/MS System zur
Verfügung. Dabei wurden folgende Parameter verwendet: negative mode; capillary +3000V;
capillary exit offset -72,3V; end plate offset -500V; skimmer 1 -32,7V; skimmer 2 -6V; dry
gas, N2 10 L/min; dry temperature 325 °C; nebulizer 40 psi; scan range 50-2200 m/z. Zur
HPLC-Analytik wurde ein System bestehend aus Pumpe (1100 series) und Autosampler
(1200 series) der Firma Agilent Technologies verwendet. Die Spektrenauswertung erfolgt
mittels HP Kayat XA, HP Chemstation, Esquire Control. Chromatographische Bedingungen
sind analog der oben beschriebenen.
7
1.9 Phloroglucinolyse (säurekatalysierte Degradation)
Zur Anreicherung der Polyphenole wird zunächst eine Festphasenextraktion an Amberlite®
XAD-7 durchgeführt. Dazu werden 10 mL Aroniasaft auf die vorkonditionierte Säule (2 cm x
26 cm) gegeben und Zucker, organische Säuren, Salze, Proteine etc. mit Wasser entfernt.
Anschließend werden die Polyphenole mit 70%igem Aceton von der Säule eluiert, mittels
Rotationsverdampfer eingeengt und anschließend gefriergetrocknet (Hillebrand, 2004).
Die säurekatalysierte Degradation dient zur Polymeranalytik von Proanthocyanidinen. Mit
dieser Methode kann der mittlere Polymerisationsgrad (mDP) aus dem Verhältnis der
Summe aller Spaltprodukte zur Summe der terminalen Einheiten bestimmt werden.
Die interflavanoide Bindung wird unter sauren Bedingungen gespalten, so dass aus den
polymeren Procyanidinen bis auf die terminale Einheit positiv geladene Carbokationen
entstehen. Diese reagieren mit dem Nukleophil Phloroglucinol zu den charakteristischen
Phloroglucinoladdukten. Die Durchführung erfolgt nach der von Kennedy und Jones (2001)
veröffentlichten Methode. Die Quantifizierung der entstandenen Phloroglucinoladdukte
erfolgte als (+)-Catechin, (-)-Epicatechin, Catechin-(4α→2)-phloroglucinol und Epicatechin-
(4β→2)-phloroglucinol. Die beiden Phloroglucinoladdukte wurden aus einem
Traubenkernextrakt der Firma Breko (OPC 40) nach der von Köhler und Winterhalter (2005)
publizierten Methode hergestellt und mittels High-Speed countercurrent chromatography
(HSCCC) isoliert, die dann als Standardsubstanzen verwendet wurden. Die genauen
Parameter zur HPLC-Analytik finden sich im Abschnitt 2.8.
Ergebnisse und Diskussion
1.10 Antioxidative Kapazität, Gesamtphenolgehalt und Monomerindex
Die antioxidative Aktivität der vorliegenden Proben wurde mittels des von Miller et al. (1993)
entwickelten und von Re et al. (1999) modifizierten TEAC-Tests bestimmt. Für die acht
untersuchten Säfte konnten Werte zwischen 26,8 und 34,2 mmol TE/L ermittelt werden (Abb.
