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Caracterización biológica empleando células osteobláticas de vidrios del sistema SiO2. Na2O. CaO. K2O. MgO. P2O5. Modificados con Al2O3 y B2O3.

Authors:
  • Universidad Internacional de Valencia

Abstract

One of the most revolutionary trends of the past four decades should be named the innovative use of specials ceramics designed to reproduce different function of living organisms. Ceramics used for these purposes are defined as bioceramics. In this category we find bioactive glasses of SiO2.Na2O.CaO.K2O.MgO.P2O5 system that show the capacity of chemical bonding between bone and this material. AI2O3 and B2O3 have been used in bioactive glasses to modify its surface dissolution and durability. However, Al2O3 in contrast to B2O3 can inhibit bone bonding, being the acceptable amount of alumina a function of glass composition. In the present work were evaluated glasses of SiO2.Na2O.CaO.K2O.MgO.P2O5 system, modified by a variable amount of Al2O3and B2O3. Our results showed alkalinization of culture medium. Therefore, the pH and glass composition could affect the cellular viability of the osteoblast; especially when the bioactive glass contained 1% alumina with 0% B2O3 in the composition. Whereas the glass contained 1.5% alumina combined with 1% B2O3 looks to enhances the adhesion and proliferation of the bone cells. Those results suggest that the assayed bioactive glasses could be used as coating materials for orthopedic and dental implant.
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Revista Latinoamericana de Metalurgia
y
Materiales, Vol.23 N°1, 82 - 88
CARACTERIZACIÓN BIOLÓGICA EMPLEANDO CÉLULAS
OSTEOBLÁSTICAS DE VIDRIOS DEL SISTEMA
Si02·Na20.CaO.K20.MgO.P205"MODIFICADOS CON Al20
3
YB20
3'
K. Noris Suarez', 1 Barrios de
Arenas',
M. Vasquez", Y. Baron",
l.
Atlas',
J.
Bermudez'', C. Morillo
3,
Y. Olivares' y
J.
Lira"
1. Departamento de Biología Celular, Universidad Simón Bolívar, Aptdo. Postal 89000, Sartenejas,
Caracas 1080. Venezuela. E-mail: knoris@usb.ve
2. Lab. de Microscopia Electrónica, Dpto. de Tecnología de Materiales,
1.
U.T., Región Capital, P.
O.
Box 4037, Caracas 1040. Venezuela. E-mail: fredaren@telcel.net.ve
3. Dpto. de Tecnología de los Materiales, Universidad Simón Bolívar, Aptdo. Postal 89000, Sartenejas,
Caracas 1080. E-mail: jlira@usb.ve
Resumen.
Desde hace al menos cuatro décadas se han ido desarrollando materiales cerámicos que permiten reproducir funciones de los
organismos vivos, entre los que se destacan los vidrios denominados bioactivos. Definidos así, por su capacidad de proporcio-
nar una respuesta biológica específica en la interfase del material que resulta en la unión química entre el material y el tejido óseo.
En el presente trabajo se evaluó la compatibilidad de cinco biovidrios del sistema Si02.Nap.CaO.Kp.MgO.PP5 modificados
por adiciones de A1P3 y/o B203, empleando células osteoblásticas derivadas de calvaria. Se encontró que el pH del medio de
cultivo se hacía alcalino en presencia de los vidrios.en comparación con los controles, para todas las composiciones ensayadas.
Se demostró también que la viabilidad celular es afectada de forma drástica cuando el vidrio contiene 1% de alúmina (composi-
ción VI), mientras que la combinación de A~O/B203 en una relación igual a 0,66 (1% y 1,5%, respectivamente) parece favorecer
la adhesión y proliferación celular, así corno la deposición de Ca, sobre la superficie del material (composición V5). En conclusión,
los resultados obtenidos sugieren que algunas de las composiciones estudiadas presentan las características de biocompatibilidad
esperadas, previendo un uso efectivo de estos biovidrios como revestimiento para implantes rígidos.
Palabras Claves: Bioactividad, Osteoblastos, Alúmina, Microscopía Electrónica, Fluido Simulado de Plasma (FSP).
Abstraet.
One of the most revolutionary trends of the past four decades should be named the innovative use of specials cerarnics
designed to reproduce different function of li ving organismo Ceramics used for these purposes are defined as bioceramics. In this
category we find bioactive glasses of Si02.Nap.CaO.Kp.MgO.PP5 system that show the capacity of chemical bonding
between bone and this material. AIP3 and B203 have been used in bioactive glasses to modify its surface dissolution and
durability. However, Al203 in contrast to
BP3
can inhibit bone bonding, being the acceptable amount of alumina a function of
glass composition. In the present work were evaluated glasses of Si02.Nap.CaO.~O.MgO.Pp5system, modified by a variable
amount of A1203and
BP3'
Our results showed alkalinization of culture medium. Therefore, the pH and glass composition could
affect the cellular viability of the osteoblast; especially when the bioactive glass contained 1%alumina with 0%
BP3
in the
composition. Whereas the glass contained 1.5% alumina combined with 1% BP3looks to enhances the adhesion and proliferation
of the bone cells. Those results suggest that the assayed bioactive glasses could be used as coating materials for orthopedic
and dental implant.
Palabras Claves: Bioactivity, Osteoblast, Alumina, Electron Mlcroscopy, Simulated Body Fluid (SBF).
K. Noris Suare:
y
eo!.! Revista Latinoamericana de Metalurgia
y
Materiales.
