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PROGRAMME COMMUNAUTAIRE POUR L'APICULTURE (Règlement CE n°1221/97)

Authors:
1
PROGRAMME COMMUNAUTAIRE
POUR L’APICULTURE
(Règlement CE n°1221/97)
Thème de l'appel d'offre : a) assistance technique aux apiculteurs
ANALYSE DE LA BIODIVERSITE DU CHEPTEL FRANÇAIS DE
L’ABEILLE DOMESTIQUE
ETUDES D’IMPACT EN VUE DE LA MISE EN PLACE DE
CONSERVATOIRES GENETIQUES
Rapport de fin de 1ère année
(2003-2004)
Responsable scientifique :
L. Garnery
Laboratoire Populations Génétique Evolution
Bât 13, avenue de la terrasse
91198 Gif-sur-Yvette
Personnes impliquées : M. Baylac, G. Arnold, A. Rortais
D. François, M. Lamothe
Mots clés: Apis mellifera / biodiversité / structure génétique / conservatoire génétique /
marqueurs moléculaires / morphométrie / éco-éthologie
Le rapport présente la synthèse des travaux réalisés du 01/09/2003 au 30/08/04.
Le résumé est en page 4
2
PLAN
Résumé 4
Introduction 6
Objectifs du projet 8
1ère Partie : Analyse de la biodiversité du cheptel français de l’abeille domestique 9
1/ Principe 9
2/ Echantillonnage 10
2-1/ Généralités 10
2-2/ Méthode d’échantillonnage 10
2-3/ Echantillonnage réalisé (au 30-08-04) 11
3/ Approche moléculaire 13
3-1/ Les marqueurs moléculaires 13
3-2/ Méthodes 14
3-3/ Résultats 16
3-4/ Conclusion sur l’approche moléculaire 21
4/ Approche morphométrique 21
4-1/ Contexte 21
4-2/ Mise au point du système de mesure automatique 22
4-3/ Résultats 22
4-3-1/ Bases d'images et de mesures (morphométrie géométrique) 22
4-3-2/ Analyse statistique de la base morphométrique 24
4-4/ Conclusions 29
5/ Perspectives 29
5-1/ Deuxième année du projet 29
5-1-1/ Approche moléculaire 29
5-1-2/ Approche morphométrique 29
5-2/ Perspectives ultérieures 30
3
5-2-1/ Approche moléculaire 30
5-2-2/ Approche morphométrique 30
2ème partie : Etude d’impact en vue de la mise en place de conservatoires génétiques 32
1/ Principe 32
2/ Etude moléculaire (ADN nucléaire) 32
2-1/ Matériels et Méthodes 32
2-1-1/ Echantillonnage 32
2-1-2/ Analyse statistique 35
2-2/ Résultats 37
2-2-1/ Appartenance d’une population à une lignée évolutive 37
2-2-2/ Structure génétique des populations analysées 40
2-2-3/ Choix des colonies pour la constitution du conservatoire 47
3/ Approche éco-éthologique 49
4/ Perspectives 50
4-1/ 2ème année du projet 50
4-2/ Perspectives ultérieures 52
3ème partie : Diffusion des résultats 53
1/ Au niveau national 53
1-1/ Diffusion des résultats aux apiculteurs 53
1-2/ Première réunion de travail 53
1-3/ Deuxième réunion de travail 54
1-4/ Article de vulgarisation 54
1-5/ Site web 54
2/ Au niveau international 54
2-1/ Congrès internationaux 54
2-2/ Articles scientifiques 55
4ème partie : Références bibliographiques et Annexes 56
Références bibliographiques 56
Annexes 59
4
RESUME
Analyse de la biodiversité du cheptel français de l’abeille domestique.
Etudes d’impact en vue de la mise en place de conservatoires génétiques.
Responsable scientifique : L. Garnery, Laboratoire PGE, CNRS, Gif-sur-Yvette
Résumé du rapport de fin de 1ère année (2003-2004)
1/ Analyse de la biodiversité du cheptel français de l’abeille domestique.
La caractérisation des abeilles a été réalisée au moyen de deux types d’approche : l’analyse moléculaire
(ADN mitochondrial) et l’analyse morphométrique.
L’analyse moléculaire a porté sur 1792 colonies provenant de 13 régions. Elle a montré que les abeilles
ayant une origine maternelle appartenant à la race indigène Apis mellifera mellifera (« abeille noire ») restent
très prédominantes en France, et représentent 85 % des individus échantillonnés à ce jour (Figure 1a). La
répartition des haplotypes est très différente selon les régions (Figure 1b) ; le profil génétique des
populations varie en fonction de l’histoire évolutive, et fait apparaître l’émergence d’une différenciation
locale.
Figure 1 : Origine maternelle des colonies d’abeilles en France.
1a : Proportions des différentes lignées mitochondriales (en rouge : l’abeille noire A. m. mellifera, en bleu :
les lignées C et O). 1b : Répartition des différents haplotypes de la lignée M (représentés chacun par une
couleur) montrant les différenciations régionales.
L'analyse morphométrique est réalisée grâce à la numérisation des ailes, suivie de la mesure de 19 points
repères (Figure 2a). En tout, 165 000 mesures ont été réalisées à la fois sur des abeilles d'origine française (n
= 1016), et sur des abeilles de différents pays afin de disposer de populations de référence (n = 1163). Les
résultats préliminaires montrent que les lignées évolutives sont très correctement identifiées mais que les
discriminations à l'intérieur de la lignée M apparaissent faibles et peu fiables dans l'ensemble (Figure 2b). La
diversité morphologique au niveau français, bien que faible, montre un certain degré de régionalisation, gage
d'une pertinence qui devra être étudiée plus avant.
1a 1b
5
Alpes
Corrèze
Haute-Vienne
Lot
Normandie
Nord
Corse
Vendée
Tchécoslovaquie
Buckfast
Chypre
Grèce
Ukraine
Bulgarie
Algérie
Alpes
Haute-Savoie
Lot
Orne
Cors e
Portugal
Buckfas t
Cro ati e
Ukrai ne
Cauc ase
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
100,00
Pourc entages de class ements
Alpes
Auvergne
Corrèze
Haute-Savoie
Haute-Vienne
Landes
Lot
Maine-et-Loire
Normandie
Orne
Nord
Belgique
Corse
Var
Vendée
Portugal
Tchécoslovaquie
Hongrie
Buckfast
Italie
Chypre
Croatie
Grèc e
Péloponèse
Ukraine
Arménie
Bulgarie
Caucase
Algérie
Maroc
Figure 2 : Approche morphométrique
2a : Localisation des 19 points-repères alaires. 2b : Pourcentages de classements corrects.
2/ Etudes d’impact en vue de la mise en place de conservatoires génétiques
Afin de préserver certaines populations d’abeilles bien adaptées à des conditions climatiques et/ou à des
espèces végétales particulières, il est important - et urgent - de créer des conservatoires d’abeilles, ce qu’ont
entrepris plusieurs associations apicoles régionales. A leur demande, nous intervenons dans le cadre d’un
soutien scientifique pour caractériser les colonies à conserver, au moyen d’une approche moléculaire basée
sur l’utilisation de l’ADN nucléaire : marqueurs microsatellites. Dans les Alpes de Haute-Provence,
l’échantillonnage a porté sur 142 colonies réparties dans 15 ruchers, et en Corse, sur 199 colonies réparties
dans 54 ruchers. Pour chaque abeille, 9 ou 10 locus microsatellites ont été analysés, ce qui nous a conduit à
déterminer l’origine d’environ 6500 allèles. Comme pour la morphométrie, ces populations ont été
comparées à des populations de référence appartenant aux lignées M, C, A et O (Figure 3).
Nos résultats nous ont permis de sélectionner les colonies à conserver, au nombre de 23 dans les Alpes de
Haute-Provence, et de caractériser la structure génétique des populations d’abeilles en Corse.
Figure 3 : Analyse en Coordonnées Principales
(ACP) des populations de Corse, des Alpes de
Haute-Provence et des populations de référence
appartenant aux lignées M, C, A et O.
2a 2b
6
Introduction
Biodiversité de l’abeille
Comme la plupart des espèces, la structure génétique « naturelle » de l’abeille s’est mise en place
en fonction de nombreux facteurs incluant : l’histoire et la démographie des populations, l’éventuel
isolement de groupes de populations, les migrations naturelles, mais également l’adaptation aux
conditions locales sous l’action de la sélection Darwinienne. Ainsi, l’abeille domestique Apis
mellifera occupe une aire géographique très vaste et montre une variabilité morphologique et
génétique très structurée.
L’aire de répartition naturelle de l’abeille domestique s’étend à l’Afrique, à l’Europe et au Moyen-
Orient. Dans son aire de distribution d’origine, 26 sous-espèces (ou races géographiques) ont été
décrites sur la base de caractères morphologiques, écologiques et comportementaux (Ruttner 1988 ;
Sheppard et al. 1997 ; Sheppard et Meixner 2003).
D’après des données de morphométrie et de paléogéographie, Ruttner et al. (1978, 1988) ont
suggéré l’existence de 4 lignées évolutives chez l’abeille, chacune regroupant plusieurs
races géographiques: la lignée M (races ouest-méditerranéennes), la lignée A (races africaines), la
lignée C (races nord-méditerranéennes), et la lignée O (races de Turquie et du Caucase).
Les résultats obtenus par l’analyse de l’ADN mitochondrial (ADNmt) ont permis de confirmer la
plupart des conclusions de Ruttner (Smith 1991, Garnery et al., 1992 ; 1995 ; Arias et Sheppard
1996). En particulier les lignées M, A et C sortent de l’ensemble des études réalisées avec
différents gènes du génome mitochondrial. En fonction des gènes mitochondriaux étudiés, les
abeilles du Caucase et de Turquie apparaissent soit sous la forme d’une lignée différenciée (lignée
O), soit comme faisant partie de la lignée C. Plus récemment l’utilisation de marqueurs du noyau
(séquences microsatellites) a définitivement établi l’existence des quatre lignées évolutives décrites
par Ruttner (Franck et al. 2000, Garnery et al. en prep).
Anthropisation des populations
Comme de nombreuses espèces sauvages, la diversité de l’abeille, sur son aire de répartition
naturelle, subit les effets des pratiques humaines en général (fractionnement des habitats), et
agricoles en particulier (monoculture, utilisation inadaptée voire massive de pesticides). Ces
pratiques conduisent, de manière générale, à une diminution de la biodiversité végétale qui risquent
de faire disparaître certaines adaptations locales, en particulier à des plantes sauvages. Dans le cas
plus précis de l’usage inadapté des pesticides, qui entraîne une forte diminution des populations,
7
ces pratiques risquent d’appauvrir le réservoir génétique d’un nombre important d’espèces (dont
celui de l’abeille) et fragiliser les capacités d’adaptation de celles-ci.
Du fait de son intérêt en tant qu’espèce productrice (miel, pollen, cire, gelée royale, propolis) et de
son importance dans la pollinisation des plantes sauvages et cultivées, la variabilité naturelle de
cette espèce subit les effets directs de l’apiculture moderne. En particulier ce sont les importations
par l’homme qui ont conduit à sa présence, puis à sa dispersion, en dehors de son aire naturelle de
répartition, en Amérique et en Océanie.
Certaines pratiques apicoles, telles que les importations de reines et la transhumance des colonies,
vont avoir tendance à accélérer de manière artificielle les migrations entre des populations
fortement différenciées et contribuer ainsi à les homogénéiser. Ces pratiques s’opposent donc aux
forces qu’exerce la sélection naturelle qui différencie les populations.
