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Streptococcus iniae を原因とする
b
溶血性レンサ球菌
症は,日本をはじめ世界各地で種々の海産魚および淡水
魚で発生が報告されている(Kusuda and Salati, 1999)。
日本ではニジマス Oncorhynchus mykiss やアユ Pleco-
glossus altivelis などの淡水魚(Kitao et al., 1981; 大
西・城, 1981)およびヒラメ Paralichthys olivaceus や
ブリ Seriola quinqueradiata などの海産魚(中津川,
魚病研究 Fish Pathology, 42 (4), 181–189, 2007. 12 © 2007 The Japanese Society of Fish Pathology
ヒラメの
b
溶血性レンサ球菌症に対するファージ治療試験
松岡 学
1
*
・橋爪貴也
2
・神崎博幸
3
・岩本恵美
2
・
Se Chang Park
4
・吉田照豊
5
・中井敏博
2
(2007年 3 月26日受付)
Phage Therapy against
b
-hemolytic Streptococcicosis of
Japanese Flounder Paralichthys olivaceus
Satoru Matsuoka
1
*
, Takaya Hashizume
2
, Hiroyuki Kanzaki
3
, Emi Iwamoto
2
,
Se Chang Park
4
, Terutoyo Yoshida
5
and Toshihiro Nakai
2
1
Ehime Prefectural Chuyo Fisheries Experimental Station, Iyo, Ehime 799-3125, Japan
2
Graduate School of Biosphere Science, Hiroshima University, Higashi-Hiroshima,
739-8528, Japan
3
Saga Prefectural Genkai Fisheries Research and Development Center, Karatsu,
Saga 847-0122, Japan
4
College of Veterinary Medicine, Seoul National University,
Seoul 151-742, Korea
5
Faculty of Agriculture, University of Miyazaki, Miyazaki,
889-2192, Japan
(Received March 26, 2007)
ABSTRACT—We examined the therapeutic effect of Streptococcus iniae phages isolated from fish
culture environments against experimental streptococcicosis of Japanese flounder Paralichthys
olivaceus. Phage sensitivity tests with a double agar method revealed that 31 of 35 S. iniae
strains from the flounder have a similar sensitivity to six phage isolates. In phage therapy experi-
ments, fish were injected intraperitoneally (IP) with S. iniae PSi402 and 1 h later IP-injected with a
mixture of two or four phage isolates, and observed at 25°C for 2 wk. Mortalities of fish receiving
phages were significantly lower than those of control fish without phage-treatment in all four trials.
The effect of phage treatment was also demonstrated even at 24 h post-infection, when cell num-
bers of S. iniae were 10
7.4
and 10
4.5
CFU/g in the kidneys and brains of fish, respectively. How-
ever, as phage-resistant S. iniae were frequently isolated from dead fish in the phage-treated group,
further investigations are required to establish phage therapy of the disease.
Key words: bacteriophages, phage therapy,
b
-hemolytic streptococcicosis, Streptococcus iniae,
Paralichthys olivaceus, Japanese flounder
1
愛媛県中予水産試験場
2
広島大学大学院生物圏科学研究科
3
佐賀県玄海水産振興センター
4
ソウル大学獣医学部
5
宮崎大学農学部
*
Corresponding author
E-mail: matsuoka-satoru1@pref.ehime.jp
182 松岡 学・橋爪貴也・神崎博幸・岩本恵美・S. C. Park・吉田照豊・中井敏博
1983;酒井ら,1986;佐古, 1993)で発生している。
特に養殖ヒラメにおいては,本症はエドワジエラ症
(Edwardsiella tarda 感染症)とともに重要疾病とされて
おり,問題点は化学療法の困難さにある。すなわち,罹
病したヒラメは摂餌活動が著しく低下するために薬剤の
経口投与効果が低い場合が多く,また本症の治療のため
に使用できる化学療法剤が 成分(塩酸オキシテトラサ2
イクリン,アルキルトリメチルアンモニウムカルシウム
オキシテトラサイクリン)に限られているうえに薬剤耐
性菌が出現するためである(松岡・和田,1996)。一方,
このような医薬品の使用は養殖業者にとって経済的負担
が大きいうえに,食品の安全性の面からはできるだけ医
薬品を使用しない養殖方式が求められている。これらの
ことから,今後の持続的な養殖生産のためには,従来の
方法とは異なる視点から本症に対する対策を講じる必要
がある。
近年,細菌感染症の治療に,細菌ウイルスであるバク
テリオファージ(以下ファージと略する)を用いる治療
法(ファージ療法)が注目され,獣医学や医学の分野で
その基礎研究が活発に行われ始めている(Biswas et al.,
2002; Matsuzaki et al., 2003; Kutter and Sulakvelidze,
2004)。我々は水産増養殖分野におけるファージ療法に
ついて検討を進めており,これまでにブリのラクトコッ
カス症(Lactococcus garvieae 感染症)やアユの細菌性
出血性腹水病(Pseudomonas plecoglossicida 感染症)
に対するファージ療法の有効性を報告してきた(Nakai
et al., 1999; Park et al., 2000; Park and Nakai, 2003)。
また,最近になって海外からもカワマス Salvelinus
fontinalis のせっそう病に対するファージの有効性に関す
る報告がなされ(Imbeault et al., 2006),魚類の細菌感染
症に対するファージ療法への関心が世界的に高まりつつ
ある。
本研究では,ヒラメ養殖場の環境中から S. iniae に対
する溶菌ファージを分離し,それらのファージに対する
ヒラメ病魚由来 S. iniae 菌の感受性を調べるとともに,
S. iniae を人為感染させたヒラメに対するファージの治療
効果について検討した。
材料および方法
海水およびヒラメからの S. iniae の分離
ファージの分離と平行して,ファージの出現との関連
をみることを目的として,愛媛県大洲市(2003年 月か5
ら2006年 月)および今治市(2003年 月から2005年35
月)のヒラメ養殖場で,養殖環境水および飼育中のヒ3
ラメ 才魚から S. iniae の分離を試みた。0
環境水として,陸上コンクリート水槽の排水(大洲市)