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1.Introducción:
El empleo de cerámicas especialmente diseñadas para
reproducir diferentes funciones de los organismos vivos, es
una de las más revolucionarias tendencias de las pasadas
cuatro décadas en la evolución de estos materiales. [1]
Las cerámicas usadas para estos propósitos reciben el
nombre de "biocerámicas", las cuales pueden ser entre otras,
vidrios o vitrocerámicas bioactivas. Adicionalmente, los di-
ferentes tipos de materiales relacionados can la medicina
pueden ser clasificados como biotóxicos, cuando causan
atrofia, cambios patológicos o rechazo del tejido vivo cerca
del material como resultado de un proceso químico, galváni-
co u otro tipo; bioinertes, cuando coexisten con el material
sin cambios notables ni separación del material por una capa
de tejido fibroso; bioreabsorbible, cuando este se disuelve
gradualmente por el sistema biológico del organismo, sien-
do reemplazado por el propio tejido, sin que se presente
toxicidad o rechazo; ybioactivo; cuando el material propor-
ciona una respuesta biológica específica en la interfase de
este, que resulta en la unión.del material y los tejidos [1, 2],
tal es el caso de los biovidrios.
En la cirugía reconstructiva, la reparación de defectos de
los huesos largos constituye el principal problema. Mien-
tras que el empleo de injertos autólogos, ha sido la técnica
más ampliamente recomendada, presenta una serie de in-
convenientes, que incluye la morbilidad del área de dona-
ción, limitada cantidad de hueso donado, así como diferen-
tes problemas anatómicos y estructurales. Otra alternativa
es el uso de aloinjertos pero presentan el inconveniente de
rechazo, por la respuesta inmunológica, así como un mayor
riesgo de transmisión de enfermedades. Todo ello ha dado
como resultado que en los últimos años la atención se haya
dirigido hacia el uso de materiales sintéticos para el diseño
de implantes.
Durante las dos últimas décadas, el desarrollo de nuevas
tecnologías para implantes se ha orientado a la creación de
interfaces activas entre el implante y el tejido, desarrollando
el concepto de materiales bioactivos [3]. Dentro de esta im-
portante categoría se encuentran un amplio rango de cerá-
micas fosfatadas (Ca-P), vidrios bioactivos (VB) y
vitrocerámicas bioactivas [4,5]. Todos estos materiales po-
seen la característica común de generar una capa de
hidroxiapatita carbonada equivalente desde el punto de vista
químico y estructural al mineral biológico del hueso. Esto se
conoce como el punto determinante para la biointegración
[6,7]. Adicionalmente, diversos estudios han demostrado la
eficacia de los biovidrios en estimular la respuesta celular en
comparación con otras cerámicas Ca-P tales como la
hidroxiapatita [8-10].
La capacidad de algunos vidrios de interaccionar con el
tejido óseo formando una unión fuerte, se demostró para las
cerámicas que contenían Si0
2,
Na
2
0, CaO y P
2
0
5
en propor-
ciones específicas [11].
Cable y Parker [12] plantearon un modelo matemático, el
cual establece una relación entre el número de reacción (RN)
y el porcentaje en peso de cada uno de los óxidos añadidos.
En dicho modelo se considera, no sólo la biocompatibilidad
del implante, sino también, establece la diferencia entre un
implante aceptable (RN=4) y una unión firme (RN>5).
Los mecanismos de unión entre el vidrio y el fluido
circundante, pueden ser descritos como una secuencia de
reacciones que resultan en la formación de una capa de sílice
adheridaftrmemente al tejido óseo [13,14]. A fin de reducir la
solubilidad del vidrio en el sistema
Si0
2
.Nap.CaO.K
2
0.MgO.P
2
0
5
se ha incluido en la
composición alúmina (AI203)' Si esta se encuentra como
componente del vidrio en cantidades inferiores o iguales a
1,5 %, no interfiere en la unión con el tejido óseo y brinda
estabilidad al material [2, 15].
Barrios de Arenas y col. [2] encontraron que algunos
vidrios sintetizados en el sistema
Si0
2
.Nap.CaO.Kp.MgO.Pps con diferente contenido de
Al °YB °permiten la acumulación de calcio y fósforo en
2 3 2 3 . ,
la superficie del vidrio, siempre que la relación AlPiBP3 se
encuentre en un rango entre 0,50 y 0,55. La función del B203
es la de actuar como agente estabilizador de la alúmina [2].
Un progreso entre la biocompatibilidad y la ingeniería de
tejidos resulta inconcebible sin la ayuda de las técnicas in
vitro. Los cultivos celulares representan una herramienta
valiosa para la caracterización de nuevos materiales
sustitutos óseos.
Las células óseas obtenidas de calvaria (huesos parietales
y frontal de ratas neonatas) son de amplio uso para la
caracterización de materiales sustitutos óseos, debido a que
son de fácil disección, contienen escasa médula ósea y el
tejido no se encuentra aún mineralizado. Adicionalmente,
siendo células derivadas de animales jóvenes, presentan la
capacidad de proliferar rápidamente in vitro [16].
Las células óseas u osteoblastos, son las responsables
de la formación y organización de la matriz extracelular del
hueso (o fase orgánica) yde su posterior mineralización
[17]. La fase orgánica del tejido óseo esta compuesta en un
90 %de colágeno tipo 1y el restante 10 %por proteínas nO
colagénicas, tales como osteopontina, osteocalcina, proteina
siálica ósea (BSP por sus siglas en inlges), proteína dentina
de la matriz-L, etc. Siendo las células osteoblásticas las
responsables de su síntesis y secreción hacia el medio
extracelular. Todas estas proteínas están implicadas en menor
o mayor medida con el proceso de biomineralización.