Par exemple, en Allemagne, la race A. m. carnica, qui appartient à la lignée C, a été importée
massivement il y a quelques dizaines d’années, et a pratiquement remplacé les populations d’A. m.
mellifera (Kauhausen-Keller and Keller, 1994). La situation est quasiment identique en Suisse, et
au Luxembourg, où les abeilles de la lignée synthétique Buckfast ont été très introduites.
En France, des travaux préliminaires (Garnery et al. 1998) ont montré que la situation n’est pas
arrivée à cette situation extrême. Dans notre pays, la race d’abeille indigène est A. m. mellifera qui
appartient à la lignée Ouest-Méditerranéenne (lignée M). Du fait de son orientation Nord/Sud lors
des étapes de refuges et de recolonisations post-glaciaires , cette lignée montre un niveau de
variabilité naturelle très inférieur à celui observé dans les autres lignées (Garnery 1992 ; Estoup et
al., 1995 ; Garnery et al., 1998a et b, Franck et al., 1998).
Malgré cette faible variabilité, des différences ont été observées au niveau local pour certains
caractères écologiques et comportementaux. Cette différenciation locale peut correspondre à une
simple plasticité liée à des accommodations (sans support héritable), ou bien à une réelle adaptation
locale définissant une véritable population écotypique.
Ainsi, une partie des différences observées jusqu’à présent aux niveaux morphologique, écologique
et comportemental en Bretagne, en Corse, dans le Puy-de-Dôme, ou encore dans les Landes (Louis,
1960 ; Louveaux et al., 1966 ; Mesquida 1975, Mallet 1976, Battesti, 1980 ; Cornuet et al., 1982,
Bonnet et al., 1987 ; Mallet 1990), peut correspondre à des adaptations locales (climats, flores,
parasites). Pour l’instant, le seul exemple d’écotype pour lequel la preuve d’une adaptation ait été
montrée scientifiquement est celui de l’écotype landais (Louveaux et al. 1966, Louveaux 1970).
8
Il apparaît donc particulièrement important, et urgent, de caractériser le niveau de différenciation
des populations françaises de l’abeille domestique au moyen d’outils performants (moléculaires,
morphométriques, comportementaux,…), afin : (i) d’estimer l’importance des effets anthropiques
sur la variabilité des populations, (ii) d’évaluer le niveau de différenciation des populations
françaises, (iii) de détecter la présence potentielle d’écotypes de l’abeille noire (A. m. mellifera).
Ces trois étapes sont particulièrement importantes avant d’envisager la préservation de la
biodiversité des abeilles en France, et sont essentielles à une meilleure gestion de la biodiversité du
cheptel.
Des associations d’apiculteurs, dans plusieurs régions françaises, conscientes de la richesse de leur
patrimoine apicole, ont d’ailleurs créés des conservatoires d’abeilles, ou s’apprêtent à le faire.
C’est en collaboration avec ces associations que nous avons initié ce projet dont le but final est une
meilleure connaissance de la biodiversité de l’abeille conduisant à une meilleure gestion durable de
celle-ci.
Objectifs du projet
Ce projet a plusieurs objectifs.
Il s’inscrit dans le cadre général de l’analyse de la diversité morphologique et génétique des
populations d'Apis mellifera melliferaabeille noire ») en France. Il vise, en particulier, à en
caractériser la diversité naturelle, et à établir un bilan du cheptel apicole français. Parmi les
objectifs attendus, il s'agira de conserver au travers de la diversité des populations géographiques
incluses dans le programme, le maximum de diversité trouvée. Ce projet sert donc de support
scientifique à la création et au maintien de conservatoires.
Ce projet vise également à analyser la diversité génétique de colonies d’intérêt apicole (bonnes
productrices de miel, de gelée royale, douces, etc….).
Enfin, le but de ce projet est de développer pour la filière apicole des outils morphométriques
puissants (morphométrie géométrique) et opérationnels, et de regrouper l’ensemble des résultats
dans une base de données unique utilisable par la profession.
Les résultats présentés dans ce rapport ont été obtenus entre le 1er décembre 2003, qui correspond à
la date réelle de début du contrat (qui était prévue le 1er septembre 2003) et le 30 août 2004 (date de
fin de contrat).
9
1ère Partie : Analyse de la biodiversité du cheptel français de l’abeille domestique
1/ Principe
L’identification des abeilles (lignées, races, écotypes,…) peut être envisagée au moyen de deux
types d’approche : les approches morphométriques et les approches moléculaires. Les approches
morphométriques, plus faciles à mettre en œuvre, ne sont pas actuellement assez précises pour
permettre de s’affranchir des approches moléculaires. Cette imprécision est liée à plusieurs facteurs
tels que la méthodologie déployée ou le matériel de mesure utilisé. Les mesures prises de manière
indépendante, avec un matériel différent, entraînent le plus souvent la création artificielle d’une
variabilité qui peut être du même ordre de grandeur que celui de la variation réellement observée.
Au demeurant, les méthodes moléculaires, qui sont basées sur l’étude directe de l’ADN, resteront,
in fine, les seules en mesure de déterminer avec une absolue certitude l’origine génétique des
abeilles.
Dans le cadre de cette première partie du projet, les approches morphométriques et moléculaires
sont menées en parallèle sur les mêmes échantillons, dans le but de trouver des corrélations entre la
forme des ailes (représentée par 19 points repères) et les « profils moléculaires ». Quand de telles
corrélations seront trouvées, il ne sera plus indispensable de réaliser l’ensemble des analyses
moléculaires, puisque une partie de la détermination pourra être réalisée par les analyses
morphométriques basées sur la forme des ailes, et, éventuellement, d’autres facteurs (forme de la
langue, coloration,…).
Les deux types de marqueurs moléculaires utilisés sont l’ADN mitochondrial (ADNmt) et les
microsatellites. Etant donné que les analyses microsatellites sont très lourdes à réaliser, puisqu’elles
doivent être faites sur une dizaine de locus par individu, elles ne peuvent pas être systématiquement
envisagées pour toutes les abeilles. C’est pourquoi, dans un premier temps, le niveau
d’introgression des populations françaises est évalué avec l’ADN mt.
Par contre, lorsqu’il s’agit de déterminer précisément quelles colonies peuvent être intégrées dans
un conservatoire d’abeilles, le niveau d’analyse doit être beaucoup plus précis. L’appartenance de
la colonie à la race mellifera est validée à la fois par l’analyse mitochondriale et par l’analyse
microsatellite.
10
2/ Echantillonnage
2-1/ Généralités
Dans le cadre de l’étude de la biodiversité de l’abeille dans l’ensemble des régions françaises,
l’échantillonnage a été réalisé, à ce jour, dans 16 des 22 régions (voir tableau 1). Les 6 dernières
régions seront échantillonnées ultérieurement.
Dans ces 16 régions, 26 départements ont été échantillonnés. Le nombre important d’abeilles à
analyser ne nous permet pas d’élargir l’étude aux autres départements français, dans le cadre de ce
programme prévu pour une durée de 2 ans. Si une telle étude est demandée, elle nécessitera une
prolongation du contrat.
Dans le cadre du support scientifique à la mise en place de conservatoires gérés par des associations
d’apiculteurs, l’échantillonnage a porté sur un grand nombre de colonies afin de caractériser celles
qui sont génétiquement les plus proches de la souche à conserver, et qui peuvent être retenues.
2-2/ Méthode d’échantillonnage
Afin de pouvoir analyser les résultats en terme de populations, les ruchers échantillonnés doivent
couvrir une zone de 15 kilomètres de rayon, dans laquelle sont prélevées 50 abeilles. Ainsi, dans
chaque département, 4 populations, soit un total de 200 abeilles, sont échantillonnées dans 4 zones
distinctes.
Une abeille est prélevée par colonie, et l’échantillonnage est réalisé de manière proportionnelle au
nombre de colonies présentes chez les différents apiculteurs. Ce mode de prélèvement ne permet
évidemment pas de caractériser chacune des colonies, mais il permet de caractériser une population
locale.
A la suite d’une réunion de travail qui s’est déroulée en novembre 2003, plusieurs responsables
d’associations régionales d’apiculture se sont proposés pour prendre en charge le suivi du
prélèvement des abeilles de leur région (Aquitaine, Auvergne, Bretagne, Corse, Limousin, Nord -
Pas-de-Calais, Basse-Normandie, Haute-Normandie, Pays de la Loire, Provence - Alpes - Côte
d’Azur, Rhône - Alpes). Afin de réaliser l’échantillonnage dans les autres régions, des apiculteurs
ont été contactés et ont accepté cette tâche (Franche-Comté, Bourgogne, Ile-de-France, Midi-
Pyrénées et Languedoc-Roussillon).
Afin de couvrir toutes les régions de France, des contacts sont pris pour les 6 régions restantes
(Alsace, Centre, Champagne-Ardennes, Lorraine, Picardie et Poitou-Charentes).
11
Pour réaliser l’échantillonnage, nous envoyons des tubes numérotés de 2 ml contenant de l’alcool
absolu, afin d’y placer les abeilles prélevées. Une feuille d’échantillonnage où sera notée l’origine
de la colonie est également jointe (cf. Annexe 1). Il est également demandé aux apiculteurs qui
réalisent l’échantillonnage de fournir, si possible, une photocopie d’une carte d’état major sur
laquelle est portée la localisation précise des prélèvements, voire les coordonnées GPS. Ces
données nous permettent de dresser, pour chaque département, une carte représentative de la
diversité génétique des populations d’abeilles échantillonnées.
Il est important de préciser si les colonies appartiennent à un rucher sédentaire ou transhumant, et si
la reine a été achetée (si les informations sont connues), de connaître sa souche (par ex. Starline,
Buckfast, etc...) et son origine (par ex. ligustica d’Italie ou de Nouvelle Zélande). Ces
renseignements sont destinés à enrichir notre base de données et à conforter le système expert de
classement.
2-3/ Echantillonnage réalisé (au 30-08-04)
Le tableau 1 présente le nombre de tubes envoyés pour réaliser les prélèvements, ainsi que le
nombre d’échantillons reçus : 4115 tubes ont ainsi été envoyés dans 16 régions, 2395 abeilles ont
été reçues au 30-08-04 (soit 58 % du total envoyé) et 1720 sont attendues.
12
Régions Départements Tubes Echantillons Nombre d'abeilles analysées
échantillonnés envoyés reçus attendus Mito. Microsat. Morpho**
Alsace
Aquitaine 47 (Lot-et-
Garonne) 200 100 100 100 48
Auvergne 63 (Puy-de-Dôme) 800 150 650 50 48
Bourgogne 21 (Côte-d'Or) 150 100 50 50
58 (Nièvre) 50 50 0 0
Bretagne 22 (Côtes-d'Armor) 100 0 100 0
29 (Finistère) 150 50 100 0
35 (Ile-et-Vilaine) 100 50 50 0
56 (Morbihan) 100 0 100 0
Centre-Val de
Loire
Champagne-
Ardenne
Corse 2A - 2B 200 200 0 200 199 179
(C. du Sud, Hte C.)