1). Bei einem Vergleich der Aroniasäfte untereinander wird deutlich, dass die antioxidative
Kapazität der einzelnen Säfte schwankt. Bei den Säften A und E handelt es sich um
Muttersäfte, die von demselben Hersteller zu unterschiedlichen Zeitpunkten produziert
wurden. Geht man davon aus, dass die Beeren lediglich 1 Mal im Jahr geerntet werden, so
sollte die antioxidative Aktivität der Säfte bei identischem Herstellungsprozess annähernd
8
gleich sein. Der Saft A zeigt jedoch mit 33,9 mmol TE/L einen deutlich höheren TEAC-Wert
als der Saft E mit 26,8 mmol TE/L. Gründe für diese Schwankungen können in der
Verwendung von Beeren aus unterschiedlichen Jahrgängen oder aber unterschiedlicher
Herkunft liegen. Die Säfte F, G sowie H stammen ebenfalls von einem Hersteller, wobei es
sich bei dem Saft F um einen Muttersaft und den Proben G und H um Säfte handelt, welche
aus Konzentrat hergestellt wurden und unterschiedliche Mindesthaltbarkeiten besitzen. Auch
bei den Konzentratsäften zeigt sich mit 27,6 bzw. 33,7 mmol TE/L ein deutlicher Unterschied
in der Höhe der antioxidativen Kapazität, welcher wiederum mit der Verwendung von
unterschiedlichen Beeren als Ausgangsmaterial erklärt werden könnte. Ein Vergleich
zwischen Muttersaft und Konzentratsaft (Saft F und H) zeigt keine nennenswerten
Unterschiede in der antioxidativen Aktivität.
Der Gesamtphenolgehalt der untersuchten Saftproben liegt zwischen 3911 und
5812 mg GAE/L (Abb. 1) und korreliert bei fast allen Proben sehr gut mit den Werten, die für
die antioxidative Aktivität gefunden wurden. So konnten zum Beispiel für die Säfte A und F
mit 5786 bzw. 5812 mg GAE/L hohe Werte für den Gesamtphenolgehalt und für die
antioxidative Aktivität (33,9 und 34,2 mmol TE/L) ermittelt werden, während die Säfte E und
G mit 4124 und 3911 mg GAE/L bzw. 26,8 und 27,6 mmol TE/L in beiden Fällen einen
deutlich niedrigeren Wert aufweisen. Lediglich bei den Saftproben D und H wäre aufgrund
der Höhe der TEAC-Werte (31,4 und 33,7 mmol TE/L) ein deutlich höherer
Gesamtphenolgehalt als 4078 bzw. 4368 mg GAE/L zu erwarten gewesen. Ein Grund für
diese Abweichung könnte in der Zusammensetzung liegen. Besitzt ein Saft einen
überdurchschnittlich hohen Gehalt an stark antioxidativen Verbindungen wie z.B.
Anthocyanen, so wirkt sich dieser positiv auf die Höhe des TEAC-Wertes aus, ohne dass
sich der Gesamtphenolgehalt erhöht. Abb. 1 zeigt die für die untersuchten Säfte erhaltenen
TEAC-Werte und Gesamtphenolgehalte. Bei einem Vergleich mit anderen Buntsäften
(Hillebrand, 2004) wird deutlich, dass Aroniasäfte ein außerordentlich hohes antioxidatives
Potential besitzen, welches vergleichbar ist mit dem von Heidelbeer- und Holundersäften.
Lediglich bei diesen drei Säften konnten im Rahmen des Screenings Werte von deutlich über
25 mmol TE/L ermittelt werden. Andere Buntsäfte wie Brombeer-, Preiselbeer- und
schwarzer Johannisbeersaft zeigten Werte zwischen 17,3 bis 25,3 mmol TE/L. Bei
Buntsäften wie Sauerkirsch-, Cranberry- oder Blutorangensaft wurden sogar Werte von unter
10 mmol TE/L analysiert. Im Allgemeinen besteht eine gute Korrelation zwischen der
antioxidativen Kapazität und dem Gesamtphenolgehalt, wobei aufgrund dieser beiden
Summenparameter im Allgemeinen keine Unterscheidung zwischen Muttersäften und
Konzentratsäften getroffen werden kann. Anhand von verschiedenen Holundersäften konnte
jedoch bereits von Hillebrand (2004) gezeigt werden, dass eine zu starke thermische
Belastung bei der Konzentratherstellung zu einer drastischen Reduktion des TEAC-Wertes
9
führen kann. Dieses konnte bei den im Rahmen dieser Studie untersuchten
Aroniakonzentraten nicht beobachtet werden.
Der „Monomerindex“ der untersuchten Proben schwankt zwischen 2,6 und 21,7 (Tab. 1).