Durante el proceso de deposición del mineral en el tejido
óseo ocurre que un cierto número de osteoblastos quedan
atrapados en el tejido nuevo mineralizado ysufren cambios
morfológicos importantes, transformándose en los llamados
osteocitos. Estas células presentan escaso citoplasma
y
están
interconectadas entre si, en la matriz calcificada, mediante
un sistema de canalículos. Es la fase más diferenciada de las
células óseas yno poseen la capacidad de síntesis que
expresan las células osteoblásticas maduras. En el presente
trabajo nos propusimos evaluar la viabilidad, adhesión
y
proliferación de células osteoblásticas derivadas de calvaria
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de ratas, sobre vidrios del sistema
SiO
z
.Nap.CaO.Kp.MgO,PP5 con cantidades variables de
AlP3yBP3'
2. Procedimiento Experimental.
2.1 Preparación de los vidrios.
Las composiciones de los vidrios se muestran en la Tabla
l. Es importante resal~ar que todas las composiciones
seleccionadas cumplen con las condiciones establecidas tal
que muestren un comportamiento bioactivo. Las materias
primas fueron sio,CHNa03,CaC03, PP5' BP3 YA~03' con
una pureza mayor al 99%. Para la síntesis se siguió el
procedimiento descrito por Barrios de Arenas y col. [2]. Una
vez sintetizadas, las piezas de vidrio fueron cortadas para
obtener una superficie de 1 cm? aproximadamente y
desbastadas y pulidas con pasta de diamante de 1 um.
Tabla l. Composiciones de los vidrios (% en peso).
VIDRIO
(%
peso)
1
2
3
45
Si0
249 49 48,5 48,5 48
NazO 20 20 20 20 20
K
2
0
4 4,3 4,3 4 4
MgO 4 4,2 4,2 4 3.5
CaO 20 20 20 20 20
P
2
0
S2 2 2 2 2
AIz0
3
1 O O O1.5
B2
0
3O0,5
1
1.5 1
AIzOylB
2
0
3
-
-
- -
0,66
2.2 Preparación del Fluido Simulado de Plasma (FSP).
La solución acuosa se preparó de acuerdo a las
proporciones especificadas por Kokubo [17] en estudios
previos, empleando los siguientes reactivos de grado
analítico: NaCl, NaHC03, KCl, K2HP04.3Hp, MgCl2.6Hp,
CaC1
2
y Na
2
S04. Estos se disolvieron en solución tampón 50
mMTris-HClpH7,25.
2.3 Inmersión en el FSP
Las muestras fueron sumergidas en el Fluido Simulado
de plasma por un periodo de 4 semanas, a una temperatura
constante de 37°C. Una vez fmalizado el periodo de inmersión,
se limpiaron cuidadosamente con acetona y fueron embutidas
en una resina al frío, para luego cortarlas transversalmente
con disco diamantado. Las secciones transversales se
desbastaron y pulieron con pasta de diamante de 1 um, se
recubrieron con una película de carbono y fueron analizadas
empleando Microscopía Electrónica de Barrido.
2.4 Obtención de células óseas.
Los osteoblastos fueron aislados a partir de la calvaria
de 12 ratas de 2-3 días de nacidas. Las calvarias fueron
diseccionadas bajo condiciones asépticas y limpiadas de
los tejidos blandos circundantes. Luego de 3 lavados
consecutivos en buffer-fosfato salino (PBS por sus siglas
en inglés), se raspó la superficie para eliminar el periostio,
luego fueron cortadas en trozos de 1mm? aproximadamente.
Se incubaron en 2 rnl de solución de digestión (SD), la cual
contenía: DMEM pH 7.5, 1mg/ml colagenasa tipo IA, 0.125
% tripsina y 50 mM EDTA, durante 20 mín. a 37°C en baño de
maría por 20 mín. El sobrenadante resultante de la primera
extracción fue descartado y 2 ml de SD fresca fueron agrega-
dos e incubados en las mismas condiciones. El procedimien-
to fue repetido 2 veces
y
el sobrenadante de la tercera extrac-
ción, conteniendo las células óseas extraídas fue
centrifugado a 1500 rpm x 5 mín., empleando una centrífuga
Sorvall refrigerada Modelo 6000TI (DuPont). El precipitado
celular fue resuspendido en DMEM pH 7,5 complementado
con 10% SFB y antibióticos (100 U/mI penicilina y 100 ug/ml
estreptomicina). y sembrados en placas de Petri (1OOx15mm)
a una densidad de 6x105células. Las células fueron manteni-
das a 37°C en atmósfera húmeda y 5% COz. El medio fue
cambiado la primera vez a los 7 días de cultivo luego de la
extracción y cada 3-4 días hasta alcanzar subconfluencia.
Para los subcultivos, las células fueron tripsinizadas
(0,25%), contadas y sembradas en placas de 12 pozos, auna
densidad de 1x104 cel/cm", En cada pozo, previamente, se
colocó el vidrio a ser ensayado, tratado antes con acetona/
metanol (1:1, v/v), lavados con agua destilada y una vez
secos, sometidos a radiación UV por 1 hora, con el fin de
esterilizarlos. Como control se emplearon cubre-objetos.
El medio fue cambiado cada 3-4 días y las células se
cultivaron por un periodo total de 21 días. Se evaluó la
proliferación y viabilidad de las células mediante observación
directa, empleando un microscopio invertido de contraste
de fases (Nikon). Las imágenes fueron registradas empleando
una cámara fotográfica marca Canon adaptada al microscopio
invertido. El pH del medio se determinó a los 6 y14 días de
cultivo, con un pHmetro digital.
3. Resultados
y
Discusión
En el presente trabajo se prepararon vidrios de -
composiciones diferentes (Tabla 1). Para su identificación se
usó la siguiente nomenclatura: VI, donde el número indica
una composición referida en la tabla 1. VI contenía 1
9t
alúmina, V2, V3 y V4, contenían 0,5,1 Y1,5 % BP3 más no
alúmina, y finalmente V5, el cual contenía la proporción de
1,5y 1 %,~03yBp3,respectivamente (AlP/BP3=0,66).