Franche-Comté 39 (Jura) 200 100 100 100
Ile-de-France 75-92-94 50 0 50 0
78 (Yvelines) 40 30 10 30
Languedoc- Rous. 48 (Lozère) 175 175 0
Limousin 19 (Corrèze) 50 50 0 50 48
23 (Creuse) 67 67 0 67
87(Hte-Vienne) 133 129 4 83 98
Lorraine
Midi-Pyrénées 09 (Ariège) 50 0 50 0
Nord-Pas-de-
Calais 59 (Nord) 100 61 39 61 10
Normandie
(Basse) 61 (Orne) 200 200 0 200 50
Normandie
(Haute) 76 (Seine-Marit.) 200 200 0 168 59
Pays de la Loire 49 (Maine et Loire) 60 60 0 60 49
85 (Vendée) 140 140 0 140
200* 147
Picardie
Poitou-Charentes
Provence-Alpes- 04 (Alpes Hte-Pro.) 200 142 58 142 142 21
Côte d'Azur 83 (Var) 200 162 38 162
162* 100
Rhône Alpes 73 (Savoie) 200 50 150 0
74 (Haute-Savoie) 200 129 71 129 129
Total 4115 2395 1720 1792 703 986
Pourcentages
58% 42% 75% 29% 41%
de l’échantillonnage des abeilles reçues
Tableau 1 : Récapitulatif de l’échantillonnage et des résultats d’analyses au 30-08-04.
* : analyses statistiques en cours
** : Le nombre d’ailes mesurées est en fait le double de ce qui est indiqué, puisque les mesures et les photos
ont été répétées une fois, de façon à réduire l’erreur de mesure.
Parties grisées : échantillonnage à réaliser ultérieurement
13
3/ Approche moléculaire
3-1/ Les marqueurs moléculaires
Deux types de marqueurs moléculaires complémentaires sont actuellement utilisés en routine pour
étudier la diversité génétique : l'ADN mitochondrial et l'ADN nucléaire (10 locus microsatellites).
L’ADN mitochondrial
L’analyse de l’ADN mitochondrial permet de déterminer l’origine maternelle des colonies, de
réaliser une première estimation du niveau d’introgression à l’échelle de la population, ainsi que
d’estimer le niveau de diversité de la population. Du fait de sa transmission maternelle, tous les
individus issus de la reine (ouvrières, mâles, et reines de la génération suivante) possèdent le même
type mitochondrial (haplotype). Ainsi, ce test permet de déterminer, sans ambiguïté, la lignée
d'origine (M, A, O ou C) de la colonie étudiée. Il est donc particulièrement efficace pour
caractériser les colonies importées (ou colonies descendantes des colonies importées) provenant des
lignées C, O et A.
L’utilisation de l'ADN mitochondrial est basée sur le test COI – COII (Garnery et al., 1993). Dans
une population d’abeille donnée, l’étude de l’ADNmt permet donc de déterminer le niveau général
d’introgression maternelle de la population, qui est formulé par le pourcentage d’abeilles provenant
de chaque lignée évolutive (a % de la lignée M, b % de la lignée C, c % de la lignée O et d % de la
lignée A). Une variation étant observée à l’intérieur de chaque lignée, il est possible également
d’estimer un indice qui permettra de déduire le niveau de variation de la population, ceci en tenant
compte ou non des niveaux d’importation.
Les marqueurs microsatellites
Les marqueurs microsatellites sont des marqueurs à hérédité biparentale. Les ouvrières et les reines
de la génération suivante possèdent toutes, à chaque locus de l’ADN, un allèle paternel et un allèle
maternel. L’utilisation de plusieurs sondes microsatellites (en général une dizaine de locus) permet
donc d’estimer le niveau de variabilité à l’échelle de la population, mais également de déterminer
pour chaque abeille un profil d’introgression, qui varie entre 0% (tous les allèles microsatellites
proviennent de la même lignée) et 100% (tous les allèles proviennent des autres lignées). En toute
logique, ce profil d’introgression peut également être estimé à l’échelle de la population.
14
L’utilisation des marqueurs microsatellites sur une seule abeille par colonie ne permet pas de
distinguer les introgressions liées aux reines de celles liées aux mâles. Toutefois, les analyses
mitochondriales menées en parallèle permettent de déterminer la première, c’est pourquoi ces deux
types de marqueurs sont qualifiés de complémentaires.
Dans les populations d’abeilles où les apiculteurs-éleveurs interviennent peu, les reines vierges et
les mâles des ruchers environnants se fécondent naturellement, et les niveaux d’introgression
évalués par les deux méthodes ne devraient pas être sensiblement différents.
Par contre, dans le cas où des élevages intensifs de reines d’une race déterminée sont réalisés, alors
que des mâles de différentes races sont présents dans les ruchers environnants, il pourra y avoir une
différence entre les niveaux d’introgression maternel et paternel. Par exemple, si l’apiculteur élève
des reines noires, et qu’elles sont fécondées dans la nature par un mélange de mâles noirs et de
mâles ligustica, l’analyse de l’ADN mt des ouvrières qui descendent de ces fécondations ne
montrera aucune introgression (elles seront « pures noires »), alors que l’ADN nucléaire
(microsatellites) sera partiellement introgressé par certains allèles ligustica.
Etant donné que les analyses microsatellites sont très lourdes à réaliser, puisqu’elles doivent être
faites sur une dizaine de locus, elles ne peuvent pas être systématiquement envisagées pour toutes
les abeilles. C’est pourquoi, dans un premier temps, le niveau d’introgression des populations
françaises est évalué avec l’ADN mitochondrial.
Par contre, lorsqu’il s’agit de déterminer précisément quelles colonies peuvent être intégrées dans
un conservatoire d’abeilles, le niveau d’analyse doit être beaucoup plus précis. L’appartenance de
la colonie à la race mellifera est validée à la fois par l’analyse mitochondriale et par l’analyse
microsatellite. Dans ce cas, l’analyse de l’ADN nucléaire (locus microsatellites) nous permet de
déterminer les niveaux d’introgression dans les colonies, et par la même de sélectionner des
colonies faiblement introgressées pour la constitution de conservatoires génétiques.
3-2/ Méthodes
Extraction de l’ADN
L'ADN total a été extrait à partir du thorax de chacun des individus, selon deux méthodes :
- le protocole rapide basée sur l'utilisation du Chelex (Estoup et al., 1996) pour l’ensemble
des échantillons de chaque département, sauf 20 échantillons
15
- la méthode de Wilson, qui est une technique plus longue d’utilisation, mais qui permet de
préserver plus longtemps l’ADN, sur les 20 échantillons restants. Ces échantillons serviront pour
une analyse ultérieure avec un autre test encore plus discriminatif (« test A-T »).
Le test mitochondrial
La région intergénique COI-COII de l'ADN mitochondrial (ADNmt) a été étudiée selon le
protocole décrit par Garnery et al. (1993). Il repose sur l'amplification de la région intergénique
située entre les gènes des sous-unités I et II de la cytochrome oxydase, suivie de sa digestion par
l'enzyme de restriction Dra I. Ce test est particulièrement adapté aux estimations des introgressions
maternelles dans la population (Garnery et al. 1998a, Franck et al. 1998).
i) Polymorphisme entre les lignées évolutives
Ce test permet de déterminer la lignée d'origine de la colonie étudiée : M, A ou l’ensemble C et O
(Garnery et al. 1993; 1995; 1998b; Franck et al. 1998, 2000, 2001; De la Rua et al. 1998). Il est à
noter que les abeilles de la lignée O ne sont pas distinguables de celles de la lignée C par le test
mitochondrial, mais le sont par le test microsatellites.
ii) Polymorphisme dans une même lignée
Un polymorphisme important existe également à l'intérieur des lignées, qui peuvent montrer
différents haplotypes (profil moléculaire). Les haplotypes sont codés en fonction de leur
appartenance à une lignée et comportent chacun un numéro (exemple M4 = haplotype 4
appartenant à la lignée M).
ADN nucléaire (microsatellites)
Les marqueurs microsatellites sont constitués de séquences répétées dont le nombre de répétitions
varie d'un allèle à un autre. Chaque allèle trouvé pour chacun des locus est donc caractérisé par une
taille qui lui est propre, et c'est cette taille qui est analysée sur les gels de migration.
Chaque ouvrière possède deux allèles pour chaque locus, un provenant de la mère et un provenant
du père. Les allèles peuvent être soit différents (l’abeille est alors qualifiée d'hétérozygote à ce
locus), soit identiques (dans ce cas elle est homozygote à ce locus).
Dix locus microsatellites (A7, A28, A88, A113, Ap43, Ap66, Ap55, Ap81, B24 et B124) sont
utilisés dans cette étude. La plupart d’entre eux sont considérés comme particulièrement
discriminants entre les lignées M et C (Garnery et al. 1998b).
16
Le protocole d'amplification de ces locus utilise les conditions générales décrites par Estoup et al.
(1995), modifiées par Garnery et al. (1998b).
3-3/ Résultats
Situation générale
La figure 1 présente les proportions des différentes lignées évolutives dans les régions françaises
analysées.
Figure 1 : Proportions des différentes lignées mitochondriales dans les régions françaises (lignée
M, en rouge, lignées C et O en bleu, lignée A en jaune). Le nombre d’abeilles analysées est indiqué
sous le nom des régions.
Les abeilles ayant une origine maternelle appartenant à la race mellifera (lignée évolutive M)
restent très prédominantes en France, et représentent 85 % des abeilles échantillonnées à ce jour.
Les abeilles des lignées évolutives C et O en représentent ensemble 14,7 %, et celles de la lignée A,
seulement 0,3 %.
17
La lignée M étant celle qui est naturellement présente en France, les abeilles des lignées C et O sont
principalement le résultat des importations de reines qui ont eu lieu depuis des dizaines d’années,
en particulier des races ligustica, caucasica et carnica, et, plus récemment, de la lignée synthétique
Buckfast.
Il est important de noter que d’autres races sont présentes autour de la France, en particulier en
Italie, en Allemagne et en Suisse. Dans ces pays, on trouve respectivement A. m. ligustica, et A.m.
carnica, qui appartiennent à la lignée C. Ainsi A.m. mellifera s’hybride avec A. m. ligustica dans
les vallées alpines (Sheppard and Berlocher, 1985) et en ligurie.
Par ces frontières, la France est donc perméable, de façon naturelle, à des flux de gènes en
provenance de colonies d’abeilles de la lignée C, appartenant aux races ligustica (dans le sud-est),
carnica et Buckfast (dans l’est). De ce fait le niveau d’introgression mitochondrial estimé dans ces
régions limitrophes ne correspondent pas directement au niveau d’importation.
L’origine des abeilles de la lignée A n’est pas forcément due à des importations, mais à la présence
d’abeilles venant naturellement d’Espagne où cette lignée est très présente (Smith et al., 1991 ;
Franck et al., 1998 ; Garnery et al., 1998)
De nombreux haplotypes ont été mis en évidence : 46 dans la lignée M, 3 dans la lignée C et 3 dans
la lignée A. Sur les 46 haplotypes de la lignée M, 14 ont été découverts au cours de cette étude
(MA à MN), et seront caractérisés par séquençage prochainement.
Variations régionales
Les niveaux d’introgression de la lignée M sont très variables selon les régions : la Franche-Comté
(68%), l’Aquitaine (46%), l’Ile de France (38%) et la Bourgogne (26%) sont les plus introgressées,
alors que l’Auvergne (0%), le Nord (3%) et la Corse (4%) le sont peu.
Fréquence des différents haplotypes de la lignée M
La fréquence des 46 haplotypes de la lignée M est très variable, comme le montre la figure 2, où
sont représentés les 10 haplotypes majoritaires. En France, les haplotypes les plus abondants sont le
M4 (72 %), le M17 (10,5 %), le M19 (4 %), le M6 (2,7 %) et le M7 (2,5 %).
18
0
10
20
30
40
50
60
70
80
M4 M17 M19 M6 M7 M18 M20 M27 M22 M10
Haplotypes
%
Figure 2 : Fréquence des 10 haplotypes les plus abondants en France
Répartition des différents haplotypes de la lignée M
Haplotype M 4
L’haplotype M4 (Figure 3) est très majoritaire dans la partie sud de la France, puis sa fréquence
diminue en remontant vers le nord – nord-est, où il ne représente plus que 19 % des haplotypes
dans la région Nord - Pas de Calais.
