A pesar de que los biomarcadores constituyen una herramienta importante en los ensayos de laboratorio, permitiendo vincular la exposición o el efecto de sustancias tóxicas con eventos clave moleculares y celulares, todavía no se ha hecho extensivo su empleo en poblaciones naturales de invertebrados expuestos a mezclas complejas de contaminantes ambientales. El presente trabajo se centró en el análisis de una batería de biomarcadores de toxicidad en poblaciones naturales de larvas de estadio IV de Chironomus riparius (Diptera) localizadas en tres ríos contaminados de Galicia (Con, Sar, y Louro). De los distintos parámetros evaluados, la expresión del gen hsp70, la actividad de la enzima GST, el contenido total de glucógeno y las deformidades del mentum mostraron diferencias significativas entre las poblaciones de los tres ríos, con diferentes niveles y tipos de contaminantes analizados en sus sedimentos (metales, pesticidas organoclorados, alquilfenoles, productos farmacéuticos y de cuidado personal). En contraste con estos biomarcadores sensibles, otros como la actividad de hsc70, EcR y P450, la relación ARN:ADN y el contenido de proteína total se mantuvieron estables entre las poblaciones estudiadas, incluso en comparación con larvas no expuestas de nuestro laboratorio. El gen hsp70 parece ser particularmente sensible a distintas condiciones de contaminación, mientras que su homólogo constitutivo hsc70 no mostró variaciones en los niveles de expresión, lo que sugiere que la relación hsc70/hsp70 puede ser un indicador potencial de ambientes contaminados. Aunque son necesarios más estudios para comprender la correlación entre los eventos moleculares y los efectos fisiológicos de los contaminantes sobre las poblaciones naturales, estos resultados ofrecen nuevos datos sobre las respuestas biológicas de organismos sometidos a diferentes condiciones de estrés ambiental. Este estudio de campo aporta nuevas dianas moleculares como herramienta para complementar los parámetros ecotoxicológicos clásicos, con el objetivo de mejorar las metodologías de monitorización de la calidad de las aguas y las evaluaciones del riesgo ecotoxicológico.