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Uso de las proteínas de reserva de megagametofito como marcador de la diversidad genética en Abies pinsapo.

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El pinsapo (Abies pinsapo Boiss.) se localiza exclusivamente en el sur de España, en las comarcas de Cádiz y Málaga, donde ocupa unas 5.000 ha. Diversos factores como la presencia de plagas y el decaimiento de las masas, de origen aún no determinado, hacen temer por el futuro de la especie. A todo ello hay que sumar la circunstancia de que es posible que se esté produciendo un estrechamiento de la base genética de la especie, debido a problemas de consanguinidad y deriva genética. Por esta razón, el desarrollo de una estrategia de conservación de la especie exige la evaluación de su diversidad genética. En este estudio, se han analizado la posibilidad de utilizar las proteínas del megagametofito de pinsapo como marcador de la diversidad genética de las masas de esta especie. La fracción albúminas ha mostrado la existencia de polimorfismo. Un análisis preliminar efectuado en 27 árboles, permitió identificar más de 41 bandas de las que, al menos 12 son polimórficas entre árboles y 8 dentro de árboles. Este resultado permite ser optimista sobre la posibilidad de emplear este marcador con la finalidad señalada.
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USO DE LAS PROTEÍNAS DE RESERVA DEL
MEGAGAMETOFITO COMO MARCADOR DE LA
DIVERSIDAD GENÉTICA EN ABIES PINSAPO
María Ángela Martín Cuevas, Luis Miguel Martín Martín y Juan Bautista Álvarez Cabello
Departamento de Genética, Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos y de Montes. Edificio
Gregor Mendel, Campus de Rabanales. Universidad de Córdoba. E-14071-CÓRDOBA (España). Correo
electrónico: jb.alvarez@uco.es
Resumen
El pinsapo (Abies pinsapo Boiss.) se localiza exclusivamente en el sur de España, en las comar-
cas de Cádiz y Málaga, donde ocupa unas 5.000 ha. Diversos factores como la presencia de plagas
y el decaimiento de las masas, de origen aún no determinado, hacen temer por el futuro de la espe-
cie. A todo ello hay que sumar la circunstancia de que es posible que se esté produciendo un estre-
chamiento de la base genética de la especie, debido a problemas de consanguinidad y deriva
genética. Por esta razón, el desarrollo de una estrategia de conservación de la especie exige la eva-
luación de su diversidad genética. En este estudio, se han analizado la posibilidad de utilizar las pro-
teínas del megagametofito de pinsapo como marcador de la diversidad genética de las masas de esta
especie. La fracción albúminas ha mostrado la existencia de polimorfismo. Un análisis preliminar
efectuado en 27 árboles, permitió identificar más de 41 bandas de las que, al menos 12 son polimór-
ficas entre árboles y 8 dentro de árboles. Este resultado permite ser optimista sobre la posibilidad de
emplear este marcador con la finalidad señalada.
Palabras clave: Conservación, Variabilidad, Albúminas, Megagametofito
INTRODUCCIÓN
Las proteínas de reserva forman parte de las
semillas de todas las especies vegetales y se acu-
mulan en las últimas fases de maduración de las
mismas. El papel biológico de estas proteínas es
ser fuente de aminoácidos para los procesos de
síntesis que tienen lugar durante la germinación.
Esto ha propiciado que estos genes estén repeti-
dos y sean neutros frente a la evolución, lo que
conlleva la posibilidad de un amplio nivel de
variación y que puedan considerarse representa-
tivos de la variabilidad genética en su conjunto.
Una de sus principales características es que
son marcadores codominantes y presentan un alto
nivel de polimorfismo, suponiendo una gran venta-
ja frente a otros marcadores debido a su fácil análi-
sis y su relativo bajo coste; además, hay que añadir
su estabilidad frente los factores ambientales. Por
todo ello, se consideran un marcador muy valioso
para el estudio de la diversidad genética, ya que
además existe un número considerable de genes
implicados en dichas funciones (GEPTS, 1990).