19
Figure 3 : Proportions de l’haplotype M4 dans les régions françaises (en jaune : haplotype M4,
en bleu : autres haplotypes de la lignée M)
Haplotype M17
Figure 4 : Proportions de l’haplotype M17 dans les régions françaises (en rouge : haplotype M17,
en bleu : autres haplotypes de la lignée M)
20
L’haplotype M17 (Figure 4) est très abondant dans la partie nord de la France, et sa fréquence
diminue en se dirigeant vers le sud. Dans la région Nord, en particulier, il représente la grande
majorité des haplotypes (81,4 %).
Autres haplotypes
La figure 5 présente la répartition des 18 haplotypes les plus fréquents en France, autres que
l’haplotype majoritaire M4. Certains haplotypes, dont le séquençage a montré qu’ils étaient très
proches, ont été regroupés (cf la vignette de légende).
Figure 5 : Profil mitochondrial des populations des différentes régions (l’haplotype M4,
majoritaire, ne figure pas sur cette carte).
21
La répartition des haplotypes est très différente selon les régions. La représentation choisie, sous
forme d’histogrammes empilés, permet de caractériser le profil génétique des populations des
différentes régions. Celui-ci varie selon les régions, en fonction de l’histoire évolutive, et fait
apparaître l’émergence d’une différenciation locale.
Outre ces différentiations locales, qui sont probablement anciennes, cette figure permet également
d’estimer les flux de gènes reçus des régions limitrophes :
- sud-ouest : en provenance d’Espagne, haplotypes M5 et M9
- sud-est : en provenance d’Italie, haplotype M19 et M22
- Corse : en provenance d’Italie, haplotypes M3 et M7
3-4/ Conclusion sur l’approche moléculaire
Les principaux résultats obtenus au cours de la 1ère année du projet montrent que :
i) les abeilles ayant une origine maternelle appartenant à la race mellifera (abeille noire)
restent très prédominantes en France, et représentent 85 % des abeilles échantillonnées à ce jour.
ii) la répartition des haplotypes de la lignée M est très différente selon les régions. Pour
chacune des régions étudiées, nous avons établi le profil génétique des origines maternelles des
colonies et mis en évidence leurs caractéristiques particulières.
4/ Approche morphométrique
4-1/ Contexte
Compte tenu du retard pris dans la mise au point du système de mesure automatique, une
numérisation a été effectuée manuellement par le même opérateur afin de constituer une base image
définitive et une base de mesure temporaire. Dès que le système de mesure automatique sera
opérationnel, une numérisation des images déjà acquises sera effectuée à nouveau. Le surcroît de
travail sera faible compte tenu de l'automatisation. De plus, la comparaison des résultats de la base
actuelle saisie manuellement et de la nouvelle base acquise automatiquement permettra d'estimer
l'importance de l'effet opérateur et ses conséquences sur le calcul des pourcentages de classements.
22
4-2/ Mise au point du système de mesure automatique
La disponibilité tardive des crédits en 2003 a eu pour conséquence l'impossibilité de pouvoir
recruter un candidat ayant le profil de spécialiste d'analyses d'images. Ces candidats, qui sortent
d’écoles d’ingénieurs disposent généralement de plusieurs offres d’emploi et ne sont pas près à
attendre la fin de l’année malgré l’intérêt qu’ils portent à la problématique.
Toutefois, le système d’acquisition est relativement bien avancé. Le système actuel est bâti à partir
d'éléments mêlant des fonctions MATLAB et R, ainsi que des programmes écrits en C/C++. Son
intégration doit être poursuivie avant de pouvoir procéder aux évaluations nécessaires.
Plusieurs contacts ont d'ores et déjà été établis avec des candidats potentiels pour 2004-05 et
notamment avec un doctorant qui a déjà travaillé à un système de caractérisation des nervures
d'ailes d'insectes. La puissance des approches de morphométrie géométrique implique que soit
atteint un niveau de précision égal ou supérieur à celui d'un opérateur entraîné. Les essais réalisés
avec le système actuel ont démontré la faisabilité de cet objectif. Le travail prévu pour 2004-2005
consistera à réaliser un système de base opérationnel à partir des éléments actuels afin d'évaluer
différents algorithmes et alternatives. Le système définitif sera construit par l'intégration des
approches permettant d'atteindre la meilleure précision sur une large gamme de qualité d'images.
4-3/ Résultats
4-3-1/ Bases d'images et de mesures (morphométrie géométrique)
Pour les populations françaises, les ailes de 986 abeilles ont été mesurées (tableau 1, colonne
morphométrie), ainsi que 30 abeilles de la population de référence des Landes.
Pour les populations de référence des autres lignées, 1163 abeilles ont été utilisées (tableau 2)
23
Pays
Races indigènes Nb
d'abeilles
Algérie Intermissa, sahariensis 220
Arménie caucasica 16
Belgique mellifera 46
Buckfast souche synthétique 25
Bulgarie carnica 49
Caucase caucasica 48
Chypre cypria 138
Croatie carnica 48
Grèce centrale macedonica, cecropia 98
Péloponèse cecropia 30
Hongrie carnica 49
Italie ligustica 37
Maroc Intermissa, sahariensis, major 165
Portugal iberica 50
Tchécoslovaquie mellifera, carnica 49
Ukraine macedonica 95
1163
Tableau 2 : Nombre et répartition des abeilles utilisées comme références
5213 images d'ailes ont été numérisées avec un système vidéo couleur en moyenne résolution (768
x 576 pixels). Plusieurs mutations alaires ont été observées et les ailes correspondantes n'ont pas été
mesurées. Chaque aile a été numérisée deux fois avec des mises au point indépendantes, de façon à
permettre d'estimer et de réduire l'erreur de mesure. Cette base d'image a servi à la prise de mesures
morphométriques de dix-neuf points-repères 2D (Figure 6). La base morphométrique brute, après
élimination des ailes présentant une mutation et des ailes déformées, comprend au total 165 604
mesures : 4358 individus et répétitions x 38 variables (= coordonnées X et Y de 19 points). La
numérisation et les prises de mesures ont été effectuées par une seule personne qui effectuera
également la poursuite des saisies et des numérisations à venir. Les coordonnées ont été relevées
avec le logiciel TPSdig.
Les bases images et mesures (6 Go environ) sont stockées sur deux systèmes informatiques
indépendants et dupliquées sur deux disques, un au format ext3 (Linux Mandrake 10.0) et un au
format NTFS (Windows XP). Deux jeux de sauvegardes sur CD-ROM non-réinscriptibles sont
également effectués chaque mois ou après chaque modification importante. Un jeu de CD est
stocké au Muséum (plateforme morphométrique de l'UMR VNRS 5202) et un autre au laboratoire
PGE du CNRS de Gif-sur-Yvette. L'ensemble de ces précautions garantit la pérennité des bases.
24
Figure 6 : Localisation des 19 points-repères alaires
La base de mesures brutes a été traitée par une superposition procustéenne. Les coordonnées
superposées constituent la base morphométrique de travail, chaque individu étant représenté par la
moyenne des coordonnées de ses deux répétitions. Une telle procédure permet de réduire
substantiellement l'erreur de mesure. La phase intitiale a consisté à effectuer des séries d'analyses
par localité afin de rechercher d'éventuelles erreurs dans la prise des coordonnées ou la présence
d'individus aberrants. Seuls deux individus ont dû être éliminé qui correspondent à des mutations
imperceptibles sur les images. Le fichier morphométrique actuel comprend 2179 individus après
élimination des répétitions et des mutations.
4-3-2/ Analyse statistique de la base morphométrique
Les données ont été analysées par des analyses discriminantes afin de déterminer l'importance des
divergences de morphologie alaire (Figure 7), et par des fonctions discriminantes multiples afin
d'estimer les pourcentages de classements corrects, avec et sans validations croisées. Les
groupements utilisés correspondent aux localités. Ils ne tiennent pas compte des hétérogénéités
potentielles liées à la dérive au sein des colonies, ni des introgressions potentielles (cf.
perspectives). Cependant les analyses intra-localités n'ont pas montré des hétérogénéités
importantes.
Les analyses ont été effectuées avec le langage statistique et graphique R et avec le langage
matriciel MATLAB. Les programmes écrits à cette occasion constituent la trame des programmes
qui seront utilisés dans les étapes ultérieures de validation de la base et de constitution du système
expert.
25
Figure 7 : Analyse discriminante par localités sur l'ensemble de la base : projections des centres
de gravité sur les 3 premiers plans discriminants (à gauche) et déformations sur les trois
premiers axes discriminants (à droite)
26
Les pourcentages de classements sont résumés dans le tableau 3 et sur la figure 8. L'ordre des
groupes correspond aux localités des lignées M (France, Belgique et Portugal), C (Italie, Grèce
continentale et Péloponèse, Ukraine ... + Buckfast), O (Caucase) et A (Maroc et Algérie). On
insistera ici moins sur les patrons de diversification globaux, que sur les résultats pertinents au plan
de la discrimination et de l'identification des abeilles françaises. Mentionnons simplement que ces
grands patrons sont congruents avec ceux établis à partir des données moléculaires.
Les lignées sont dans l'ensemble très correctement identifiées, en moyenne à plus de 80%, voire à
plus 90 % pour la lignée A et pour plusieurs groupes de la lignée C. L'absence de mélanges entre
lignée M et lignées C et A est particulièrement notable (Tableau 3, première moitié inférieure
gauche, et deuxième moitié supérieure droite) : ils sont majoritairement nuls, sinon inférieurs à 2%
et ne dépassent qu'exceptionnellement 3% (4,17 % entre la Corse et le Caucase). La lignée M
apparaît très homogène.
Les différences entre localités sont peu importantes à faible échelle géographique (régionale), plus
marquées à large échelle (Corse, Portugal). Les classements incorrects se font pour l'essentiel entre
populations géographiquement proches et sont vraisemblablement la résultante d'échanges
génétiques passés ou actuels (Landes/Vendée, Alpes/Haute-Savoie/Corse ...). Il faut noter
cependant l'influence exercée par les localités du Sud-Est (Var notamment), y compris pour les
localités les plus septentrionales (Nord, Belgique). Il est probable que ces rapprochements
traduisent l'impact d'introgressions d'origine anthropique. Le pourcentage (8%) de classement
d'abeilles vendéennes dans le groupe Buckfast (plus une fraction dans les caucasiennes avec
validation croisée) atteste clairement de leur existence. Les analyses ultérieures devront s'attacher à
rechercher l'importance des éventuelles introgressions (passées ou actuelles) avec des abeilles de la
lignée C. Dans les autres lignées, les mal classées traduisent apparemment plus l'histoire évolutive
des populations et permettent de constituer des regroupements géographiques pluri-nationaux
comme par exemple Grèce centrale + Péloponèse + Bulgarie + Croatie, ou de manière plus
restreinte Hongrie + Croatie + Grèce centrale sauf Péloponèse). La seule exception est l'Ukraine
dont près de la moitié des individus se retrouve en mélange avec la quasi-totalité des autres groupes
de la lignée C (Tableau 2, ligne Ukraine).
Les calculs des pourcentages de classement avec validations croisées confirment la stabilité et la
validité des discriminations entre lignées : les pourcentages de classements avec validation croisée
(non indiqués) diffèrent au plus de 0,7 % des pourcentages calculés par substitution. Ils amplifient
par contre la faible discrimination générale au sein de la lignée M, avec des pourcentages de bien
classés par localités inférieurs de 10 à 20 points à ceux du tableau 3 (chiffres indiqués en rouge).