または海面小割生簀周辺の海水(今治市)を毎月 回,2
回あたり約 1 L 採取し,常温で愛媛県中予水産試験場1
の研究室に持ち帰った。このうち 250 mL をフィルター
ユニット(0.45
m
m:Nalge Nunc Int.)を使用して吸引
ろ過し,そのメンブレンフィルターを 10 mL の滅菌海水
の入った試験管に入れて約20秒間激しく攪拌した。この
懸濁液を試験水とし,AE(アザイド・エスクリン)寒天
培地に塗抹して25°C で 日間培養した。出現したコロ7
ニーのうち,日本水産資源保護協会配布の抗 S. iniae
(NIRA-2 株)家兎血清に対してスライド凝集試験陽性の
ものを S. iniae として計数した。
ヒラメは,各養殖場で追跡調査する魚群を定めて毎月
回外見上異常のみられない生魚10尾を採取し,氷蔵し1
て研究室に持ち帰った。それらの腎臓からトリプトソー
ヤ寒天培地(TSA:日水)を用いた画線塗抹法により細
菌の分離を行ない,25°C で48時間培養後に出現したコロ
ニーについて,上述の方法で S. iniae の同定を行なった。
分離された株の一部は,愛媛県および香川県の養殖ヒラ
メ病魚由来株とともに,ファージ分離のための宿主菌,
プラーク検出のための標示菌,およびファージ感受性試
験株として使用した(Ta ble 1)。
なお,本研究で分離したものを含め供試した S. iniae
株について,Mata et al.(2004)の方法による乳酸酸化
酵素を標的とした PCR 試験を実施したところ,いずれの
株でも目的とするサイズの増幅産物(870 bp)が得られ
た。
ファージの分離
既報の方法(松岡・中井,2004)を用いて,集殖法に
より環境水から S. iniae ファージの分離を試みた。すな
わち,前述のフィルターユニット(0.45
m
m)でろ過し
た海水 100 mL を 倍濃度に調整した滅菌トリプトソー2
ヤブイヨン(TSB:日水)100 mL に添加し,これに
2002年以前に分離された10株の S. iniae を宿主菌として
加えて25°C で24時間培養した。3,500 rpm で10分間遠心
分離した上清を 0.45
m
m でろ過し,そのろ液における
ファージの有無を10株(2003年)または 株(2004お5
よび2005年)の S. iniae を標示菌(Table 1)として二重
寒天法(日高,1986;坂田・古川,2000)により調べ
た。
ファージの形態観察
単一プラークからの単離・培養を繰り返してクローン
化したファージ株について,透過型電子顕微鏡(日立
H-600A)によりファージ粒子の観察を行なった。
魚病細菌のファージ感受性試験
S. iniae(39株)に加えて,比較のためレンサ球菌 L.
garvieae( 株)と S. parauberis(10株),またその他6
の魚病細菌として Vibrio anguillarum( 株),V. o r dalii2
183ヒラメレンサ球菌症のファージ療法
Table 1. Bacterial strains used in this study and their sensitivities against Streptococcus iniae phages
Sensitivity to phages Isolation
Strain
PSiJ 52PSiJ 51PSiJ 42PSiJ 41PSiJ 32PSiJ 31
YearLocationSource
Streptococcus iniae
++++++2001Ehime, JapanJapanese flounderIS-19
++++++2001Ehime, JapanJapanese flounderIS-21
a
++++++2001Ehime, JapanJapanese flounderIS-22
ab
++++++2002Kagawa, JapanJapanese flounderKRS-02-035
++++++2002Kagawa, JapanJapanese flounderKRS-02-036
ab
++++++2002Kagawa, JapanJapanese flounderKRS-02-042
a
++++++2002Kagawa, JapanJapanese flounderKRS-02-092
ab
++++++2002Kagawa, JapanJapanese flounderKRS-02-108
++++++2002Kagawa, JapanJapanese flounderKRS-02-111
a
––++++2002Kagawa, JapanJapanese flounderKRS-02-118
++++++2003Ehime, JapanJapanese flounderPSi-301
a
++++++2003Ehime, JapanJapanese flounderPSi-302
a
++++++2003Ehime, JapanJapanese flounderPSi-303
ab
++++++2003Ehime, JapanJapanese flounderPSi-304
++++++2003Ehime, JapanJapanese flounderPSi-305
a
++++++2003Ehime, JapanJapanese flounderPSi-306