Existe una cierta experiencia en la utiliza-
ción de este marcador en especies forestales,
tanto en frondosas (ÁLVAREZ et al., 2003;
MARTÍN et al., 2005) como en coníferas (ÁLVA-
REZ et al., 2004), que ha demostrado ser un buen
marcador de la diversidad genética. Además, en
el caso de las coníferas, el uso de estas proteínas
63ISSN: 1575-2410
© 2008 Sociedad Española de Ciencias Forestales
Cuad. Soc. Esp. Cienc. For. 24: 63-66 (2008) «Actas de la IV Reunión sobre Genética Forestal»
para estudios de variabilidad viene facilitado por
la naturaleza haploide del megagametofito.
El pinsapo (Abies pinsapo Boiss.) es una
especie endémica del Sur de la Península Ibérica,
cuya área de distribución está muy restringida.
En la actualidad sólo forma bosques importantes
en el Parque Natural de la Sierra de las Nieves y
en la Reserva Natural de los Reales de Sierra
Bermeja en la provincia de Málaga y en el
Parque Natural de Grazalema en la de Cádiz. De
hecho, con el fin de asegurar su conservación y
protección, estos enclaves han sido declarados
“Reservas de la Biosfera” por la UNESCO.
Existen diversos problemas que hacen temer
por el futuro de la especie como el cambio climá-
tico, la presencia de plagas, la baja producción de
polen y el decaimiento de las masas, de origen
aún no determinado (PASCUAL et al., 1993;
ARISTA et al., 1997). A todo ello hay que sumar
la circunstancia de que es posible que se esté pro-
duciendo un estrechamiento de la base genética
en algunas poblaciones de la especie, debido a
problemas de consanguinidad y deriva genética.
El desarrollo de un programa de conserva-
ción hace necesaria la evaluación de la diversi-
dad genética de la especie. En este estudio, se ha
analizado la posibilidad de utilizar las proteínas
del megagametofito de pinsapo con la finalidad
de determinar el nivel de diversidad genética aún
conservada en las masas actuales de pinsapo.
MATERIAL Y MÉTODOS
Para el estudio se seleccionaron 27 árboles
distribuidos a lo largo de los tres enclaves cita-
dos. Estos árboles fueron georreferenciados
mediante sus coordenadas geográficas obtenidas
con GPS y apoyado por un esquema de campo
que permitió situarlos con total precisión. Dada
la disposición apical de los conos, estos fueron
recolectados con una pértiga en los árboles de
menor altura; mientras que, en los de mayor altu-
ra, fueron operarios de la Consejería de Medio
Ambiente de la Junta de Andalucía los encarga-
dos de su recolección (Figura 1). Se tomaron
entre 2 y 3 conos por árbol ante la previsible baja
fertilidad de la especie; de hecho, el número de
piñones útiles obtenidos no superó el 10% de los
recolectados en la mayoría de los árboles.
Se analizaron 10 megagametofitos maduros
por cada árbol (Tabla 1). En una primera fase,
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M.A. MARTÍN CUEVAS et al. «Uso de las proteínas de reserva del megagametofito como marcador de la diversidad genética en Abies pinsapo»
Localización Latitud (N) Longitud (O) Altitud (msnm) Nº árboles
P.N. Sierra de las Nieves 36º 39’– 36º 43’ 4º 58’- 5º 02’ 1110-1570 14
R.N. Reales de Sierra Bermeja 36º 29’ 5º 12’ 1120-1440 8
P.N. Grazalema 36º 46’ 5º 25’ 1000-1050 5
Tabla 1. Localización y número de árboles seleccionados para el estudio
Figura 1. Muestra del sistema de recolección según la altura de los árboles
las cubiertas y el eje embrionario de cada piñón
fueron retirados antes de proceder a la extrac-
ción de las proteínas. Las muestras fueron mol-
turadas y transferidas a un vial de microfuga de
1.5 ml.