27
Tableau 3: Pourcentages de classement calculés par des fonctions discriminantes multiples sur
les résultats de l’analyse morphométrique des ailes. Les résultats se lisent en ligne : si tous les
individus d'une localité étaient bien classés, ils se retrouveraient tous (100%) dans la case
située à l'intersection de la ligne et de la colonne correspondant à cette même localité (en
rouge). Les individus mal classés sont situés sur la même ligne de part et d'autre de cette
intersection.L'affectation d'un individu à une localité s'effectue à partir de ses probabilités
d'appartenance à chacune des localités selon le critère du maximum de vraisemblance fourni
par les fonctions discriminantes. Le système expert utilisera ces résultats pour classer toute
abeille nouvelle dont on voudra connaître la lignée et la région d'origine la plus probable.
Tchécoslovaquie Hongrie Buckfast Italie Chypre Croatie Grèce Péloponèse Ukraine Arménie Bulgarie Caucase Algérie Maroc
Alpes 9,52 0,00 9,52 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 4,76 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Auvergne 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Corrèze 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Haute-Savoie 1,55 0,00 0,00 0,78 0,00 0,00 0,78 0,00 1,55 0,00 0,00 0,00 0,78 1,55
Haute-Vienne 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,02 0,00 0,00 0,00 1,02 0,00
Landes 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 3,33 0,00 0,00
Lot 2,08 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 2,08 0,00 0,00 2,08 2,08 0,00
Maine-et-Loire 0,00 0,00 0,00 0,00 2,04 0,00 0,00 0,00 4,08 0,00 0,00 2,04 0,00 0,00
Normandie 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,69 0,00
Orne 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Nord 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Belgique 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 2,17 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Corse 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,56 0,00 0,56 0,00 1,68 0,00 1,68 1,12
Var 0,00 0,00 1,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 2,00 0,00 0,00 2,00 3,00 0,00
Vendée 0,68 0,00 0,00 0,00 0,00 0,68 0,00 0,00 0,68 0,00 0,00 0,68 2,04 2,72
Portugal 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Tchécoslovaquie 63,27 2,04 0,00 0,00 0,00 8,16 10,20 2,04 12,24 0,00 0,00 0,00 0,00 2,04
Hongrie 2,04 59,18 0,00 2,04 0,00 18,37 10,20 0,00 6,12 0,00 2,04 0,00 0,00 0,00
Buckfast 4,00 0,00 56,00 0,00 0,00 8,00 0,00 4,00 0,00 0,00 0,00 4,00 0,00 0,00
Italie 8,11 10,81 2,70 62,16 0,00 0,00 5,41 5,41 5,41 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Chypre 0,00 0,00 0,00 0,00 94,20 0,00 0,00 0,00 0,72 2,17 2,17 0,72 0,00 0,00
Croatie 8,33 25,00 2,08 2,08 0,00 33,33 6,25 8,33 6,25 0,00 8,33 0,00 0,00 0,00
Grèce 3,06 5,10 1,02 0,00 0,00 3,06 71,43 5,10 5,10 0,00 5,10 1,02 0,00 0,00
Péloponèse 10,00 0,00 0,00 0,00 0,00 6,67 40,00 20,00 13,33 0,00 10,00 0,00 0,00 0,00
Ukraine 5,26 8,42 3,16 2,11 4,21 8,42 3,16 1,05 41,05 4,21 8,42 5,26 0,00 1,05
Arménie 0,00 0,00 0,00 0,00 25,00 0,00 0,00 0,00 18,75 50,00 0,00 6,25 0,00 0,00
Bulgarie 2,04 0,00 0,00 0,00 4,08 4,08 16,33 6,12 26,53 0,00 36,73 0,00 0,00 0,00
Caucase 0,00 0,00 0,00 0,00 2,08 0,00 0,00 0,00 2,08 0,00 0,00 83,33 2,08 0,00
Algérie 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,91 0,91 0,00 0,45 83,64 7,27
Alpes Auvergne Corrèze Haute-Savoie Haute-Vienne Landes Lot Maine-et-Loire Normandie Orne Nor
d
Belgique Corse Var Vendée Portugal
Alpes 4,76 4,76 0,00 0,00 0,00 4,76 0,00 4,76 0,00 0,00 0,00 0,00 33,33 4,76 19,05 0,00
Auvergne 0,00 25,00 4,17 12,50 10,42 0,00 0,00 0,00 2,08 2,08 0,00 4,17 12,50 10,42 14,58 2,08
Corrèze 4,17 4,17 16,67 12,50 20,83 2,08 8,33 2,08 4,17 4,17 0,00 2,08 4,17 10,42 4,17 0,00
Haute-Savoie 0,78 3,88 3,88 34,88 12,40 0,78 1,55 0,78 3,88 0,78 0,00 1,55 13,95 7,75 5,43 0,78
Haute-Vienne 0,00 2,04 11,22 12,24 35,71 3,06 4,08 1,02 2,04 1,02 1,02 3,06 6,12 9,18 6,12 0,00
Landes 0,00 6,67 6,67 0,00 20,00 23,33 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 13,33 3,33 23,33 0,00
Lot 0,00 4,17 6,25 8,33 18,75 4,17 6,25 0,00 2,08 0,00 0,00 0,00 16,67 14,58 10,42 0,00
Maine-et-Loire 0,00 4,08 4,08 2,04 4,08 0,00 2,04 20,41 6,12 6,12 2,04 0,00 8,16 12,24 20,41 0,00
Normandie 0,00 0,00 3,39 13,56 11,86 1,69 5,08 3,39 18,64 8,47 0,00 8,47 5,08 8,47 8,47 1,69
Orne 0,00 0,00 4,00 14,00 16,00 0,00 2,00 2,00 12,00 16,00 2,00 6,00 6,00 10,00 10,00 0,00
Nord 0,00 0,00 0,00 40,00 20,00 10,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 10,00 20,00 0,00
Belgique 2,17 8,70 0,00 8,70 6,52 0,00 0,00 0,00 6,52 0,00 2,17 28,26 4,35 15,22 13,04 2,17
Corse 2,23 2,23 1,68 8,38 3,35 0,56 2,79 1,68 2,79 0,00 0,00 0,56 52,51 5,59 8,94 1,12
Var 2,00 4,00 2,00 10,00 1,00 0,00 5,00 3,00 3,00 1,00 0,00 5,00 13,00 36,00 5,00 2,00
Vendée 0,00 3,40 2,72 6,12 2,04 2,04 0,68 3,40 4,76 2,04 0,68 1,36 14,29 3,40 45,58 0,00
Portugal 0,00 2,00 0,00 0,00 4,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 2,00 4,00 2,00 2,00 84,00
Tchécoslovaqui
e
0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Hongrie 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Buckfast 0,00 0,00 0,00 4,00 0,00 0,00 0,00 0,00 4,00 0,00 0,00 4,00 4,00 0,00 8,00 0,00
Italie 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Chypre 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Croatie 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Grèce 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Péloponèse 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Ukraine 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,05 1,05 2,11 0,00
Arménie 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Bulgarie 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 2,04 0,00 2,04 0,00
Caucase 0,00 0,00 0,00 2,08 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 2,08 0,00 0,00 4,17 2,08 0,00 0,00
Algérie 0,00 0,00 0,00 0,45 0,45 0,45 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,45 2,27 0,45 0,91 1,36
28
Les discriminations à l'intérieur de la lignée M apparaissent donc faibles et peu fiables dans
l'ensemble. Par contre les pourcentages de classement à l'intérieur des autres lignées ne sont
pratiquement pas modifiés par les validations croisées.
Alpes
Corrèze
Haute-Vienne
Lot
Normandie
Nord
Corse
Vendée
Tchécoslovaquie
Buckfast
Chypre
Grèce
Ukraine
Bulgarie
Algérie
Alpes
Haute-Savoie
Lot
Orne
Cor se
Portugal
Buckfast
Croatie
Ukrain e
Caucase
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
100,00
Pourcentages de classements
Alpes
Auvergne
Corrèze
Haute-Savoie
Haute-Vienne
Landes
Lot
Maine-et-Loire
Normandie
Orne
Nord
Belgique
Corse
Var
Vendée
Portugal
Tchécoslovaquie
Hongrie
Buckfast
Italie
Chypre
Croatie
Grèce
Péloponèse
Ukraine
Arménie
Bulgarie
Caucase
Algérie
Maroc
Figure 8 : Pourcentages de classements corrects par localités du tableau 3, représentés sous forme
d'histogrammes. L'ordre des localités sur le graphique est le même que celui de la légende
(vignette de droite). Le graphique s'interprète de la même manière que le tableau 3.
M
M
M
M
M
M
M
M
M
M
M
M
M
M
M
M
C
C
C
C
C
C
C
C
O
C
O
A
A
Li
g
nées
29
4-4/ Conclusions
Les résultats maintenant établis sur plus de 2000 abeilles confirment la bonne séparation des
lignées au plan morphométrique. Ils valident sans ambiguïté l'intérêt du système expert en cours
d'élaboration. Les pourcentages de classements corrects devraient être améliorés à terme avec la
prise en compte des introgressions effectuées par le rapprochement des bases moléculaires et
morphométriques (cf. perspectives). L'introduction de variables supplémentaires, classiquement
utilisées dans la discrimination des lignées (longueur de la langue, coloration, pilosité) ne semble
pas à ce stade du projet constituer une réelle priorité. Cette conclusion nécessite cependant d'être
confirmée par l'analyse de populations introgressées avec les lignées C, A et O, ainsi qu'avec la
souche Buckfast, avant qu'une décision soit prise.
5/ Perspectives
5-1/ Deuxième année du projet (1/11/04 au 30/08/05)
5-1-1/ Approche moléculaire
Dans le cadre de l’étude de la biodiversité du cheptel apicole français, 2000 abeilles environ ont été
analysées au moyen de l’ADNmt, au cours de la 1ère année du contrat. Il est donc prévisible qu’au
moins le même nombre d’abeilles pourra également l’être au cours de la seconde année.
La méthode étant maintenant complètement rodée et utilisée en routine, il est probable que ce
nombre pourra être dépassé, et que les 16 régions échantillonnées seront globalement analysées.
5-1-2/ Approche morphométrique
La base sera complétée afin de prendre en compte les populations de références :
- de la lignée M sur la base des échantillons expédiés par les apiculteurs et leurs
associations, complétées au besoin par des populations déjà en possession du laboratoire PGE. Le
but est d'obtenir une couverture la plus homogène possible du territoire.
- des autres lignées potentiellement susceptibles d'être ou d'avoir été importées en France
et dans les régions limitrophes
- des souches synthétiques (Buckfast) pour les mêmes raisons.
Lorsque les deux bases (moléculaire et morphométrique) seront constituées, un rapprochement
préliminaire sera opéré. Il visera à essayer d'identifier les individus potentiellement introgressés qui
30
seront éliminés des populations de référence et traités séparément comme autant de classes
supplémentaires. Une telle procédure permettra d'accroître la qualité des discriminations.
L'intégration du système de mesure automatique sera réalisée, et l'intérêt des algorithmes alternatifs
sera évalué sur la base d'une amélioration de la qualité des reconnaissances et de la stabilité des
résultats.
Le fonctionnement général du système expert fera enfin l'objet d'une série de tests poussés afin de
vérifier son fonctionnement. A ce stade, il serait bon de comparer les réponses respectives des
systèmes morphométrique et moléculaire sur des populations nouvelles qui ne figurent pas dans la
base.
5-2/ Perspectives ultérieures
5-2-1/ Approche moléculaire
L’étude de la biodiversité du cheptel apicole dans les 6 régions qui n’ont pas encore été
échantillonnées (Alsace, Centre, Champagne-Ardenne, Lorraine, Picardie et Poitou-Charentes) ne
pourra pas être réalisée au cours de la deuxième année du contrat. Elle ne pourra l’être que dans le
cadre d’une troisième année.