++++++2004Ehime, JapanJapanese flounderPSi-402
++++++2004Ehime, JapanJapanese flounderPSi-403
b
++++++2004Ehime, JapanJapanese flounderSIE-06
++++++2004Ehime, JapanJapanese flounderSIE-07
++++++2004Ehime, JapanJapanese flounderSIE-08
++++++2004Ehime, JapanJapanese flounderSIE-09
++++++2004Ehime, JapanJapanese flounderSIE-10
++++++2005Cheju, KoreaJapanese flounderSNUSI-05J2
++++++2005Cheju, KoreaJapanese flounderSNUSI-05J3
++++++2005Cheju, KoreaJapanese flounderSNUSI-05J4
++++++2005Cheju, KoreaJapanese flounderSNUSI-05J5
++++++2005Cheju, KoreaJapanese flounderSNUSI-05J7
++++++2005Cheju, KoreaJapanese flounderSNUSI-05J8
++++++2005Cheju, KoreaJapanese flounderSNUSI-05J9
++++++2005Cheju, KoreaJapanese flounderSNUSI-05J10
++++++2005Cheju, KoreaJapanese flounderSNUSI-05I15
––––––2005Cheju, KoreaJapanese flounderSNUSI-05I16
––––––2005Cheju, KoreaJapanese flounderSNUSI-05I17
––––––2005Cheju, KoreaJapanese flounderSNUSI-05I18
++++++1985Mie, JapanYe llowtailYT-8504
++++++1992Miyazaki, JapanRainbow trout
b
-23
––––––AT CC 29177
––––––AT CC 29178
Lactococcus garvieae
––––––AT CC 43921
––––––AT CC 49156
––––––2004Ehime, JapanJapanese flounderPSi 401
––––––1995Ehime, JapanYe llowtailEU 206
––––––1996Kagoshima, JapanYe llowtailKS 9601
––––––1993Mie, JapanStriped jackMI 93005
Streptococcus parauberis
––––––2005Ehime, JapanJapanese flounderPSP 501
––––––2005Ehime, JapanJapanese flounderPSP 502
––––––2005Ehime, JapanJapanese flounderPSP 503
––––––2005Ehime, JapanJapanese flounderPSP 504
––––––2005Ehime, JapanJapanese flounderPSP 505
––––––2005Ehime, JapanJapanese flounderPSP 506
––––––2005Ehime, JapanJapanese flounderPSP 507
––––––2005Ehime, JapanJapanese flounderPSP 508
––––––2005Ehime, JapanJapanese flounderPSP 509
––––––2005Ehime, JapanJapanese flounderPSP 510
a,b
: used as indicator cells to isolate phages after enrichment culture (a: 2003, b: 2004 and 2005)
184 松岡 学・橋爪貴也・神崎博幸・岩本恵美・S. C. Park・吉田照豊・中井敏博
( 株),E. tarda( 株),Aeromonas hydrophila( 12 1
株),A. salmonicida( 株),Pseudomonas fluores-1
cence( 株)について,分離 S. iniae ファージ 株16
(PSiJ31,PSiJ32,PSiJ41,PSiJ42,PSiJ51,PSiJ52)
に対する感受性をスポット法(坂田・古川,2000)によ
り調べた。すなわち,TSB で25°C,24時間培養した10
7
CFU/mL 濃度の菌液 0.4 mL を 3 mL の1/3濃度の TSA
(50°C で保温)と混合後,TSA 平板上に重層した。この
二重寒天平板上に 10
5
PFU/mL のファージ液を 滴(約 1
10
m
L)滴下し,25°C で24時間培養してプラークの有無
を観察した。ファージ液滴下部分に菌が発育しなかった
場合をファージ感受性と判定した。なお,供試した S.