La extracción de proteínas se realizó según
el método de extracción secuencial descrito por
FONSECA et al. (1997) y ensayado con éxito en
alcornoque. La separación de las proteínas se
realizó mediante geles de poliacrilamida en con-
diciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) según
el método de tampón discontinuo de LAEMMLI
(1970). Los geles fueron realizados en un siste-
ma de electroforesis vertical en placa de
140x140x1,5 mm. La electroforesis fue llevada
a cabo a intensidad constante (30 mA por gel) y
18ºC de temperatura. Los geles fueron teñidos
con una solución de ácido tricloroacético al
12%, etanol al 5% y azul brillante de Coomassie
R-250 al 0,001%.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
De las cuatro posibles fracciones a obtener
según el proceso de extracción secuencial, esto
es, albúminas, globulinas, prolaminas y gluteli-
nas, en este estudio se ensayaron las dos prime-
ras. Los análisis mostraron que, si bien en otras
especies de Gimnospermas se han usado las glo-
bulinas para este tipo de estudios (ÁLVAREZ et
al., 2004); en el caso del pinsapo, fueron las
albúminas las que mostraron una mejor resolu-
ción. No obstante, dada la complejidad inicial
del proteinograma, se procedió al ajuste del pro-
tocolo inicial de FONSECA et al. (1996) a las
características concretas del megagametofito de
pinsapo. El ajuste permitió una mayor limpieza
del gel y una delimitación más clara de las ban-
das, lo que permitió incluso la separación de
bandas muy próximas de forma conspicua. A
esto hay que añadir que esta fracción mostró un
alto nivel de variación, por lo que se escogió
para efectuar el análisis de los 27 árboles selec-
cionados.
Se ensayaron distintas concentraciones de
poliacrilamida (8%, 10% y 12%) para los geles
de electroforesis con el fin de ajustarlos a una
mayor resolución, siendo los geles con una con-
centración del 12% de poliacrilamida, los que
mostraron los mejores resultados (Figura 2). Los
geles fueron divididos en zonas usando para ello
un marcador de peso molecular conocido; en el
caso de los geles al 12%, las zonas obtenidas
fueron cinco, clasificadas como A (por encima
de 66 KDa), B (entre 66 y 45 KDa), C (entre 45
y 30 KDa), D (entre 30 y 20 KDa) y E (por
debajo de 20 KDa). El mayor porcentaje de
variación se detectó en las zonas B, C y D
(Figura 2).
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Cuad. Soc. Esp. Cienc. For. 24: 63-66 (2008) «Actas de la IV Reunión sobre Genética Forestal»
Figura 2. Muestra representativa de la variabilidad encontrada para la fracción albúminas en los árboles analizados.
Los recuadros muestran ejemplos del polimorfismo encontrado. M = marcador de peso molecular; A-B, zonas marca-
das en el gel en base al marcador empleado (ver texto)
En las descendencias de los árboles de cada
enclave estudiados se han identificado, al
menos, 41 bandas distintas; de las cuales, al
menos, 12 fueron polimórficas entre árboles y 8
dentro de árboles. En la figura 2 se muestran los
resultados obtenidos para dos de estos árboles,
donde puede observarse la presencia de poli-
morfismo, marcados por recuadros en la figura.
Por otra parte, aunque el número de árboles
empleado es pequeño para poder sacar conclu-
siones sobre la distribución de la diversidad
entre los distintos enclaves, fue el pinsapar del P.
N. de la Sierra de las Nieves el que mostró el
mayor porcentaje de bandas polimórficas, mien-
tras que la menor variación se detectó en el de la
R. N. de los Reales de Sierra Bermeja.
En conclusión, este resultado permite ser
optimista sobre la posibilidad de emplear este
marcador con la finalidad antes señalada, dado el
nivel de variación detectado para la fracción
albúminas.
Agradecimientos
Los autores quieren expresar su agradeci-
miento a la Dirección General de Gestión del
Medio Natural (Consejería de Medio Ambiente,
Junta de Andalucía) por la autorización para
recolectar material en los pinsapares andaluces.
También queremos agradecer a D. José López
Quintanilla y a los técnicos de las Delegaciones
de la Consejería de Medio Ambiente de Cádiz y
Málaga por su inestimable ayuda durante la
recolección.