K. Noris Suare:
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Los vidrios bioactivos, deben su propiedad de formar
una capa de hidroxiapatita (HAP) debido a un proceso
descrito por Ogino y col. [18], el cual consiste en el
intercambio de iones alcalinos del vidrio (en este caso Na+2)
con H+ de la solución fisiológica. En esta etapa inicial de
intercambio, el resto de los componentes del vidrio no se
ven afectados y es una fase que ocurre con cierta facilidad,
ya que los iones Na+no forman parte de la estructura vítrea
del material. Luego se da una segunda fase de disolución
interfacial de la red vítrea, la cual provoca la ruptura de los
enlaces Si-O-Si, con la creación posterior de enlaces silanol
(Si-OH) en la superficie del material que se encuentra en
contacto la solución fisiológica (el FSP o el medio de cultivo
celular, según el caso). Esto induce un proceso de
condensación y repolimerización del silicio, con formación
de una capa rica en sílice, la cual favorece entonces la
migración de iones Ca+2y PO4-2a través de la misma. La
migración de estos iones, promueve el depósito sobre la
superficie de una capa de fosfato de calcio, que crece debido
a la incorporación de más iones a partir de la solución [18].
En este trabajo, se evaluó además de la bioactividad de
los vidrios en FSP, la biocompatibilidad de los materiales,
empleando cultivos con células osteoblásticas obtenidas de
calvaria.
Las células osteoblásticas obtenidas de la tercera
extracción, fueron subcultivadas a razón de lx104cél.zcnr',
en presencia de los diferentes vidrios (VI a V5) en placas de
12 pozos (especiales para cultivo celular). Como controles
se sembraron las mismas células sobre cubreobjetos
corrientes.
Con la finalidad de caracterizar las células extraídas, se
les determinó la actividad fosfatasa alcalina (FA) empleando
el método de Lowry [19]. Se obtuvo actividad FA positiva
para las células ensayadas, exhibiendo valores inclusive
superiores al control positivo empleado en el ensayo (línea
celular tipo osteoblastos -MG63) (datos no mostrados). Se
seleccionó una relación célula/superficie de lx10
4
cél.rcm-
a
fin de obtener, al inicio, un cultivo subconfluente. Este
procedimiento permite evaluar tanto la viabilidad de las
células en contacto o adyacentes al material así como la
capacidad proliferativa de las células en estudio, de manera
cualitativa [20].
La figura 1 muestra las imágenes obtenidas por MEB de
la sección transversal de los 5 vidrios, sometidos a una
soluciónFSP (Fig 1, a-e). Para VI, V2, V3 y V4 (Fig. 1, a-d)
resulta evidente la formación de una capa de HAP sobre la
superficie del vidrio cuando este se encuentra en contacto
con el FSP. Aunque es importante destacar que la capa de
HAP para V 1 se aprecia como una muy delgada capa blanca
en contraste con el fondo negro que brinda la resina,
empleada en esta técnica de análisis, esto podría deberse al
contenido de alúmina de esta composición a diferencia de
V2, V3 y V4 que sólo contienen BP3' En la muestra
correspondiente a V5 (Fig. l-e), sólo se observó la formación
de una capa rica en Si, lo cual podría estar indicando que
sólo en los vidrios V2, V3 YV4 podría ocurrir la proliferación
y mineralización de las celulas, ya que aun cuando en VI
hubo desarrollo de CaP no es muy significativa.
Para el caso de la evaluación en los medios de cultivo
celular, el pH fue evaluado a los 6 y a los 14 días de cultivo
(Tabla 2). Se aprecia una elevación del pH del medio de cultivo
en presencia de los vidrios, para todas las composiciones
estudiadas. Obteniéndose, para el día 6 de cultivo, un aumento
del pH en un rango entre 0,2 y 0,5 unidades en comparación
con el pH de los controles. Este efecto se explica, por el
intercambio de iones sodio por parte del vidrio y protones
del medio, que se produce cuando el material entra en contacto
con la solución fisiológica [2, 18], tal como fue señalado
anteriormente. Otros autores señalan, que la exposición de
los vidrios bioactivos liberan silicio soluble al ambiente en
forma de ácido silícico (debido a un intercambio con H+y
H30+) causando un incremento moderado del pH de la
solución [21].
Tabla 2. pH del medio de cultivo de células osteobásticas en
presencia de biovidrios del sistema
Si02·Na20.CaO.K20.MgO.PzOs.
Vidrio pH 6 días pH
14
días
1
8,30 8,05
28,27 7,97
3
8,24 7,95
4
8,07 8,04
5
8,21 8,13
Control (X DS)
7,79 0,06 7,78 0,02
n=4
Este efecto es una característica común que presentan
los materiales clasificados como biovidrios [4,21,22]. En este
estudio se evidencia, además, que a medida que aumenta el
tiempo de contacto del vidrio con la solución (medio de
cultivo), en la mayoría de los casos se observa una tendencia
del pH del medio a disminuir, aproximándose al pH de los
controles (Tabla 2, 14 días de cultivo). Lit observación de los
cultivos, empleando un microscopio invertido, permitió
evaluar la adhesión celular sobre los vidrios, así como la
formación de una monocapa confluente de células para
algunos de los vidrios estudiados, indicativo de proliferación
celular. La respuesta de las células óseas frente a la presencia
del material en los cultivos al evaluar viabilidad, adhesión y
proliferación varió de forma importante dependiendo del tipo
de vidrio presente.
86
En VI, la alúmina se incluyó en una cantidad inferior al
3%, tal como es recomendada para la elaboración de vidrio
bioactivos [12] a fin de que no causar inestabilidad para la
unión del vidrio con el tejido óseo, sin embargo, en esta
composición no se incluyó el B203,compuesto que estabiliza
la alúmina [2]. Siendo así, es probable que cantidades
importantes de alúmina, hayan impedido las reacciones para
el intercambio iónico necesarios para la bioactividad.