Une réflexion devrait être engagée par les associations apicoles et par les services de l’Etat
concernés afin de savoir si un pôle de recherche sur la biodiversité de l’abeille, et sur l’analyse de la
diversité génétique des colonies d’intérêt apicole, doit être maintenu en France.
Si tel est le cas, il est nécessaire que des moyens adaptés (humains et financiers) y soient consacrés,
car il semble qu’il ne faille, malheureusement, pas seulement compter sur les organismes de
recherche pour y pourvoir.
5-2-2/ Approche morphométrique
A plus long terme, les travaux s'inscrivent pour l'essentiel dans une adaptation la plus poussée aux
besoins de l'apiculture, compatible avec l'enrichissement de la base et son intégrité. Ils devront faire
appel à de bons spécialistes des bases de données et de programmation.
Le bon fonctionnement d'un système expert mixte suppose une intégration poussée des deux bases.
Elle peut se faire de deux manières qui devront être évaluées. La première est la mise en place d’un
moteur d'identification mixte, utilisant à la fois les bases morphométrie et moléculaire et
31
l'évaluation de sa faisabilité et de son intérêt. La nécessité d'avoir systématiquement une double
signature morphométrique et moléculaire constitue un handicap évident.
L'alternative qui semble plus adaptée est d'intégrer simplement les résultats morphométrie-
moléculaire afin de réaliser un "nettoyage" de la base morphométrie de façon à mettre à part les
introgressions et les origines probables impliquées.
Il conviendra de réfléchir avec la profession à la meilleure solution technique qui devra être mise en
place pour réaliser les identifications.
Le système expert morphométrique devra être transformé (simple interface utilisateur intégrant
différents modules ou re-programmation pour en faire un programme indépendant) pour qu'il puisse
être utilisé par les structures ad hoc.
32
2ème partie : Etude d’impact en vue de la mise en place de conservatoires génétiques
1/ Principe
Quand une association apicole régionale souhaite mettre en place un conservatoire d’abeilles, il est
nécessaire dans un premier temps de réaliser une étude visant à : (i) caractériser la structure
génétique de la population (ii) estimer les niveaux d’introgression à l’échelle de la population et des
individus (ou colonies) (iii) choisir les colonies qui sont représentatives de la lignée et de la
population locale afin de constituer un cheptel pour la mise en place d’un conservatoire génétique
d’abeilles ex situ ou in situ.
Dans le cas de la mise en place d’un conservatoire in situ (exemple de la Corse), le but de l’étude
est de déterminer une zone comportant un niveau d’introgression le plus faible possible.
Dans celui de la mise en place d’un conservatoire ex situ (exemple de l’île de Porquerolle), le but
de notre travail est de sélectionner les colonies qui présentent le niveau d’introgression le plus
faible tout en maintenant une diversité haplotypique et une hétérozygotie caractéristique de la
population locale.
Les associations apicoles réalisent donc des prélèvements d’abeilles dans plusieurs dizaines de
colonies et nous les envoient. Les analyses de l’ADN de ces abeilles que nous réalisons permettent
de caractériser les colonies qui ne sont pas introgressées par des allèles en provenance des lignées
C, O et A. Par ailleurs, si le choix de l’implantation du conservatoire n’a pas encore été fait par
l’association, nos résultats nous permettent également de proposer d’installer le conservatoire dans
la zone géographique où se trouve le plus faible nombre de colonies introgressées.
2/ Etude moléculaire (ADN nucléaire)
2-1/ Matériels et Méthodes
2-1-1/ Echantillonnage
Les abeilles échantillonnées pour l’analyse mitochondriale sont également utilisées pour l’analyse
nucléaire. L’analyse nucléaire a été réalisée sur les populations des Alpes de Haute-Provence
(n=142 individus) et de Corse (n=199).
33
Alpes de Haute-Provence
L’échantillonnage de la population des Alpes de Haute Provence est principalement concentré dans
le sud du département et réparti dans deux grandes zones (communes de Manosque et de Blieux).
Dans ces zones, 142 colonies réparties en 15 ruchers appartenant à 13 apiculteurs.
Corse
L’échantillonnage de la population de Corse se présente sous la forme d’un ensemble de nombreux
ruchers composés de quelques colonies dispersées sur toute l’île : 199 colonies réparties dans 54
ruchers appartenant à 48 apiculteurs. Cette répartition rend peu fiable l’analyse inter-ruchers du fait
du faible échantillonnage. Nous avons donc procédé à un regroupement des abeilles de Corse en
sept populations, selon leur distribution géographique (Figure 9).
Figure 9 : Localisation des différentes régions échantillonnées en Corse (A : Cap Corse ; B :
Haut Nebbiu de la Casinca : Plaine Orientale ; C : Centre, en particulier le Cortenais et le
Venacais ; D : Vallée de l’Ascu et Balagne ; E : Côte Ouest ; F : vallées de la Gravona et du
Taravu ; G : région de Porto-Vecchio).
Corte
Bastia
Calvi
Sarne
A jaccio
A
D
B
C
E
F
G
34
Populations de référence des lignées M, C, O et A
Les populations de Corse et de Haute-Provence ont été analysées à l’aide d’une base de données
constituée de 11 populations de référence qui se répartissent de la manière suivante :
Lignée M
- France septentrionale (Valenciennes), n=24 abeilles
- France méridionale (Bayonne), n=41 abeilles
- France de l’ouest (Sabres), n=50 abeilles
Lignée C
- Grèce septentrionale (Grèce 1 = Chalkidiki), n=30 abeilles
- Grèce centrale (Grèce 2 = Olympe), n=25 abeilles
- République Tchèque (Prague), n=47 abeilles
- Italie (Forli), n=30 abeilles
Lignée O
- Arménie (Erevan), n=17 abeilles
- Caucase (Tbilissi), n=25 abeilles
Lignée A
- Maroc (Al Hoceima), n=28 abeilles
Souche synthétique Buckfast, n=25 abeilles
Analyse moléculaire
Les méthodes d’extraction de l’ADN nucléaire sont les mêmes que celles décrites pour l’analyse
mitochondriale (cf. 1e partie, 3-1).
La méthode d’analyse des microsatellites a également été décrite plus haut (cf. 1e partie, 3-1).
L’analyse des populations de Corse porte sur les 10 locus alors que l’analyse de la population des
Alpes de Haute Provence porte sur 9 locus (les 10 locus moins le B24).
35
2-1-2/ Analyse statistique
Les populations sont analysées dans un contexte général, c’est à dire à l’échelle des lignées
évolutives, et local, c’est à dire à l’échelle de la population.
A l’échelle des lignées évolutives
Les lignées évolutives M, C et O correspondent à des populations issues de refuges glaciaires,
situés en Espagne pour la lignée M, en Italie et en Grèce pour la lignée C et dans le sud du Caucase
pour la lignée O. Lors des glaciations, les populations, isolées les unes des autres, vont avoir
tendance à accumuler des différences qui vont les éloigner d’un point de vue génétique. La lignée A
s’est différenciée génétiquement des autres lignées du fait de son isolement ancien sur le continent
africain. Disposant de populations de références de chacune des lignées il est possible d’estimer la
proximité génétique de populations à tester (par exemple Corse et Alpes de Haute Provence).
Ces tests peuvent être réalisés, par rapport aux populations de références, avec la méthode de
Cavalli-Sforza et Edwards (1967) qui semble constituer, avec la distance DA de Nei, la meilleure
estimation de distance génétique pour les études populationnelles (Takesaki et Nei, 1996). Ils
peuvent être également réalisés, entre chaque individu, à partir de la distance DAS (Shared Allele
Distance; Chakraborty et Jin, 1993).
Les distances génétiques qui séparent les populations les unes des autres sont calculées à l'aide du
logiciel POPULATIONS (version 1.2.21, Langella, 1999).
A partir de ces matrices de distances les proximités génétiques sont visualisées sur un arbre
phylogénétique reconstruit à l’aide de l'algorithme du Neighbor-Joining (Saitou et Nei, 1987) et
visualisé avec le logiciel TREEPLOT (version 0.6, Langella, 2001). Afin de s’assurer de la validité
des branches séparant les différents groupes mis en évidence, un tirage aléatoire des individus avec
remise (Bootstrap) est effectué. La position d’une population sur l’arbre est validée par une valeur
de bootstrap correspondant au pourcentage de chance de trouver ce regroupement pour 2000 tirages
aléatoires effectués (comparaisons des 2000 arbres issus des 2000 tirages aléatoires).
L’arbre obtenu est une représentation en deux dimensions ne permettant pas de déterminer de
manière précise les interactions entre populations notamment dans le cas d’introgressions
génétiques (mélanges de populations) entre plusieurs lignées évolutives. Il est alors utile de réaliser
une analyse multivariée (ACP- Analyse en Coordonnées Principales). Cette analyse, effectuée avec
le programme NUEES (version 0.8, Langella 2001), permet une visualisation rapide de
l’emplacement des populations (ou des individus) les un(e)s par rapport aux autres dans un espace
36
multivarié. Les projections des individus ou des populations dans cet espace ont été réalisées grâce
au logiciel graphique XGOBI (version 1.1).
A l’échelle des individus et de la population
La structuration génétique d’une population peut être d’origine naturelle ou humaine (importations,
par ex.).
Si la population se comporte de manière naturelle, une des hypothèses que l’on peut formuler est
que les croisements entre les reproducteurs (reines et mâles) se réalisent au hasard des rencontres
(sans choix du partenaire). Ce schéma de reproduction est connu sous le nom d’hypothèse
panmictique. Il est possible de tester cette hypothèse avec les données microsatellites à l’aide des
tests de “Hardy-Weinberg” et de déséquilibres de liaisons entre paires de loci. Ces tests ont été
réalisés à l'aide du programme GENEPOP (version 3; Raymond et Rousset, 1995).
En cas d’importations récentes, ou de mélanges de populations différenciées, la population analysée
ne sera pas considérée comme panmictique.
Le niveau de variabilité d’une population peut être estimé à partir de l’héterozygotie moyenne par
locus. L’hétérozygotie correspond à la proportion d’individus hétérozygotes (comportant deux
allèles différents) dans une population. Ce paramètre peut être comparé à celui de populations de
référence de la lignée M. En cas d’introgressions liées à l’importation de reines d’autres lignées
cette hétérozygotie va augmenter du fait de l’introduction d’allèles différents dans la population.
Ces hétérozygoties ont été calculées à l'aide des formules de Nei & Tajima (1981) et Nei (1978).
Les niveaux d’introgression ont été estimés selon deux approches.
La première consiste à considérer 9 des 10 locus (à l’exception du B124) comme diagnostiques
entre les lignées M et C. Pour ces locus, certains allèles sont caractéristiques de chacune des
lignées, et sont alors définis comme étant des allèles diagnostiques. L’estimation du niveau
d’introgression est obtenue directement en calculant la fréquence des allèles spécifiques de la lignée
C pour chaque individu, rucher ou population.
La seconde approche consiste à calculer les probabilités d'appartenance de chaque individu aux 11
populations de référence. L’individu est alors classé dans une population en fonction de sa plus
grande probabilité d’appartenance. Ces assignations ont été réalisées en utilisant les méthodes
fondées sur des approches Fréquentielle (Paetkau et al., 1995), et Bayesienne, et sur des Distances
37
génétiques DAS (Chakraborty et Jin, 1993). Ce classement a été obtenu à l'aide du logiciel
GENECLASS (version 1.0.02; Cornuet et al. 1999).