Unter dem „Monomerindex“ versteht man das Verhältnis der freien monomeren Anthocyane
zu den polymeren Anthocyanen. Ein hoher „Monomerindex“ ist ein Zeichen für einen hohen
Gehalt an monomeren Anthocyanen. Es konnte bereits anhand von verschiedenen
Buntsäften gezeigt werden, dass durch enzymatische und nicht-enzymatische Reaktionen
die Gehalte an monomeren Anthocyanen während der Herstellung und Lagerung stark
abnehmen (Dietrich et al., 2003), wobei frisch hergestellte Säfte tendenziell einen höheren
monomeren Anthocyananteil aufweisen als gelagerte Säfte. Vergleicht man die einzelnen
Säfte miteinander, so wird deutlich, dass der Anteil an polymeren Pigmenten sehr stark
schwankt. Bemerkenswert ist hierbei, dass gerade die Konzentratsäfte G und H durch einen
sehr niedrigen Polymeranteil gekennzeichnet sind. Da diese Säfte von einem Hersteller
stammen, ist davon auszugehen, dass die Konzentrierung sehr schonend erfolgte und diese
zusätzliche thermische Belastung keinen negativen Einfluss auf die Qualität des
Endproduktes hat. Die Konzentratsäfte besitzen sogar im Vergleich zu den Muttersäften B
und C, welche mit 3,2 bzw. 2,6 einen außerordentlich niedrigen „Monomerindex“ aufweisen,
einen deutlich niedrigeren Polymeranteil. Lediglich der Muttersaft F besitzt mit 21,7 einen
höheren „Monomerindex“ als die beiden Konzentrate G und H. Bemerkenswert ist hierbei,
dass alle drei Proben (F bis H) von einem Hersteller produziert wurden. Betrachtet man den
Muttersaft F und die Saftkonzentrate G und H des Herstellers jedoch im direkten Vergleich,
so kann anhand dieses Beispiels sehr gut belegt werden, dass durch die zusätzliche
thermische Belastung einer Aufkonzentrierung eine verstärkte Polymerbildung eintritt.
1.11 Analyse von Anthocyanen, Chlorogensäuren und Quercetin-Derivaten
Die Gehalte an monomeren Anthocyanen, Chlorogensäuren sowie Quercetin-Derivaten
wurden mittels HPLC-DAD quantitativ bestimmt. Bei der Analyse der monomeren
Anthocyane wird deutlich, dass die Gehalte in einem Bereich von 341 bis 1163 mg/L starken
Schwankungen unterliegen, wobei gerade die Muttersäfte B, C, D und F sehr niedrige
Gehalte aufweisen. Aufgrund der Korrelation des „Monomerindex“ mit dem monomeren
Anthocyangehalt können Aussagen über die Frische bzw. Lagerdauer von Fruchtsäften
getroffen werden. Während der Lagerung von Säften nimmt der Anteil an polymeren
Anthocyanen zu, während der Gehalt an monomeren Pigmenten abnimmt. Die Muttersäfte B
und C zeigen genau diese Tendenz. Bei den Muttersäften C und F liegt der Sachverhalt
allerdings anders. Hier kann der niedrige Gehalt an monomeren Anthocyanen nicht mit einer
während der Lagerung fortschreitenden Polymerbildung erklärt werden, da gerade der
10
Muttersaft F einen sehr hohen „Monomerindex“ besitzt, woraus ein sehr niedriger
Polymeranteil abgeleitet werden kann. Hier liegt scheinbar schon während der Herstellung
ein niedriger Anthocyangehalt vor. Von besonderem Interesse ist die Betrachtung der
Konzentratsäfte G und H, welche mit Abstand die höchsten Anthocyangehalte (1163 bzw.