V2 y V3, mostraron un incremento del pH a los 6 días, el
cual a los 14 días de cultivo disminuyó, alcanzando valores
ligeramente superiores a los controles (Tabla 2). Para estas
composiciones se observó que si bien las células no se
mantuvieron adheridas a la superficie de los vidrios, crecieron
hasta formar una monocapa confluente en toda la superficie
del pozo incluyendo el área adyacente a los vidrios (Fig. 2-b.
se muestra imagen sólo para el vidrio V2).
Revista Latinoamericana de Metalurgia
y
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Fig. 1. Imágenes MEB (lOOOX)de la sección transversal de los vidrios de diferente composición, sumergidos por 4 semanas en FSP (a-e).
El sustrato de vidrio está identificado como V,la capa rica en calcio yfósforo indicada por flecha blanca (CaP) yla zona más oscura
corresponde a la resina (R). Los vidrios corresponden a: VI, (a); V2 (b); V3 (c); V4 (d) yV5 (e).
Para VI (fig. 2), se observó adhesión a las 24 horas de
sembradas las células, sin embargo, a las 48 horas, las células
originalmente adheridas, se desprendieron en su totalidad y
se adhirieron en la superficie del pozo de cultivo, adyacente
al vidrio. Para esta misma composición se observó que al
final del periodo de estudio había muy pocas células vivas
en el cultivo. En la figura 2 (2-a) se observa al final del periodo
experimental que en las adyacencias del borde del vidrio
(resaltado con flechas negras en la figura) no fue posible
identificar células vivas en el cultivo. VI fue el biovidrio que
presentó el valor de pH más alcalino de todas las
composiciones ensayadas (Tabla 2).
Cambios en la concentración de [H+] pueden influir
profundamente el metabolismo celular y su función,
incluyendo la viabilidad celular [21, 23]. Por otra parte, no se
puede descartar que este efecto citotóxico observado para
este material, sea inducido por la alúmina.
K. Noris Suare:
y
col. / Revista Latinoamericana de Metalurgia
y
Materiales. 87
\
Figura 2. Fotomicrografías de los cultivos de células osteoblásticas en presencia de vidrios bioactivos. Aumento 200X. a) Interface borde
vidrio VI; b) Células formando una monocapa confluente adyacente a V2; e) Material precipitado observado en cultivo con V4, d) Células
adheridas a la superficie del vidrio V4 (señaladas con flechas negras); e) Células formando monocapa confluente adyacente al vidrio V5; f)
Células adheridas a la superficie del vidrio V5 (señaladas con flechas negras).
Cuando las células se cultivaron con el vidrio V4, se
observó la presencia de precipitado alrededor del vidrio al
final de periodo de estudio (Fig. 2-c). Este material precipitado,
probablemente derivado de la degradación del vidrio, pareció
no ejercer efectos negativos sobre las células óseas, puesto
que se observó que las células se mantuvieron vivas y
proliferaron hasta el final del experimento, alrededor de dicho
material (datos no mostrados). Adicionalmente, fue posible
identificar algunas células con aspecto alargado, firmemente
adheridas (Fig. 2-d), a pesar de no observarse un número
importante de células sobre la superficie, el hecho de que se
encuentren adheridas yviables es indicativo de que el mate-
rial además de ser bioactivo, resulta biocompatible.
Los resultados más favorables desde el punto de vista
biológico, fueron los obtenidos al evaluar in vitro al vidrio
V5. En la figura 2 se observa la presencia de una monocapa
confluente alrededor del vidrio V5 (Fig 2-e), así como la
presencia de un número importante de células adheridas a la
superficie (Fig 2-f) las cuales exhiben apariencia de osteocitos
(células óseas completamente diferenciadas).
El pH del medio de cultivo en presencia de V5 se mantuvo
constante, exhibiendo 0,2 unidades de pH por encima de los
valores reportados para los controles.
88
Referencias.
Revista Latinoamericana de Metalurgia
y
Materiales, Vol.23 N°1.
Estos resultados en conjunto señalan a la composición
V5, como la más favorable y compatible con las células óseas.
V5 es el único biovidrio de los estudiados, que contiene
alúmina y
BP3'
manteniendo una relación
AIP/BP3
=
0,66.
Barrios de Arenas y col [2] reportaron bioactividad cuando
la relación AIP/BP3 se mantenía en un rango de 0,50-0,55,
sin embargo, a pesar de que la relación empleada en este
estudio, es mayor a ese rango y en presencia de FSP no se
aprecia bioactividad, al encontrarse en el material con células
óseas, resulta en la deposición de Ca sobre el material,
posiblemente favorecido por la actividad de estas últimas.
Todas las composiciones estudiadas presentan un RN>5.
Esta relación permite suponer al vidrio como bioactivo y
capaz de promover una unión fuerte con el tejido óseo (de
acuerdo a la formula descrita por Cable y Parker [12]). En
nuestro estudio, se demostró que la variedad de las
respuestas encontradas para cada vidrio permiten afirmar
que pequeñas variaciones en la composición, como las aquí
ensayadas, inducen respuestas muy diversas por parte de
las células óseas.
4. Conclusiones.
Los resultados del presente estudio muestran que el vidrio
del sistema Si02.Na20.CaO.K20.MgO,P205 conteniendo
tanto Al203 como
BP3
en su composición, resultó ser el más
favorable para la actividad de las células osteoblásticas, tanto
en su capacidad de proliferar en presencia del material, así
como en la factibilidad de adherirse a la superficie del mismo;
cualidades importantes para los materiales diseñados como
potenciales sustitutos óseos de pequeñas dimensiones o
para el recubrimiento de implantes rígidos (prótesis
ortopédicas o dentales)
Ulteriores estudios deberán ser conducidos con el fin de
evaluar estos materiales y el comportamiento de las células
óseas en contacto con ellos, estudiando características
funcionales de las células, como son, la capacidad de
diferenciarse y biomineralizar.