parauberis 株については,長崎大学より分与された抗 S.
parauberis(NUF934株)家兎血清に対するスライド凝集
試験により同定した。
ファージの in vitro 増殖抑制効果試験
S. iniae ファージ株(PSiJ31,PSiJ32,PSiJ41,
PSiJ42)について,試験管内での S. iniae 増殖抑制効果
を調べた。10 mL の TSB に,ブレインハートインフュー
ジョン寒天培地(BHIA:日水)で25°C,24時間培養し
た S. iniae PSi402 株を終濃度 10
5
CFU/mL となるように
添加した。そこに MOI(multiplicity of infection)が 10
0
,
10
–2
,10
–4
となるように上述のファージ 株の単独または4
株等量混合ファージ液をそれぞれ 10
m
L 添加した。対4
照区では,ファージ液の代わりに PBS を 10
m
L 添加し
た。25°C で振とう培養し, ,6,12,18および24時間1
後の吸光度(波長 600 nm)を測定した。
ファージによる治療試験
愛媛県中予水産試験場の隔離飼育施設において,S.
iniae を人為感染させたヒラメに対するファージ治療試験
を 回行なった。各試験には,魚体通過( 回)させ51
た S. iniae PSi402株の再分離菌を用いた。ファージ液
は,各ファージを二重寒天培地で S. iniae IS22株を宿主
菌として培養し,0.45
m
m のフィルターでろ過した後,
10
8
PFU/mL に調整した。試験 および では PSiJ31 と12
PSiJ32 の 株のファージ混合液を,試験 ∼ では235
PSiJ31,PSiJ32,PSiJ41 および PSiJ42 の 株のファー4
ジ混合液を使用した。
試験 ∼ のうち試験 および では,ファージ接種14 1 2
区および対照区それぞれ 水槽(100 L 容ポリアクリル製1
円形水槽)に,試験 および ではそれぞれ 水槽に,34 2
平均体重 7.0∼41.9 g のヒラメを20∼30尾ずつ収容した。
TSA で25°C,24時間培養した PSi402 株を,供試魚の腹
腔内に 0.1 mL/ 尾(10
5.4
∼10
7.7
CFU/ 尾)注射し,その 1
時間後にファージ液 0.1 mL を腹腔内注射した(10
8.0
∼
10
8.4
PFU/ 尾)。対照区では供試魚に滅菌 TSB を同様に注
射した。その後,通気しながら流水で15日間飼育し, 1
日に 回観察して死亡魚を取り上げるとともに,死亡魚2
および試験終了時の生残魚の腎臓から BHIA を用いて細
菌の分離を試みた。飼育期間中の平均水温は24.2∼
25.0°C であった。
試験 では,平均体重 56.4 g のヒラメに,PSi402 株5
を 0.1 mL/ 尾 (10
5.4
CFU/0.1 mL)腹腔内注射し,その12
時間または24時間後にファージ液を腹腔内に注射した
(10
8.7
PFU/0.1 mL/ 尾)。対照区では供試魚に滅菌 TSB を
同量腹腔内注射して15日間観察した。各区 水槽を用い,2
水槽あたり20尾を供試した。飼育条件は試験 ∼ と114
同様で,飼育期間中の平均水温は25.2°C であった。
上記試験 と平行して,ファージ接種時における感染5
状態を知るため,菌接種後のヒラメ体内における S. iniae
の消長をみた。ヒラメ(平均体重 54.1 g)に S. iniae
PSi402 株を腹腔内注射し(10
5.4
CFU/ 尾), ,12,241
および48時間後の生魚と,菌液注射後 日目から 日目23
の死亡魚各 尾についてそれらの脳および腎臓を無菌的5
に摘出した。滅菌 PBS を加えて磨砕し,適宜希釈して
BHIA 枚ずつに塗抹した。25°C で48時間培養し,S. 2
iniae コロニーを計数した。
統計処理
試験結果の統計学的処理には,
c
2
検定を用い,p <
0.05 を有意と判定した。
結 果
S. iniae の分離
調査した養殖場においては,2003年の ∼12月に大洲9
市で S. iniae によるレンサ球菌症が発生し,その時の累
積死亡率は約15%であった。この期間中の外見上異常が