1060 mg/L) besitzen. Betrachtet man die Anthocyanzusammensetzung der vorliegenden
Säfte, so können ausschließlich Cyanidin-Derivate detektiert werden, wobei die Pigmente
Cyanidin-3-galactosid und Cyanidin-3-arabinosid als Hauptanthocyane sowie Cyanidin-3-
glucosid und Cyanidin-3-xylosid als Minorpigmente mittels ESI/MSn-Analytik charakterisiert
werden konnten. Abb. 2 zeigt bei einer Wellenlänge von 520 nm die für Aroniasäfte typische
Anthocyanzusammensetzung. Die Gehalte an Chlorogensäuren schwanken in den
vorliegenden Proben in einem Bereich von 490 bis 1412 mg/L, wobei die Muttersäfte A und
E mit 781 bzw. 490 mg/L die niedrigsten Chlorogensäuregehalte aufweisen. Die Muttersäfte
B-D und F hingegen zeigen mit 977-1149 mg/L einen nahezu identischen Gehalt an
Chlorogensäuren, obwohl die Säfte von unterschiedlichen Herstellern sind. Der
Konzentratsaft H enthält mit 1412 mg/L den mit Abstand höchsten Gehalt. Die ESI-MSn-
Untersuchung der Säfte zeigt, dass in allen Proben die 5-Caffeoylchinasäure
(Chlorogensäure) sowie die 3-Caffeoylchinasäure (Neochlorogensäure) in einem nahezu
identischen prozentualen Verhältnis (45:55) als Hauptverbindungen der Hydroxyzimtsäure-
Derivate vorliegen. In allen Säften konnten weiterhin bei einer Retentionszeit von 18,6 min
sehr geringe Mengen an 4-Caffeoylchinasäure (Kryptochlorogensäure) nachgewiesen
werden. Abbildung 2 zeigt bei 320 nm die für Aroniasäfte typische Zusammensetzung der
Chlorogensäuren. Die Gehalte an Quercetin-Derivaten schwanken ebenfalls in einem sehr
weiten Bereich (204 bis 656 mg/L). Die Muttersäfte A bis C zeigen einen eher niedrigen
Gehalt (204-315 mg/L), während in den Konzentratsäften G und H mit 656 bzw. 623 mg/L
die mit Abstand höchsten Werte an Quercetin-Derivaten nachgewiesen werden konnten.
Abbildung 2 zeigt bei 360 nm die Zusammensetzung der Quercetin-Derivate in Aroniasäften.
Neben Quercetin-3-rutinosid, Quercetin-3-galactosid und Quercetin-3-glucosid konnten die in
Früchten sehr selten vorkommenden Quercetin-Derivate Quercetin-3-robinobiosid und
Quercetin-3-vicianosid mittels ESI-MSn-Analytik charakterisiert werden.
Tabelle 2 fasst die Ergebnisse der quantitativen Bestimmung der Gehalte an monomeren
Anthocyanen, Chlorogensäuren sowie Quercetin-Derivaten und Tabelle 3 die Daten der
ESI/MSn-Analytik der phenolischen Hauptverbindungen zusammen.
1.12 Analyse von Proanthocyanidinen
Neben den Anthocyanen stellen die Procyanidine in Aronia melanocarpa die Hauptklasse
der phenolischen Verbindungen dar (Oszmianski und Wojdylo, 2005). Sie werden in drei
11
Gruppen eingeteilt: Monomere bestehen aus einer Einheit (+)-Catechin oder (-)-
Epicatechin, dimere bis oligomere Procyanidine aus 2-10 Monomereinheiten und polymere
Procyanidine aus mehr als 10 Einheiten. Die C4-Position der oberen Einheit ist mit der C6-
oder C8-Position der unteren Einheit verknüpft (Abb. 3). Bis jetzt konnten in Aronia
melanocarpa nur Proanthocyanidine vom B-Typ nachgewiesen werden, die aus (+)-
Catechin- und/oder (-)-Epicatechineinheiten aufgebaut sind, die sogenannten Procyanidine.