BIBLIOGRAFÍA
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M.A. MARTÍN CUEVAS et al. «Uso de las proteínas de reserva del megagametofito como marcador de la diversidad genética en Abies pinsapo»
... (castaño) (Álvarez et al. 2003(Álvarez et al. , Martín et al. 2005, Quercus ilex L. (encina) (Martín et al. 2009), Pinus pinea L. (pino piñonero) (Álvarez et al. 2004) y Abies pinsapo Boiss. (pinsapo) (Martín et al. 2008(Martín et al. , 2010. ...
Article
Full-text available
The Nothofagus genus (Nothofagaceae) in Chile includes 12 species and some hybrids among them. Some of these species are seriously threatened, presenting a low distribution and high genetic erosion. In this study a molecular marker based on seed storage proteins Nothofagus sp. was developed. Seed samples of Nothofagus alessandrii and N. glauca from two locations in southern Chile were analysed for each species. Among the different fractions of seed proteins (albumins, globulins, prolamins and glutelins) analyzed, the glutelins showed the best results, presenting conspicuous bands. Up to 39 bands were detected in both species; 22 in N. alessandrii (including 14 polymorphic) and 26 in N. glauca (21 polymorphic), with seven of them common to both species. There was a clear difference between the protein profiles of both species; we detected a preliminary value of genetic diversity in N. glauca greater than in N. alessandrii. These results, although preliminary, suggest that this marker could be useful for assessing genetic diversity in the Nothofagus genus.
... (castaño) (Álvarez et al. 2003(Álvarez et al. , Martín et al. 2005, Quercus ilex L. (encina) (Martín et al. 2009), Pinus pinea L. (pino piñonero) (Álvarez et al. 2004) y Abies pinsapo Boiss. (pinsapo) (Martín et al. 2008(Martín et al. , 2010. ...
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El género Nothofagus (Nothofagaceae) comprende 12 especies y algunos híbridos entre las mismas. Algunas de estas especies se encuentran seriamente amenazadas, presentando una distribución reducida y una gran erosión genética. En este estudio fue desarrollado un marcador molecular basado en las proteínas de reserva de la semilla de especies del género Nothofagus. Para ello se tomaron muestras de semilla de dos especies del género, N. alessandrii y N. glauca. De las diferentes fracciones de proteínas de la semilla (albúminas, globulinas, prolaminas y glutelinas), las glutelinas mostraron los mejores resultados al presentar bandas más conspicuas. Hasta 39 bandas fueron detectadas entre las dos especies, 22 en N. alessandrii (14 de ellas polimórficas) y 26 en N. glauca (21 polimórficas), siendo siete de ellas comunes a ambas especies. Se encontró una clara diferencia entre los perfiles proteicos de ambas especies, detectándose mayor diversidad genética en N. glauca que en N. alessandrii. Aunque estos resultados son preliminares, sugieren que este marcador podría ser útil para la evaluación de la diversidad genética en especies del género Nothofagus.
... Our future goal, whenever funding will be available, would be to address the above studies using genetic markers as seed storage proteins and SSRs. Indeed, the former have been used as an estimator of the genetic di versity in forest species (Álvarez et al. 2003, Álvarez et al. 2004, Martín et al. 2005, Martín et al. 2008) and in the case of co nifers this technique is particularly favou rable, given the haploid nature of the reserve tissue. ...
Article
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Araucaria araucana, a southern South American tree species, is considered a representative symbol of Chilean forest biodiversity due to its endemicity and longevity. An expedition to Chile and its border zone with Argentina was carried out with the aim of determining the current state of this species and to establish a tree network to study its genetic variability. Eight locations were selected across the range of distribution of the species and several experimental plots were established based on the heterogeneity within each location. Field trips revealed a high fragmentation in Araucaria forests showing low or non-existent regeneration in most of its distribution area. Experimental plots allowed the identification of severely altered areas. Moreover, 371 trees were catalogued, 193 males and 178 females. The tree network established will be very useful in future evaluations of both the ecological status of the species and its genetic resources, allowing the development of conservation strategies.