認められない魚(開腹すると,腎臓または脾臓が肥大し
ている個体もみられた)の腎臓における S. iniae 保菌率
は,60%( 月),20%(10月),40%(11月),および9
20%(12月)であった。これ以外に定期調査サンプルか
ら S. iniae が分離されたのは,大洲市における2004年11
月(保菌率20%),2005年 月(10%)および12月(10 1
%)のみであった。一方,海水からは大洲市で2004年 7
月および11月に S. iniae が検出されたが(100∼200
CFU/250 mL),本症流行時には本菌は検出されなかっ
た。
ファージの分離
大洲市の養殖場の海水から2003年10月と11月,2004
年12月および2005年10月に,また今治市の養殖場の海水
から2004年12月に S. iniae の溶菌ファージが分離され
た。このうち,代表的なプラークをクローニングして得
た 株のファージ(PSiJ31,PSiJ32,PSiJ41,PSiJ42,6
185ヒラメレンサ球菌症のファージ療法
PSiJ51,PSiJ52)を以下の実験に使用した(Table 2)。
分離ファージの形態
分離されたファージの形成するプラークはいずれも円
形で,ほとんどのものが直径 ∼ mm であった(Fig. 12
1)。また,電子顕微鏡で観察したファージ粒子は,いず
れも約 60 nm の正二十面体の頭部と,約 160∼180 nm
のしなやかな尾部を有していた。これらの形態的特徴と
核酸として DNA を有することから,分離ファージは
Siphoviridae 科(Hendrix and Casjens, 2005)に分類さ
れた。
魚病細菌のファージ感受性
分離したファージ 株に対する S. iniae,S. parauberis6
および L. garvieae の感受性を Table 1 に示した。S. iniae
では,供試したヒラメ由来の35株中31株は,いずれの
ファージに対しても感受性を示した。残るヒラメ由来 S.
iniae 株のうち,香川県由来の 株はファージ 株中 株162
に対して,韓国済州島由来12株中の 株はすべての3
ファージ株に対して感受性がなかった。また,他魚種由
来の S. iniae 株として供試したブリおよびニジマス由来の
S. iniae (いずれも 株)はすべてのファージ株に対して1
感受性を示したが,S. iniae の type strain(AT CC29177
および AT CC29178:いずれもイルカ由来)は,いずれ
のファージに対しても感受性が認められなかった。一方,
S. parauberis および L. garvieae を含め,供試した S.
iniae 以外の魚病細菌 種24株は,いずれのファージにも8
感受性を示さなかった。
ファージの in vitro 増殖抑制効果
ファージを添加していない対照区の濁度は,S. iniae の
増殖により12時間後には OD = 0.7 に達した(Fig. 2)。
ファージ添加区では,MOI = 1 から MOI = 10
–4
のいずれ
のファージ株単独添加区およびファージ 株の混合添加4
区とも12時間後まで濁度の上昇はほとんどみられず,顕
著な S. iniae 増殖抑制効果が認められた。しかし,18時
間以降はどのファージ添加区でも菌の増殖が認められた。
Table 2. Source of Streptococcus iniae phages used in this
study
Isolation dateLocationStrain
2003. 10. 6Ozu, Ehime PrefecturePSiJ 31
2003. 11. 4Ozu, Ehime PrefecturePSiJ 32
2004. 12. 8Ozu, Ehime PrefecturePSiJ 41
2004. 12. 20Imabari, Ehime PrefecturePSiJ 42
2005. 10. 6Ozu, Ehime PrefecturePSiJ 51
2005. 10. 6Ozu, Ehime PrefecturePSiJ 52
Fig. 1. Plaques of S. iniae phage PSiJ41 in a double agar
plate.