Galloylierte Verbindungen konnten nicht detektiert werden. Abb. 4 zeigt das HPLC-
Chromatogramm eines Aroniasaftes bei einer Wellenlänge von 280 nm und Abb. 5 das
ESI/MSn-Chromatogramm. In Aroniasäften konnten das Monomer (-)-Epicatechin, die
dimeren Procyanidine B1, B2, B7 und B5, das trimere Procyanidin C1 (EC-4β→8-EC-4β→8-
EC) und ein weiteres Trimer EC-4β→6-EC-4β→8-EC in Spuren mit Hilfe isolierter Standards
nachgewiesen werden, wobei der Gehalt an polymeren Procyanidinen sehr hoch ist. Die
Ergebnisse mittels der Phloroglucinolyse nach Kennedy und Jones (2001) zeigen, dass die
Polymere in Aronia melanocarpa aus bis zu 98,5% (-)-Epicatechin- und lediglich zu 1,5% (+)-
Catechineinheiten bestehen. Der Gehalt an polymeren Procyanidinen kann mit einer
modifizierten Methode nach Hammerstone et al. (1999) quantifiziert werden. Der
Polymergehalt der Aroniasäfte liegt zwischen 740,3 und 1693,3 mg/100g Trockengewicht
(Tr), wobei Saft F den höchsten Polymergehalt mit 1693,3 mg/100g Tr aufweist (siehe Tab.
4). Dieses Ergebnis korreliert mit dem mittleren Polymerisationsgrad (mean degree of
polymerisation, mDP). So hat Saft F den höchsten mittleren Polymerisationsgrad von 35. Mit
Hilfe der Bestimmung des Polymerisationsgrades konnten Aussagen über den Anteil an
Polymeren bei den verschiedenen kommerziell erhältlichen Säften getroffen werden. Die
Bestimmung des Polymerisationsgrades erfolgte aus einem zuckerfreien XAD-7 Extrakt. Zur
Ermittlung des mittleren Polymerisationsgrades wurden für die Bestimmung der terminalen
Einheiten (+)-Catechin und (-)-Epicatechin als Standards verwendet und für die oberen
Einheiten die Phloroglucinol-Addukte Catechin-(4α→2)-phloroglucinol und Epicatechin-
(4β→2)-phloroglucinol.
Die beiden Saftkonzentrate (Säfte G und H), die vom gleichen Hersteller wie Saft F
hergestellt wurden, haben einen um die Hälfte niedrigeren Polymergehalt von 818,4 bzw.
888,3 mg/100g Tr und der mDP liegt bei 19 bzw. 21,4. Der Muttersaft D zeigt ebenso einen
niedrigen Polymergehalt und einen niedrigen mDP von 20,5. Diese Ergebnisse deuten
darauf hin, dass der Saft D weniger schonend hergestellt wurde. Nach Oszmianski und
Wojdylo (2005) beträgt der mDP in Muttersäften 23 und der Polymergehalt beträgt in
Aroniasäften 1579 mg/100g Tr. Betrachtet man den Muttersaft F und die Saftkonzentrate G
und H im direkten Vergleich, so kann vermutet werden, dass im Zuge der Verarbeitung die
Strukturen der polymeren Proanthocyanidine durch die thermische Behandlung unter
Säureeinfluss (hier die Phenolsäuren) zerstört werden. Aus Proanthocyanidinen entstehen
12
niedermolekulare Procyanidine und farbige Anthocyanidine (Haslam, 1989, Scalbert et al.,
2000), so kann auch der höhere Gehalt an Anthocyanen in den Saftkonzentraten G und H
(1163 mg/L und 1060 mg/L) im Vergleich zum Muttersaft F (485 mg/L) erklärt werden.
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die untersuchten Muttersäfte tendenziell
(Ausnahme: Saft D) einen höheren Polymergehalt als Saftkonzentrate aufweisen.
Eine Schnellmethode zur „semiquantitativen“ Bestimmung der Polymere stellt der Bate-
Smith-Assay dar (Bate-Smith, 1953 und 1977, Porter et al., 1986). Die erhaltenen Werte für
den Polymergehalt mittels Butanolyse sind um das 3-4 fache höher als nach der
modifizierten HPLC-Methode, da nach der photometrischen Methode andere Verbindungen
mit erfasst werden. Auch die mit dieser Methode ermittelten Ergebnisse stehen im Einklang
mit denen der HPLC-Methode. Es konnte gezeigt werden, dass Saft F nach der
Durchführung dieser Bestimmung ebenfalls den höchsten Gehalt an Polymeren mit 10630
mg/L aufweist.