Article
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Stone pine (Pinus pinea L.) is a Mediterranean species of interest for the traditional use of his edible kernel. Its area of distribution includes all the Mediterranean area, including the Iberian Peninsula where this tree presents the most extensive natural stands. Since land reforestation has become a high-priority of European policy, there is an increased interest in the characterisation of the germplasm of this species. In this study, the globulins from the megagametophyte were used for analysis of the variability and genetic diversity in 20 populations from Andalucia. Because of the complex profile, these proteins were analysed as blocks, corresponding each to a different range of molecular weight. Polymorphisms were observed in each of the five blocks. The diversity data showed that these populations present a high degree of variation, which suggest that this technic could be useful to analyse of the genetic diversity in this species.
Article
The storage seed proteins have shown to be a useful tool in the evaluation of the genetic variability in those species where these techniques have been employed. Sweet chestnut (Castanea sativa) is a European species cultivated both for wood and for fruit since ancient times in the Mediterranean region. These uses imply that some stands have seed origin while other ones come from graft. The existence of both reproductive systems together with the marginal use of this species' has complicated the knowledge of its genetic diversity that has been scarcely studied. In this study' the usefulness of the cotyledon storage proteins as marker of the genetic diversity in C. sativa has been analysed. Cotyledon storage proteins were extracted by sequential procedures' where albumins and globulins were obtained separately. The addition of reduction (dithiothreitol) and alkylation (4-vinilpiridine) agents was essential for a clear resolution in the identification of the different bands. Each protein fraction was characterized by electrophoresis in polyacrylamide gels. The evaluated samples were highly polymorphic for the albumins located between the molecular masses 30 and 14 kDa and the adequate gel concentration for the analysis resulted to be 12%. For this reason' we consider that this method of analysis of the nut storage proteins could be an useful tool for the evaluation of genetic diversity in this and other species of Fagaceae.
Article
A study on the extraction and characterization of the cotyledonary proteins from cork oak (Quercus suber L.) seeds is reported. The seed proteins, which constitute approximately 5% of the seed weight, are glutelins on the basis of solubility criteria. They are readily solubilized in sodium borate buffer, pH 10, 50 mM, containing 1% (v/v) β-mercaptoethanol and 1% (w/v) sodium dodecyl sulfate. This fraction is made up of a large number of polypeptides with molecular masses ranging from 10 to above 100 kDa and occurs in the form of large aggregates. The level of glycosylation is low, with two main glycopolypeptides present (43 and 65 kDa). However, the major polypeptides are not glycosylated. In vitro digestibility studies indicated that trypsin and α-chymotrypsin produce a partial proteolysis of the cotyledonary proteins, particularly among the larger molecular mass polypeptides. The partial proteolysis seen in trypsin digests is not due to the presence of enzyme inhibitors in the seeds. On the other hand, pepsin almost completely digests the seed proteins. Taken together, these results may be considered as a good indication of the potential nutritional quality of the proteins from Q. suber seeds. Keywords: Cork oak; glutelin; in vitro proteolysis; protein; Quercus suber; seed
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This study has been to analyse the useful nut globulin proteins as a marker of the genetic diversity in Castanea sativa. The evaluated populations were highly polymorphic for the globulins, being detected up to 35 polymorphic bands with a wide distribution among all the evaluated populations. Taken together for populations from all the chestnut regions, about 39.3% of total allelic variation was distributed among the populations. The estimates of genetic similarity between populations were clearly associated with the collecting site. This method of analysis of the nut storage proteins (globulins) could be a useful tool for the evaluation of genetic diversity in this and other species of the Fagaceae.
Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4
  • P Gepts
GEPTS, P.; 1990. Genetic diversity of seed storage proteins in plants. In: A.H.D. Brown, M.T. Clegg, A.L. Kahler & B.S. Weir (eds.), Plant population genetics, breeding and genetic resources: 64-82. Sinauer Associates Inc Publishers. Suderland, Massachusetts. LAEMMLI, U.K.; 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685.
Biología del pinsapo
  • M Arista
  • F J Herrera
  • S Talavera
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