Le choix final des colonies pour la mise en place du conservatoire a été déterminé en fonction des
résultats des deux approches. Dans le cas des assignations, le classement des individus a été validé
par l’observation de leur position sur les graphiques de l’analyse en coordonnées principales.
2-2/ Résultats
2-2-1/ Appartenance d’une population à une lignée évolutive
Classification hiérarchique des populations
L’arbre issu de l’analyse hiérarchique (Neighbor Joining sur les distances inter-populations)
présente les relations de proximités génétiques des populations des Alpes de Haute Provence et de
Corse par rapport aux 11 populations de référence (Figure 10). Ces populations de référence
montrent clairement l’existence de 4 groupes génétiques correspondant aux 4 grandes lignées
évolutives M (en rouge), C (en bleu nuit), A (en vert) et O (en bleu cyan).
Figure 10: Arbre reconstruit à partir de la matrice de distance de Cavalli-Sforza calculée sur la
base de 9 locus microsatellites (A7, A28, A88, A113, Ap43, Ap66, Ap55, Ap81 et B124). Les
valeurs de « Bootstrap », notées en pourcentages, ont été obtenues avec 2000 itérations d’un re-
échantillonnage aléatoire des individus.
99
53
99
100
49 65
53
99
100 96
Corse Provence Sabres
Bayonne
Valenciennes Buckfast Italie
Grèce 2
Grèce 1
Caucase Arménie
Maroc
République tchèque
38
Les populations des Alpes de Haute-Provence et de Corse se distinguent bien des populations de
référence A, C et O et apparaissent plus proches des populations de référence M. Toutefois, ces
deux populations sont situées à la base de cette lignée et semblent bien individualisées entre elles et
par rapport à celles de la lignée M (valeurs de bootstrap de 100 et 99).
La proximité des populations de Corse et des Alpes de Haute Provence est sans doute le résultat de
leur proximité géographique. La différenciation de ces populations entre elles est probablement le
résultat du caractère insulaire de la population de Corse.
Leur différenciation par rapport à la lignée M, et leur position intermédiaire entre celle-ci et les
lignées A, C et O, peuvent être interprétées comme étant le résultat :
- soit d’une différenciation naturelle de ces deux populations par rapport aux autres
populations de la lignée M,
- soit liée à des introgressions provenant de l’une des trois autres lignées.
Analyse en Coordonnées Principales inter-populations
Les projections des populations selon les deux premiers axes issus de l’Analyse en Coordonnées
Principales (ACP) permettent de mieux visualiser les interactions entre les différentes populations
(Figure 11).
Les deux premiers axes de l’ACP absorbent 68% de la variabilité génétique totale. Le premier axe
de l’ACP, qui représente 52% de la variance totale du système, oppose les populations de la lignée
M (Sabres, Bayonne et Valenciennes) aux populations des lignées C (Grèce, Italie, République
tchèque et Buckfast) et O (Arménie et Caucase). La population de la lignée A reste proche du
centre de l’axe. Le 2e axe, qui représente 15,9 % de la variance totale oppose les populations de la
lignée O à celles des autres lignées.
La lignée C semble présenter une légère structuration, avec les populations d’Italie et de la
République tchèque d’un côté, et les populations de Grèce et Buckfast de l’autre. La souche
Buckfast étant un hybride des lignées C (entre 70% et 80%) et M (entre 20% et 30%), il est logique
que cette population apparaisse plus proche de la lignée C, mais en position intermédiaire entre les
références M et C.
39
Lorsqu’une population reçoit des allèles d’une autre population (zone d’introgression naturelle ou
importations) la distance entre ces deux populations va diminuer. La population qui reçoit ces
allèles va avoir tendance à se rapprocher de l’autre (sur le graphique).
Figure 11 : Analyse en Coordonnées Principales (ACP) des populations de Corse, des Alpes de
Haute Provence et de référence M, C, A et O.
Ainsi, la population des Alpes de Haute-Provence semble faire partie du groupe de référence M. La
population de Corse, bien que proche des populations de référence M, est située en position
intermédiaire entre les populations de référence des lignées M et C. La population Corse est plus
particulièrement orientée vers le haut du graphique ce qui montre probablement l’influence de la
lignée C et plus particulièrement de la population d’Italie. Par ailleurs, il est à noter l’absence
d’influence notable des lignées O (A. m. caucasica) et A (A. m. major).
En résumé, les populations des Alpes de Haute Provence et de Corse se rapprochent des
populations de la lignée M, mais la population de Corse est plus clairement influencée par la lignée
C.
Bayonne
Sabres
Valenciennes
République tchèque
Italie
Grèce 1 Buckfast
Caucase
Maroc
Provence
Corse
2e axe
15,9 %
1er axe
52 %
Arménie
Grèce 2
Populations de référence
O ( )
C ( )
A ( ) Buckfast ( )
M ( )
40
2-2-2/ Structure génétique des populations analysées
Paramètres populationnels
Alpes de Haute Provence
Les tests exact de l’équilibre de Hardy-Weinberg montrent que la population constituée des 142
colonies des Alpes de Haute Provence n’est pas à l’équilibre (p<10-5). Ce déséquilibre apparaît plus
particulièrement aux locus A88 (p<10-5), Ap43 (p<10-5), A28 (p<5 10-2) et Ap66 (p<5 10-2). La
population des Alpes de Haute-Provence n’est donc pas panmictique.
Quand on réalise les mêmes tests sur les ruchers pris séparément, on observe que 12 ruchers sont à
l’équilibre (Manosque, Miozelle, Limans, Maison 2, 4 chemins, Rousset 1 et 3, Canal, Habitation,
Chaudoul, Blieux, Majastres) et 3 ne le sont pas (Essaims, Observatoire, Rousset 2).
Le test sur les déséquilibres de liaisons entre loci ne vient pas corroborer ce résultat puisqu’il n’y a
aucun déséquilibre de liaison apparent ni pour les ruchers à l’équilibre ni pour ceux qui ne le sont
pas. Ce test permet de mettre en évidence que si il existe une introgression liée aux importations de
reines, celles ci sont probablement anciennes.
L’hétérozygotie moyenne par locus (tableau 4), calculée pour l’ensemble des ruchers des Alpes de
Haute-Provence est de 0,55. Calculée par rucher, elle est comprise entre 0,36 (rucher Blieux) et
0,63 (rucher Rousset 2). Ces valeurs, comparées à celles publiées précédemment (Estoup et al.
1995 ; Franck et al. 1998; Garnery et al. 1998) sont supérieures à la gamme de variation observée
pour d’autres populations françaises (0,29 à 0,49). Le niveau de variabilité apparaît donc plus
important dans les Alpes de Haute-Provence que dans d’autres départements français.
41
Ruchers Localisation N Hc
1 Le Canal 10 0,525
2 Rousset 1 8 0,520
3 Rousset 2 7 0,626
4 Rousset 3 7 0,521
5 Manosque 12 0,533
6 4 Chemins 7 0,437
7 Maison 7 0,559
8 Niozelles 6 0,474
9 Observatoire 13 0,537
10 Limans 7 0,467
11 Essaims 14 0,569
12 Majastres 8 0,420
13 Blieux 5 0,363
14 Chaudoul 10 0,445
15 Habitation 21 0,626
Tableau 4 : Calcul du niveau d’hétérozygotie (Hc) des différentes populations d’abeilles
réparties dans 15 ruchers des Alpes de Haute Provence. N représente le nombre de colonies
échantillonnées.
Corse
Comme dans le cas de la population des Alpes de Haute-Provence, Les 199 colonies de Corse
prises comme une seule et même population ne forment pas une population en accord avec
l’équilibre de Hardy-Weinberg (p<10-5). Ce déséquilibre est observé sur 6 des 10 loci testés [A88
(p<10-2), A113 (p<10-5), Ap43 (p<10-2), A7 (p<10-2), Ap55 (p<10-2) et Ap66 (p<10-5)]. La
population de Corse n’est donc pas panmictique.
Quand on réalise les mêmes tests sur les 7 régions prises séparément, on observe que 5 régions ne
sont pas en accord avec l’équilibre de Hardy-Weinberg (A, B, D, E, F) et 2 le sont (C et G).
Le test des déséquilibres de liaison sur les différentes régions de Corse montre peu de déséquilibres
(entre 0 et 4 tests significatifs pour 46 tests réalisés) ce qui atteste comme dans le cas de la
Provence peu d’introgressions récentes.
L’hétérozygotie moyenne par locus (tableau 5), calculée pour l’ensemble de la Corse est de 0,58.
Pour chaque région, cette valeur est comprise entre 0,53 et 0,63. En comparaison avec la gamme de
variation observée pour les autres populations françaises (Garnery et al., 1998), le niveau de
variabilité apparaît donc toujours plus important en Corse que dans les autres départements français
(0,29 à 0,49).
42
Ruchers Localisation N Hc
A Pointe Nord 13 0,583
B Cote Est 69 0,557
C Centre Nord 16 0,589
D Cote Ouest Nord 23 0,527
E Cote Ouest sud 18 0,625
F Centre Sud 43 0,605
G Pointe Sud 15 0,537
Tableau 5 : Calcul du niveau d’hétérozygotie (Hc) des différentes populations d’abeilles
réparties dans 7 régions (A à G) de Corse. N représente le nombre de colonies échantillonnées.
Les niveaux d’introgression
Le niveau d’introgression d’une population d’abeilles de lignée M renseigne sur les mélanges
d’allèles provenant des autres lignées évolutives. Ces introgressions peuvent être anciennes ou
récentes. Elles seront observées aussi bien dans des conditions naturelles (zones de remise en
contact entre lignées) qu’artificielles (importations de reines et transhumances).
Le tableau 6 présente les estimations des introgressions génétiques provenant de la lignée C selon
les deux approches (allèles diagnostiques, et classements) pour les deux populations étudiées.
Introgressions nucléaires (%)
Populations Allèles
diagnostiques
Fréquentielle
Bayesienne
DAS
Rappel
Introgression ADNmt
%
Alpes de H-P 10,81 6,3 6,3 6,3 16
Corse 18,24 12,7 17,3 2,5 4
Tableau 6 : Niveaux d’introgression nucléaires calculés dans les populations des Alpes de
Haute-Provence et de Corse selon les méthodes des allèles diagnostiques, fréquentielle,
Bayesienne et de distance DAS.
La méthode utilisant les allèles diagnostiques est fondée sur l’hypothèse que ces allèles sont
exclusifs pour chacune des lignées. Dans le cas où les locus ne sont que quasi diagnostiques cette
méthode a tendance à surestimer les niveaux d’introgressions. En revanche, les méthodes de
classement assignent les individus à une des lignées même si ceux-ci n’ont pas la composition
typique de cette lignée, soit en fréquences (méthode Fréquentielle et Bayesienne) soit en génotypes
(DAS). Il est donc possible que ces méthodes sous-estiment ou surestiment les niveaux
d’introgressions selon les cas.
43
Alpes de Haute Provence
Au niveau nucléaire les estimations des pourcentages d’introgression varient de 6% à 11% selon les
méthodes. Le niveau d’introgression nucléaire est inférieur à celui trouvé avec l’ADN
mitochondrial.
Du fait de la proximité de cette population avec l’Italie, il est possible que ces introgressions soient
naturelles. Cependant, les haplotypes mitochondriaux appartenant à la lignée C trouvés dans cette
population (haplotype C 1) ne correspondent pas à ceux qui caractérisent l’Italie (haplotype C 2).
Par conséquent, on peut affirmer qu’une partie des introgressions observées est de nature artificielle
(importation/ transhumance).
Les niveaux d’introgression peuvent être estimés par rucher (tableau 7).