Danksagung
Dieses Vorhaben wurde aus den Mitteln des Bundesministeriums für Bildung und Forschung
(BMBF) gefördert (Projekt Nr. 0313828C).
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15
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Antioxidative Aktivität und Gesamtpolyphenolgehalt einiger kommerzieller
Aroniasäfte.
Abb. 2: HPLC-Chromatogramm eines Aroniasaftes zur Bestimmung der monomeren
Anthocyane, Chlorogensäuren und Quercetin-Derivate bei 520 nm, 320 nm und 360 nm
(Peakzuordnung vgl. Tab. 3).
Abb. 3: Strukturen der C4-C8 und C4-C6 verknüpften dimeren Procyanidine vom B-Typ.
Abb. 4: HPLC-Chromatogramm eines Aroniasaftes zur Ermittlung des Polymeranteils
bei 280 nm
Abb. 5: Basis-Peak-Chromatogramm eines Aroniasaftes zur Bestimmung der
niedermolekularen Procyanidine
33,7
27,6
34,2
26,8
31,4
31,2
32,6
33,9
0 10 20 30 40
Saft H
Saft G
Saft F
Saft E
Saft D
Saft C
Saft B
[mmol TE/ L]
4368
3911
5812
4124
4078
5390
5288
5786
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000
Saft H
Saft G
Saft F
Saft E
Saft D
Saft C
Saft B
[mg GAE/ L]
Abb. 1
16
Abb. 2
O
O
OH
OH
OH
HO
OOH
OH
HO
OH
HO
O
OH
HO
OH
HO
OH
OH
OH
R
1
R
2
R
1
R
2
R
1
R
2
R
1
R
2
44
86
(+)-Catechin: R1= H, R2= OH
(-)-Epicatechin: R1= OH, R2= H
Abb. 3
17
Abb. 4
Abb. 5
18
Tab.1: Monomerindex.
Monomerindex
Saft A 5,1
Saft B 3,2
Saft C 2,6
Saft D 7,9
Saft E 6,3
Saft F 21,7
Saft G 8,2
Saft H 12,9
Tab. 2: Quantitative Bestimmung des Gehaltes an Anthocyanen, Chlorogensäuren und
Quercetin-Derivaten in verschiedenen Aroniasäften mittels HPLC-DAD.
Anthocyane1
[mg/L]
Chlorogensäuren2
[mg/L]
Quercetin-Derivate3
[mg/L]
Saft A 943 781 315
Saft B 514 1149 217
Saft C 341 1095 204
Saft D 577 1036 536
Saft E 808 490 483
Saft F 485 977 525
Saft G 1163 983 656
Saft H 1060 1412 623
berechnet als: 1 Cyanidin-3-glucosid, 2 5-Caffeoylchinasäure, 3 Quercetin-3-rutinosid
Tab. 3: ESI/MSn-Daten der in handelsüblichen Aroniasäften vorliegenden phenolischen
Hauptverbindungen
Peak1Verbindung Rt2
(min)
[M+]
(m/z)
[M-H]-
(m/z)
Fragmente
(m/z)
1 Cyandin-3-galactosid 21,7 449 287
2 Cyanidin3-glucosid 24,1 449 287
3 Cyanidin-3-arabinosid 27,0 419 287
4 Cyanidin-3-xylosid 34,7 419 287
5 Neochlorogensäure (3-CQA) 10,8 353 191, 179, 1353
6 Chlorogensäure (5-CQA) 17,4 353 191, 179, 1613
7 Kryptochlorogensäure (4-CQA) 18,6 353 191, 179, 173,
1353
8 Quercetin-3-vicianosid437,0 595 301
9 Quercetin-3-robinobiosid538,9 609 301
10 Quercetin-3-rutinosid639,9 609 301
Quercetin-3-galactosid 39,9 463 301
11 Quercetin-3-glucosid 41,1 463 301
19
1 Peakzuordnung vgl. Abb. 2, 2 Retentionszeit des HPLC-Chromatogrammes vgl. Abb. 2,
3 analog dem Fragmentierungsmuster nach Clifford et al. (2003), 4 Quercetin-3-O-[6``-O-β-
arabinosyl-β-glucosid], 5 Quercetin-3-O-[6``-O-α-rhamnosyl-β-galactosid], 6 Quercetin-3-O-
[6``-O-α-rhamnosyl-β-glucosid]
Tab. 4: Ergebnisse der Charakterisierung der Polymerfraktion.