La presente investigación fue financiada parcialmente
por fondos otorgados por el Decanato de Investigación y
Desarrollo, Universidad Simón Bolívar, Proyecto DI-CB-
S199146-PN
Y
por el Proyecto FONACIT G-2001000900.
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5. T Kokubo, SIto, T Huang, T Huyashi, S Sakka, T Kitsugi,
Yamamuro
J
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6. T Kitsugi, T Nakamura,T Yamamura,T Kokubo, T Shibuya, T.
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23. W.B. Busa, R. Nuccitelli. Am JPhysiol. 284 (1984) R409-
438.
... Los hidrogeles a base de quitosano, pueden presentar poros que permiten a las células distribuirse adecuadamente y puedan proliferar, más aún, cuando se combina con hidrogeles de fibrina cuyos microporos permite la comunicación de factores de nutrición y de crecimiento entre las dos capas [7]. Adicionalmente los hidrogeles de quitosano son biomateriales que por sus propiedades mecánicas y elásticas se amoldan a cualquier tipo de superficie y ello los convierte en un material con amplias aplicaciones potenciales. ...
Article
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El Quitosano es un polisacárido natural biodegradable y que no es tóxico. Se obtiene de la desacetilación del polisacárido, quitina. El Quitosano ha sido ampliamente reportado como un material biocompatible, hemostático, mucoadhesivo, impulsa la absorción de numerosos compuestos biológicos y presenta actividad antimicrobiana, entre otras propiedades. Todas estas cualidades hacen que sea un material interesante para utilizarlo en la regeneración de tejidos como dermis, epidermis, cornea, etc. El objetivo del presente trabajo fue el desarrollo de matrices porosas poliméricas fabricadas a partir de materiales compuestos de quitosano, entrecruzada con polietilenglicol (PEG) de diferente espesor (de 2, 3 y 5 mm y ultrafinas) y la evaluación de su biocompatibilidad mediante el empleo de diferentes modelos in vitro, fibroblastos obtenidos de una lipectomia abdominal y células madre mesenquimales (CMM) derivadas de gelatina de Wharton. Los resultados confirman la biocompatibilidad (adhesión y proliferación celular) con ambos modelos celulares. En conclusión, las membranas desarrolladas pueden ser empleadas como andamios biocompatibles en la fabricación de sustitutos dermo-epidérmicos y otras potenciales aplicaciones.
... Los osteoblastos fueron extraídos y cultivados siguiendo el método descrito por Noris-Suárez et al [4]. Las células fueron mantenidas a 37 o C en atmósfera húmeda y 5% CO 2 . ...
Article
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In the bone tissue, collagen is the most abundant protein, conforming 90% of the organic matrix of this mineralized structure. Different works indicate that in postmenopausal osteoporosis, the early degradation of the bone tissue seems to be due to the presence of bone collagen in a condition of overglycosylation, especially in the trabecular bone. To understand the role of the glycosylation of the collagen molecule and how it can regulate functions of the bone cells, such as cellular adhesion and biomineralization, is the main objective of the present work. 8 rats were ovariectomized and another 8 were sham-operated (control group). After 45 days the rats were sacrificed, femurs were extracted and the bones were decalcified in order to obtain the collagen matrix mineral free. Primary cultures of bone cells were obtained from calvaria of neonatal rats. The adhesion and differentiation (alkaline phosphatase activity and biomineralization) of these cells were evaluated on the collagen bone matrix obtained of the ovariectomized and control rats. The results of this work show a greater adhesion of the osteoblastic cells on the bone collagen for the control group in comparison with the adhesion found for the ovariectomized group, in the first two hours. Additionally, cell FA activities and mineralization on material differ between control and ovariectomized animals bone collagen samples. In conclusion, in the present work we present evidence that suggest that bone cells can recognize differences in the degree of glycosylation of the collagen matrix in ovariectomized animals in comparison with the control group, and the cellular response is different as a consequence of these variations of the extracellular material.
... Con el propósito de evaluar el fenómeno piezoeléctrico del colágeno del hueso sobre la adhesión celular se extrajeron de calvaria de ratas neonatas, células ósteoprogenitoras siguiendo el método descrito por Noris-Suárez et al [6]. A fin de evaluar la adhesión celular sobre el material colagénico se sumergieron las muestras de colágeno deformadas y sin deformar (control) en una suspensión celular que contenía 3x10 5 cel/ml en medio de cultivo DMEM (el ensayo se realizó por duplicado). ...
Conference Paper
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Bone healing and growth are controlled by the rate of deposition of hydroxyapatite (HA). This process have been so far accredited to the work of osteoblasts, which are attracted by the electrical dipoles produced either by piezoelectricity, due to deformation of the bone, specially the collagen in it, or due to outside electrical stimuli. The main purpose of this work was to study the influence of the cortical bone collagen piezoelectricity effect, on the osteoblastic cells orientation. To evaluate the cellular adhesion on the cortical bone collagen subject to deformation, bone cells of newborn calvaria’s rats were extracted. The bone collagen was prepared and deformed following the specifications described in earlier studies. The results of this study shown that the piezoelectric phenomena of bone collagen promotes the cell’s adhesion on the compression side more than tension side compared with undeformed surface. Further studies ascertaining the osteoblastic activity due to the electric field are being advanced.