Fig. 2. In vitro growth inhibition of Streptococcus iniae by
phages. S. iniae strain PSi402 and S. iniae phages
were inoculated at MOI = 1, 10
–2
, or 10
–4
, and shake-
cultured at 25°C for 24 h. The bacterial growth was
monitored optically. (Initial bacterial concentration:
10
5
CFU/mL) □ : individual phage strain (PSiJ31,
PSiJ32, PSiJ41, PSiJ42 from left); : mixed four
phage strains; ■ : control (no phage)
186 松岡 学・橋爪貴也・神崎博幸・岩本恵美・S. C. Park・吉田照豊・中井敏博
培養24時間後にファージ添加区から菌を分離し,それら
のファージ感受性を調べた結果,いずれもそれぞれの
ファージに対して感受性を示さなかった。
ファージの感染防御効果
計 回(試験 ∼ )の感染防御効果試験の結果を515
Ta ble 3,Fig. 3 および Fig. 4 に示す。なお,試験 ∼ 35
における各区の死亡尾数の推移は 水槽でほとんど同じ2
であったため,生残率の推移を示した Fig. 3 および Fig.
4 ではそれら 水槽の平均値としてプロットした。2
試験 ∼ では,全ての対照区で菌攻撃後 ∼ 日目14 12
から死亡が認められ, ∼ 日目に生残率は %となっ59 0
た。一方,菌攻撃後 時間目にファージを注射した試験1
区では,最初の死亡魚がみられたのは攻撃後 ∼ 日目24
とやや遅れ,11∼13日目以降には死亡魚はみられなかっ
た。15日間の観察期間中のファージ区の生残率は,試験
が28.0%,試験 が33.3%,試験 が48.0%( 水槽1232
の平均),試験 が80.0%( 水槽の平均)で,いずれの42
試験においても対照区に比べて有意に高かった(Ta ble
3, Fig. 3)。試験終了時におけるファージ区生残魚の S.
iniae 保菌率(腎臓)は,試験 ∼ でそれぞれ42.9%,14
40.0%,41.7%および6.3%であった(Ta ble 3)。死亡魚
から分離された菌についてファージ感受性を調べたとこ
ろ,対照区の分離菌はいずれのファージにも感受性が認
められたが,ファージ区の分離菌ではすべて感受性が認
められなかった。また,ファージ区生残魚からの分離菌
も,そのほとんどがファージ非感受性であった。
試験 の生残率の推移を Fig. 4 に示した。対照区では,5
攻撃後 日目から死亡がみられ, 日後には85.0%が死23
亡し,15日後の生残率は5.0%となった。一方,ファー
ジ接種区では,いずれも攻撃 日目から緩やかな死亡が3
続き,それらの生残率は12時間後ファージ接種区が
45.0%,24時間後ファージ接種区が32.5%と,いずれも
対照区に比べて有意に高かった。生残魚の保菌率は,12
時間後ファージ接種区が27.8%,24時間後ファージ接種
区が30.8%であった。死亡魚および生残魚由来菌の
ファージ感受性は上述の試験 ∼ のそれと同じ傾向が14
認められた(Ta ble 3)。
試験 と平行して行なったヒラメの腎臓および脳にお5
ける S. iniae 菌数の測定結果を Fig. 5 に示す。腎臓の菌
数は 時間後に10
3.6
CFU/ 尾であったが,その後急激に1
増加して12時間後に10
5.8
CFU/ 尾,24時間後に10
7.4
CFU/ 尾,さらに48時間後には10
8.1
CFU/ 尾にまで達し
た。一方,脳では12時間後でも10
2.0
CFU/ 尾と少なかっ
たが,24時間後に10
4.5
CFU/ 尾となり,48時間後には腎
臓の菌数とほぼ同数の10
7.7
CFU/ 尾が検出された。死亡直
後の魚体では,さらに オーダー程度増加し,腎臓が1
10
9.3
CFU/ 尾,脳が10
9.6
CFU/ 尾であった。
Table 3. Phage treatment of Japanese flounder infected with Streptococcus iniae
Reisolation % of
S. iniae from survi-
vors (no. of fish
positive/examined)
Survival rate (%)
of fish (no. of fish
alive/examined)
Injection dose
(PFU/fish) of
phages (time after
S. iniae injection)
Injection dose of
S. iniae (CFU/fish)
Average body
weight (g)
Average water