[mg/100 g] Tr1mDP [mg/L]2
Saft A - - 5771
Saft B - - 6739
Saft C - - 6688
Saft D 740,3 20,5 5530
Saft E 1149,3 30,5 6910
Saft F 1693,3 35 10630
Saft G 818,4 19 5420
Saft H 888,3 21,4 6580
1 Quantifizierung des Polymeranteils auf der Normalphase (siehe unter 2.7)
2 Quantifizierung des Polymeranteils mittels Butanolyse (siehe unter 2.5)
20
... The first cyanidin derivative was identified as cyanidin-3,5-hexoside-(epi)catechin und the second as cyanidin-3-pentoside-(epi)catechin [18]. In addition, cyanidin-3-glucoside with the [M-H] + molecular ion at m/z 449, cyanidin-3-arabinoside with the [M-H] + molecular ion at m/z 419, and cyanidin-3-xyloside [M-H] + molecular ion at m/z 419 were identified as described in the literature [18][19][20]. The main copigment of aronia NFC was 3-caffeoylquinic acid (neochlorogenic acid, m/z 353) together with 5-caffeoylquinic acid (chlorogenic acid), and 4-caffeoylquinic acid (cryptochlorogenic acid). ...
Article
Full-text available
An activity-guided search for compounds influencing glucose metabolism in extracts from aronia (Aronia melanocarpa, A.), pomegranate (Punica granatum L., P.), and red grape (Vitis vinifera, RG) was carried out. The three extracts were fractionated by means of membrane chromatography to separate the anthocyanins from other noncolored phenolic compounds (copigments). In addition, precipitation with hexane was performed to isolate the polymers (PF). The anthocyanin and copigment fractions (AF, CF) of aronia, pomegranate, and red grape were furthermore fractionated with high-performance countercurrent chromatography (HPCCC) and the subfractions were characterized by HPLC-PDA-MS/MS analyses. Each of the (sub-)fractions was examined by in vitro-tests, i.e., the inhibition of the activity of α-amylase and α-glucosidase. On the basis of this screening, several potent inhibitors of the two enzymes could be identified, which included flavonols (e.g., quercetin), ellagitannins (e.g., pedunculagin), and anthocyanins (e.g., delphinidin-3-glucoside and petunidin-3-glucoside). In the α-glucosidase assay all of the examined fractions and subfractions of the fruit extracts were more active than the positive control acarbose.
Article
Aronia melanocarpa is a rich source of phenolic compounds like anthocyanins, chlorogenic acids, quercetin derivatives, and proanthocyanidins possessing strong antioxidative potential. The consumption of A. melanocarpa is actually increasing because of the known bioactivity of its phenolic constituents. A. melanocarpa extracts are used as natural colorants and nutraceuticals. Several attempts of adulteration of aronia products have already been reported. In this study, we investigated changes in phenolic composition from berry to juice by HPLC‐PDA, and HPLC‐ESI‐MSn analyses as well as fingerprint profiles for authentication of commercially available aronia products in order to detect possible adulteration. Additionally, the radical scavenging activity of aronia products was determined by using the TEAC (Trolox® equivalent antioxidant capacity) assay. Aronia pomace, a valuable by‐product of juice production, showed the highest phenolic content and possessed the highest radical scavenging activity.
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