... 17 Obtención y Cultivo de Osteoblasto de Rata Sprague Dowley (OBR). Las células óseas se obtuvieron a partir de calvaria (huesos frontal y parietales del cráneo de neonatos de 2-3 días nacidos), siguiendo la metodología descrita por Noris-Suárez et al. 18 Obtención y Cultivo de Células Estromales (CE) a partir de lipoaspirados. Las muestras de tejido adiposo fueron obtenidas de pacientes sanos sometidos a procesos de lipoescultura (Clínica Ávila, Caracas, Venezuela) y fueron gentilmente donadas para el desarrollo del presente estudio, previa aprobación del paciente mediante consentimiento informado. ...
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RESUMEN Estudios epidemiológicos demuestran que dietas ricas en flavonoides previenen afecciones relacionadas con la menopausia tales como la osteoporosis, debido a que poseen una estructura similar al 17β-estradiol. Por ello pueden ser empleados como sustitutos terapéuticos y de allí su nombre más conocido: fitoestrógenos. En Venezuela, se ha reportado la presencia de flavonoides en la planta Bauhinia megalandra (casco de vaca) y su consumo por adultos mayores, como infusión, es común con fines terapéuticos. Se evaluó el extracto acuoso foliar de Bauhinia megalandra (Bm) como inductor osteogénico en células óseas de ratas Sprague Dowley y en células estromales humanas provenientes de lipoaspirados. Bm induce la maduración osteoblástica en las células óseas e induce al linaje óseo a las células estromales adultas. Se realizó un fraccionamiento a partir de Bm con acetona, metanol y butanol. En células óseas en cultivo (de ambos modelos celulares) se demostró la capacidad osteogénica de las fracciones de acetona y metanol, en las que se reveló la presencia de compuestos polares, específicamente flavonoides. En conclusión, el extracto acuoso foliar de BM posee flavonoides con la capacidad de inducir linaje osteogénico en células mesenquimales de ratas Sprague Dowley y humanas. Palabras claves: efecto osteogénico, células mesenquimales, células óseas, Bauhinia megalandra. ABSTRACT Epidemiological studies have shown that flavonoids rich diets prevent some conditions associated to menopause such as osteoporosis; this is so because they have a similar structure to 17β-estradiol. They can therefore be used as therapeutic hormonal substitutes, hence, its already known name: phytoestrogens. In Venezuela, we have reported the presence of flavonoids in the plant Bauhinia megalandra (Cow Hoof) an infusion of this plant is frequently used by older adults for therapeutic purposes. Leaf aqueous extract from Bauhinia megalandra (Bm) were evaluated as an osteogenic inductor in bone cells from Sprague Dawley rats and human stromal cells from lipo. Bm induces osteoblast maturation in bone cells and induces bone lineage in adult stromal cells. Fractioning was performed from Bm with acetone, methanol and butanol. In plated bone cells (from both cellular models) osteogenic capacity was observed with acetone and methanol fractions, which shown presence of polar compounds, specificallyflavonoids. In conclusion, leaf aqueous extract form BM has flavonoids with the ability of to induce osteogenic lineage in mesenchymal cells from Sprague Dowley rats and human.
... Los osteoblastos fueron extraídos y cultivados siguiendo el método descrito por Noris-Suárez et al [4]. Las células fueron mantenidas a 37 o C en atmósfera húmeda y 5% CO 2 . ...
Conference Paper
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El grado de glicosilación del colágeno óseo regula la adhesión y la capacidad de biomineralizar de las células óseas Abstract— In the bone tissue, collagen is the most abundant protein, conforming 90% of the organic matrix of this mineral-ized structure. Different works indicate that in postmeno-pausal osteoporosis, the early degradation of the bone tissue seems to be due to the presence of bone collagen in a condition of overglycosylation, especially in the trabecular bone. To understand the role of the glycosylation of the collagen mole-cule and how it can regulate functions of the bone cells, such as cellular adhesion and biomineralization, is the main objective of the present work. 8 rats were ovariectomized and another 8 were sham-operated (control group). After 45 days the rats were sacrificed, femurs were extracted and the bones were decalcified in order to obtain the collagen matrix mineral free. Primary cultures of bone cells were obtained from calvaria of neonatal rats. The adhesion and differentiation (alkaline phos-phatase activity and biomineralization) of these cells were evaluated on the collagen bone matrix obtained of the ovariec-tomized and control rats. The results of this work show a greater adhesion of the osteoblastic cells on the bone collagen for the control group in comparison with the adhesion found for the ovariectomized group, in the first two hours. Addition-ally, cell FA activities and mineralization on material differ between control and ovariectomized animals bone collagen samples. In conclusion, in the present work we present evi-dence that suggest that bone cells can recognize differences in the degree of glycosylation of the collagen matrix in ovariec-tomized animals in comparison with the control group, and the cellular response is different as a consequence of these varia-tions of the extracellular material. Palabras claves— Glicosilación del colágeno, matriz ósea, osteoporosis postmenopausal, osteoblastos.
... Con el propósito de evaluar el fenómeno piezoeléctrico del colágeno del hueso sobre la adhesión celular se extrajeron de calvaria de ratas neonatas, células ósteoprogenitoras siguiendo el método descrito por Noris-Suárez et al [6]. A fin de evaluar la adhesión celular sobre el material colagénico se sumergieron las muestras de colágeno deformadas y sin deformar (control) en una suspensión celular que contenía 3x10 5 cel/ml en medio de cultivo DMEM (el ensayo se realizó por duplicado). ...