temperature
(°C)
No. of
experiment
43 (3/7)28 (7/25)
*
10
8.2
(1 h)10
7.7
16.524.21
– 0 (0/25)0
40 (4/10)33 (10/30)
*
10
8.2
(1 h)10
6.3
7.024.32
– 0 (0/30)0
33 (4/12)48 (12/25)
*
10
8.0
(1 h)10
6.4
14.124.93
50 (6/12)48 (12/25)
*
10
8.0
(1 h)
– 0 (0/25)0
– 0 (0/25)0
0 (0/14)70 (14/20)
*
10
8.4
(1 h)10
5.4
41.925.04
11 (2/18)90 (18/20)
*
10
8.4
(1 h)
– 0 (0/20)0
– 0 (0/20)0
30 (3/10)50 (10/20)
*
10
8.7
(12 h)10
5.4
56.425.25
25 (2/8)40 (8/20)
*
10
8.7
(12 h)
29 (2/7)35 (7/20)
*
10
8.7
(24 h)
33 (2/6)30 (6/20)
*
10
8.7
(24 h)
ND 5 (1/20)0
ND 5 (1/20)0
*
, p < 0.05; ND, not done
187ヒラメレンサ球菌症のファージ療法
考 察
我々は前報で,愛媛県下のヒラメ養殖場における E.
tarda およびそのファージの周年変動を調べ,エドワジエ
ラ症の発生の有無にかかわらず高水温期を中心にヒラメ
の E. tarda 保菌率は高く,また E. tarda ファージが養殖
環境水から高率に検出されることを示した(松岡・中井,
2004)。同じく愛媛県下のヒラメ養殖場で行った今回の
調査では,レンサ球菌症流行時には S. iniae 保菌率は高
かったものの,環境水中からの S. iniae と S. iniae
ファージの検出率はともに低かった。我々がこれまでに
行なったアユ養殖環境からの病原細菌に対するファージ
の検出においても,P. plecoglossicida ファージは高頻度
に分離されたのに(Park et al., 2000),Flavobacterium
psychrophilum ファージの分離率は低かった(未発表)。
このような養殖環境からのファージ分離率の違いは,自
然界における細菌の天敵としてのファージの存在意義を
考えると,興味深いところである。富栄養化し細菌数が
増加している沿岸域では,そこに存在するファージ数は
10
10
/L にも達する(Fuhrman, 1999)。ファージが細菌数
の調整者として重要な役割を担っているとすれば
(Bergh et al., 1989; Proctor and Fuhrman, 1990),病気
Fig. 3. Phage treatment of Japanese flounder infected with Streptococcus iniae (Experiments 1–4). Fish were intraperitoneally (IP)
injected with phage mixture (Expt. 1, 2: PSiJ31, PSiJ32; Expt. 3, 4: PSiJ31, PSiJ32, PSiJ41, PSiJ42) 1 h after IP-injection
with S. iniae strain PSi402 (See Table 3). ○ : control (no phage treatment); ● : phage-treated
Fig. 4. Phage treatment of Japanese flounder infected with
Streptococcus iniae (Experiment 5). Fish were intrap-
eritoneally (IP) injected with phage mixture (PSiJ31,
PSiJ32, PSiJ41, PSiJ42) 12 h or 24 h after IP-injec-
tion with S. iniae strain PSi402 (See Table 3). ○ :
control (no phage treatment); ■ : 24 h; ▲ : 12 h
Fig. 5. Kinetics of S. iniae in the Japanese flounder. Fish
were intraperitoneally injected with S. iniae strain
PSi402 at a dose of 10
5.4
CFU/fish and viable cell
counts of S. iniae in the brains and kidneys were car-
ried out using TSA plates. ○ : brain ; ● : kidney
188 松岡 学・橋爪貴也・神崎博幸・岩本恵美・S. C. Park・吉田照豊・中井敏博
が発生した養殖場周辺における病原体の存在はファージ
の出現(存在)に依存していると考えられる。環境に放
出された病原体が効率的にファージにより殺菌されると
したら(Imbeault et al., 2006),それは水平感染による病
気の伝播に影響すると考えられるので,養殖場での病気
の消長にファージが関わっている可能性がある。
愛媛県下のヒラメ養殖場の環境水に由来するファージ
株を使った S. iniae のファージ感受性試験では,供試し
たヒラメ病魚由来株の多くがほぼ同じファージ型に属し,
またブリやニジマス由来の菌株でもこれらのファージに
感受性を有したことから,魚類病原性 S. iniae のファー
ジ型の均質性が示唆された。しかし,今回供試した
ファージ株が 株と少ないことから,本菌のファージ型6
に関しては,さらに多くのファージ株を用いてまた外国
あるいは陸上動物由来の S. iniae 株も含め詳細に検討す
る必要がある。
本研究の主眼は,ヒラメの S. iniae 感染症に対する
ファージ療法の可能性を探ることにあった。ヒラメを用
いた感染防御試験に先立って行なった in vitro 増殖抑制試
験では,供試ファージは MOI = 10
–4
においても S. iniae
の増殖を一時的にではあるが抑制した。なお,培養18時
間以降における増殖はファージ非感受性細胞による。ま
た,感染防御試験では,供試したヒラメのサイズ,攻撃
菌濃度,ファージの株数が異なるものの,ファージ投与
区でいずれも有意な生残率の向上が確認された。ファー
ジ投与区での試験区間の生残率に28.0%から80.0%と開
きがみられたのは,S. iniae の攻撃菌濃度の違いによると
思われる。さらに,魚体内の S. iniae 菌濃度が 10
7
CFU/ 尾にもなる菌攻撃24時間後にファージを接種しても
生残率が向上した。これらのことは,本菌感染症の治療
にファージ投与が有効であることを示唆している。
ファージ治療試験において,感染がかなり進行したス
テージでファージを投与しても治療効果が期待できるこ
とは,アユの P. plecoglossicida 感染に対するファージ治
療実験や(Park et al., 2000),また魚類以外でも,重篤
な状態にある VRE (バンコマイシン耐性腸球菌)感染マ
ウスに対するファージの投与実験において報告されてい
る(Biswas et al., 2002)。
しかしながら,本研究でのヒラメのレンサ球菌症に対
するファージ治療においては,ファージ投与区で死亡し
た魚から,投与したファージに対して感受性がない S.
iniae 株が分離された。このことは,S. iniae では比較的
容易に in vivo で増殖可能なファージ非感受性菌,換言す
れば,病原性を有するファージ耐性菌が出現することを
示唆し,この点は S. iniae 感染症に対するファージ療法
の成否に関わる重要な問題である。病原性大腸菌の感染
に対するファージ投与の有効性がマウスあるいは産業動
物を用いた実験で報告されて以来(Smith and Huggins,
1982; 1983),医学分野も含めファージ療法の有効性を示
す研究報告がなされているが(Sulakvelidze et al., 2001;
Merril et al., 2003; Kutter and Sulakvelidze, 2004),
ファージ療法の大きな問題点として,in vivo でのファー
ジ耐性菌の出現の可能性がまず指摘されてきた。しかし,
上述の大腸菌感染症に対するファージ治療では,ファー
ジ投与後に in vivo で病原性 E. coli(K
+
株)が出現するこ
とは極めてまれであると報告されており(Smith and
Huggins, 1982; 1983),またアユの細菌性出血性腹水症
でもファージ治療後に死亡したアユからファージ耐性 P.
plecoglossicida 菌は分離されていない(Park and Nakai,
2003)。これらのことは,ファージ耐性菌(ファージ非
感受性変異株)は in vivo では増殖し難いか,あるいはそ
れらは主要な病原因子を欠いている可能性を示唆する。
今後は,まず in vivo で出現したファージ非感受性 S.
iniae の性状およびヒラメに対する病原性について詳細な
検討を行なうとともに,S. iniae のファージ非感受性化・
耐性化機構について検討する必要がある。
謝 辞
本研究に供試した S. iniae 菌株を分与していただいた
香川県水産試験場および抗 S. parauberis 家兎血清を供与
していただいた長崎大学金井欣也教授に深謝いたします。
本研究は,ヒラメ養殖技術高度化研究(愛媛県単独事業)
および先端技術を活用した農林水産研究高度化事業(課
題番号18075) によって行われた。
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