Data
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Bone healing and growth are controlled by the rate of deposition of hydroxyapatite (HA). This process have been so far accredited to the work of osteoblasts, which are attracted by the electrical dipoles produced either by piezoelectricity, due to deformation of the bone, specially the collagen in it or due to outside electrical stimuli.The main purpose of this work was to study the influence of the cortical bone collagen piezoelectricity effect, on the osteoblastic cells orientation. To evaluate the cellular adhesion on the cortical bone collagen subject to deformation, bone cells of newborn calvaria’s rats were extracted. The bone collagen was prepared and deformed following the specifications described in earlier studies. The results of this study shown that the piezoelectric phenomena of bone collagen promotes the cell’s adhesion on the compression side more than tension side compared with undeformed surface. Further studies ascertaining the osteoblastic activity due to the electric field are being advanced
Article
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Introduction and Objective. There is an important worldwide demand to develop biological substitutes that restore, maintain or improve tissue function based on the combined use of biomaterials that function as scaffolds, using cells that induce regeneration, to repair injured or diseased tissues. Our objective is to culture and characterize the Wharton gelatin epidermal and mesenchymal cells on ultrathin chitosan matrices in order to evaluate the biocompatibility and its potential use as dermal substitutes. Methods. Two cellular models of human origin were used with the prior informed consent of healthy donors, mesenchymal stem cells obtained from Wharton's gelatin and epidermal cells, isolated by digestion with dispase of skin samples. Both cell types planted at a rate of 5,000 cel/cm2 and cell adhesion was evaluated by the quantitative CellTiter 96® (MTS) method and qualitatively using the DAPI labeling of the cell nuclei. Results. Through this study, homogenous cultures of both cell types, keratinocytes and mesenchymal stem cells were established. The 2 cell types showed an appropriate cellular adhesion and viability on the ultrathin membranes of chitosan, both by the MTS assay and by the qualitative evaluation with DAPI. Conclusions. It was demonstrated that chitosan membranes can be used as appropriate supports for these cell types, which could be used as living dermal dressings in the treatment of chronic ulcers and burns, since the system combines the regenerative and bacteriostats properties of chitosan with high cutaneous regenerative potential presented by both mesenchymal stem and epidermal cells. © 2018 Sociedad Espanola de Cirugia Plastica Reparadora y Estetica (SECPRE). All rights reserved.
Conference Paper
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In this work, we introduce an opto-geometric parameter for the morphologic characterization of cell populations during their early adhesion process. Using measurements for a cell population of the maximal optical phase for each cell and its substrate-contact-surface, we show, experimentally, that a relationship exists between these variables. This connection is primarily associated with morphological cell characteristics. It is also shown that using the relationship obtained above, we can derive a morphological parameter, which, for the cell populations studied, results in a monodisperse Gaussiansize distribution, which would allow for the use of regular statistical variables. This result is in total contrast with the polydisperse distribution obtained if only the contact surface area between cell and substrate is used. In addition, optical phase measurements where accomplished by phase shifted interferometry using a Mirau-type interference microscope. The cellular system studied consisted of Osteoblast-like cells, plated on 316VM medical-grade stainless steel polished surfaces. These cell populations were studied within the same culture conditions of cell type, plating time and substrate roughness conditions. The existence of a relationship between maximal optical phase and substrate contact area agrees entirely with the accepted spreading model for cell adhesion; in particular, considering the close link between the optical phase time change and cell thickness reduction. Keywords: Optical phase, Cell adhesion, Interference Microscopy, Cell morphology, Quantitative phase microscopy.
Article
High-density polyethylene–hydroxyapatite (HDPE–HA) composites with different filler content (5–20 %) were synthesized by in situ ethylene polymerization. Good filler dispersion was observed without formation of agglomerates. Osteoblast cell behavior in HDPE–HA composites was evaluated in terms of adhesion, alkaline phosphatase activity and proliferation. Fluorescence and scanning electron microscopy results showed good cell adhesion and proliferation, and extensive filopodium-like protrusion connected to hydroxyapatite particles.
  • . A Dubok
v.A. Dubok.Powder Metallurgy and Metal Ceramics, 7-8 (2000) 69-87
  • C De Arenas
  • M Schattner
  • Vasquez
I de Arenas, C. Schattner, M. Vasquez.Rev. LatinAm. Met. Mat. 21[2] (2001) 90-95.
  • L Hench
  • Splinter
  • T Allen
  • Greenlee
L.L Hench., RJ Splinter., W.C Allen., T.K Greenlee. Part 1. J Biomed Mater. Res Symposium, 2 (1971) 117-141.
  • J K Ll Hench
  • West
LL Hench, J.K. West Life Chem. Rep., 13 (1996) 187-241
  • T Kokubo
  • Sito
  • T Huang
  • Huyashi
  • Sakka
  • Kitsugi
T Kokubo, SIto, T Huang, T Huyashi, S Sakka, T Kitsugi, YamamuroJ Biomed Mater. Res, 24 (1990) 331-343.
  • T Kitsugi
  • T Nakamura
  • Yamamura
  • Kokubo
  • T Shibuya
  • Takagi
T Kitsugi, T Nakamura, T Yamamura,T Kokubo, T Shibuya, T. Takagi. J. Biomed. Mater. Res. 21 (1987) 1255-1271.
  • G Ito
  • Matsuda
  • Inoue
G Ito, T Matsuda, N Inoue, T Kamegai J Biomed Mater. Res, 21 (1987) 485-497.
  • H Oonishi
  • Kutshitani
  • H Yasukawa
  • Iwaki
  • Hench
  • Wilson
  • Tsuji
H Oonishi, S Kutshitani, E Yasukawa, H Iwaki, L Hench, J Wilson,E Tsuji,T SugiharaClin Orthoped Rel Res, 334 (1997) 316-325.
  • C G Wcavrouwenvelder
  • K Groot
  • J Groot
WCAVrouwenvelder, CG Groot, K Groot J. Biomed. Mater. Res., 27 (1993): 465-475.
  • Wca Vrouwenvelder
  • K Groot
  • J Groot
WCA Vrouwenvelder, CG Groot, K Groot J. Biomaterials, 15 (1994). 97-106.