Ruchers Localisation N colonies Allèles
diagnostiques
1 Le Canal 10 10,4
2 Rousset 1 8 4,5
3 Rousset 2 7 15,4
4 Rousset 3 7 8,5
5 Manosque 12 9,5
6 4 Chemins 7 4,5
7 Maison 7 10
8 Niozelles 6 13,2
9 Observatoire 13 8,3
10 Limans 7 6,9
11 Essaims 14 11,5
12 Majastres 8 6,3
13 Blieux 5 2,5
14 Chaudoul 10 4,8
15 Habitation 21 25,6
Tableau 7 : Estimation des niveaux d’introgression dans les 15 ruchers des Alpes de Haute-
Provence.
Le rucher Habitation montre le niveau d’introgression le plus élevé (25,6%). Le marqueur
mitochondrial montre que ce rucher est composé de 85% de colonies d’origine C. Ce rucher était
répertorié lors de l’échantillonnage comme étant composé de colonies de souche Buckfast. Si
l’origine maternelle peut correspondre au standard Buckfast il n’en est rien au niveau nucléaire
puisqu’il devrait être constitué d’environ 70 à 80 % d’allèles d’origine C.
Les ruchers Rousset 2, Essaims et Observatoire montrent des niveaux d’introgression relativement
importants, respectivement de 15,4%, 11,5% et 8,3%. Ces trois ruchers n’étaient pas panmictiques
lors de l‘analyse précédente et sont ceux qui montraient les niveaux d’hétéroygoties les plus
44
importants. Ceci est probablement le résultat d’introgressions récentes liées à des importations dans
la région.
En dehors du rucher Habitation, les autres ruchers ont un niveau d’introgression relativement faible.
L’observation de la distribution des allèles d’origine C dans la population montre une répartition
assez homogène, avec des allèles répartis régulièrement dans l’ensemble des ruchers et/ou des
colonies. Ceci montre que les introgressions dans cette populations ne sont pas simplement récentes
mais ont probablement été répétées au cours du temps.
Corse
Pour la population de Corse la situation est différente car les niveaux d’introgression nucléaire sont
très supérieurs à ceux de l’ADN mitochondrial. L’estimation des niveaux d’introgression nucléaire
varie de 2,5% à 18,2 % en fonction des méthodes. Seule la méthode fondée sur les distances donne
une estimation inférieure à celle de l’ADNmt.
Deux interprétations sont possibles pour expliquer ce résultat.
La première est une introgression importante aussi bien nucléaire que mitochondriale, suivie par
une contre sélection des haplotypes d’origine C de l’ADN mitochondrial. La seconde est une
introgression naturelle lors de la colonisation primitive de l’île. Ceci pourrait avoir eu lieu lors du
contact secondaire entre les lignées M et C au nord de l’Italie pendant une période glaciaire. Cette
colonisation aurait été accompagnée d’un « effet de fondation » retenant les haplotypes M au
dépend des haplotypes C.
Les niveaux d’introgressions estimés par région (tableau 8) semblent particulièrement homogènes
ce qui soutient l’hypothèse du caractère naturel des introgressions.
Ruchers Localisation N colonies Allèles
diagnostiques
A Pointe Nord 13 8,5
B Cote Est 69 18,2
C Centre Nord 16 17,4
D Cote Ouest Nord 23 14,4
E Cote Ouest sud 18 22,
F Centre Sud 43 21,7
G Pointe Sud 15 18,9
Tableau 8 : Estimation des niveaux d’introgression dans les 7 régions de Corse.
45
Comme dans le cas de la Provence l’observation de la distribution des allèles d’origine C montre
une répartition relativement homogène de ceux-ci entre les individus. En revanche, on constate une
irrégularité des niveaux d’introgression d’un locus à un autre en faveur de l’hypothèse d’un effet de
fondation. En particulier deux locus (A113 et Ap43) semblent particulièrement fixés sur des allèles
d’origine M, ceci quelque soit la région d’origine de la colonie. Des tests supplémentaires sont
nécessaires concernant les niveaux d’introgression par locus dans cette situation particulière.
Le test de Hardy-Weinberg montrait que la plupart de ces populations n’étaient pas panmictiques.
Du fait de l’homogénéité des niveaux d’introgression observée, il semble évident qu’il faille aller
chercher une autre origine de ces déséquilibres que celle des introgressions.
La recherche d’une structuration génétique des ruchers basée sur l’hypothèse panmictique nous
permettra sans doute de mettre en évidence une structuration locale de la diversité en Corse. Dans
ce cas la population d’abeilles de l’île constitue un bon candidat pour la recherche de populations
écotypiques.
La population d’abeilles de Corse, montre donc un niveau relativement important d’introgression.
Ces introgressions sont probablement anciennes et naturelles et amènent à conclure qu’il existe un
particularisme insulaire qu’il serait intéressant d’étudier plus finement et de conserver.
Classification hiérarchique des ruchers
L’analyse hiérarchique des ruchers (Neighbor Joining sur les distances inter-ruchers) vient
confirmer celle réalisée sur la structure génétique des populations.
Alpes de Haute Provence
Les 15 ruchers sont tous branchés sur la lignée M (figure 12). Ces ruchers sont cependant répartis
de manière hétérogène de part et d’autre des populations de référence M. Deux ruchers (Habitation
et Rousset 2) sortent à la base de cette lignée et sont séparés par des longueurs de branches
relativement importantes, accompagnées de valeurs de bootstrap élevées (99%, 83%, et 62%). Ces
deux ruchers sont ceux qui montrent les niveaux d’introgression les plus importants. L’absence de
structuration au sein de cette population est démontrée par le manque de corrélation entre la
localisation géographique des ruchers et leur position sur l’arbre. La position de ces ruchers sur
l’arbre semble être plus particulièrement influencée par l’hétérogénéité des niveaux
d’introgressions.
46
Figure 12 : Arbre phylogénétique représentant les ruchers d’abeilles des Alpes de Haute
Provence et les populations de référence.
Corse
Contrairement à la situation observée en Provence, les sept régions sont toutes regroupées ensemble
à la base de la lignée M (figure 13). Ceci vient sans doute appuyer l’argument du particularisme
insulaire de cette population.
Les faibles valeurs de bootstrap (inférieures à 50%) observées au sein de ce groupe semblent
indiquer l’absence de structuration en Corse ce qui n’est pas en adéquation avec l’interprétation
faite au paragraphe précédent. Ceci est probablement du au fait que ne disposant d’aucune
information à priori, les regroupements de ruchers pour l’analyse, ont été réalisés en fonction de
leur répartition géographique. Cette répartition ne correspond probablement pas physiquement à la
structuration qui peut exister. La non panmixie observée vient soutenir cette hypothèse. Il est donc
important de continuer nos investigations en recherchant la nature de cette structuration.
Habitation Rousset_2
Canal
Manosque
46
Niozelles
Rousset_1
Majastres
Chaudoul
34
9
Blieux
17
7
4_chemins
Valenciennes
Sabres
Bayonne
72
39
8
6
ObservatoireLimans
Essaim
54
59
1
Rousset_3
Maison
39
6
62
83
99
Arménie
Caucase
95
Grèce 1
Grèce 2
100
Italie
33
Rep_Tchèque
76
Buckfast
62
99
Maroc
47
Figure 13 : Arbre représentant les populations d’abeilles de Corse regroupées en 7 régions (de A
à G) et les populations de référence.
2-2-3/ Choix des colonies pour la constitution du conservatoire
Corse
Etant donné la possible structuration des populations en Corse, il nous a paru judicieux de ne pas
choisir de colonies sur l’ensemble de la Corse pour la constitution d’un conservatoire génétique. Il
est important de cibler en accord avec les membres de l’association « Mele di Corsica », une zone
dans laquelle ils veulent mettre en place un conservatoire. Après avoir défini, celle-ci, un nouvel
échantillonnage centré sur cette zone sera réalisé pour augmenter l’effectif qui permettra la mise en
place de ce conservatoire.
Alpes de Haute-Provence
Afin de déterminer les colonies à sélectionner pour la constitution d’un conservatoire génétique, il
est particulièrement important de pouvoir reconnaître précisément celles qui sont représentatives de
la population d’origine. Pour ceci nous avons utilisé le maximum d’informations dont nous
disposions.
La première étape du choix est réalisée à partir des estimations des niveaux d’introgression
individuels. Les individus qui ont été retenus en priorité ne comportent aucun allèle de la lignée C
aux locus microsatellites diagnostiques. La seconde étape consiste à valider ce choix après
Arménie
Caucase
98
Grèce1
Grèce2
100
43
Rép. Tchèque
Italie
28
55
Buckfast
99
Maroc
100
Région G
Région A
Région D
36
Région B
20
3
Région C Région E
Région F
25
19
45
Valenciennes
Bayonne
Sabres
89
100
48
observation de chacun des individus sur les projections d’une analyse en coordonnées principales
effectuée sur la matrice de distances inter-individuelles.
- Première étape :Ainsi, pour la constitution d’un conservatoire d’abeilles de souche M à partir des
populations d’abeilles des Alpes de Haute Provence, nous avons retenu 31 colonies qui ne
comportaient aucun allèle d’origine C. A titre d’exemple, la figure 14 illustre la validation obtenue
après projections des individus du rucher Rousset 3 pour lequel les colonies 04-26 et 04-28 ont été
retenues. Les figures correspondant aux autres ruchers sont située en annexe 2.
Figure 14 : Projections sur les deux premiers axes de l’Analyse en Coordonnées Principales
(ACP) des colonies du rucher Rousset 3 (astérisque gris). Seuls les contours des nuages de points,
représentant l’ensemble des individus de chaque population de référence, ont été représentés.
-Deuxième étape : Lorsque ce premier tri est réalisé, les colonies sélectionnées font l’objet d’un
nouveau tri qui se base sur les résultats obtenus par l’analyse de l’ADN mitochondrial. Il s’agit de
choisir, parmi les colonies qui appartiennent à la lignée M, un lot de colonies qui respectera les
proportions des différents haplotypes M rencontrés dans la population globale afin de conserver la
Armenie
Maroc
Sabres
Italie
Caucase
Buckfast
Croatie
Valencie nnes
Kazackstan
Grèce_Nord
-50 -40
-40
-30
-30
-20
-20
-10
-10
0
0
Axe 1
Axe 2
10
10
20
20
30
30
40
40
50
29,9 %
5,8 %
Armenie
Maroc
Sabres
Italie
Caucase
Buckfast
Croatie
Valencie nnes
Kazackstan
Grèce_Nord
-50 -40
-40
-30
-30
-20
-20
-10
-10
0
0
Axe 1
Axe 2
10
10
20
20
30
30
40
40
50
29,9 %
5,8 %
Rousset 3
04-26
04-32 04-29
04-27
04-31
04-30
04-28
**
*
**
*
*
49
diversité originale locale. Un total de 22 colonies a ainsi été sélectionné pour la constitution du
conservatoire génétique des Alpes de Haute-Provence.
3/ Approche éco-éthologique
Sous la terminologie d’approche éco-éthologique, on regroupe un ensemble de méthodes visant à
caractériser le cycle biologique des colonies d’une population d’abeilles et analyser les facteurs qui
font que cette population est particulièrement bien adaptée à des conditions régionales particulières.
Celles-ci peuvent se rapporter à des facteurs climatiques (températures, pluviométrie, vent,…) et/ou
à la récolte de nourriture (nectar, pollen, miellat) sur certaines espèces végétales. C’est l’approche
éco-éthologique qui permet, in fine, de mettre en évidence un écotype potentiel, comme cela a été le
cas pour l’écotype landais. Celui-ci, qui avait été décrit il y a plusieurs dizaines d’années par
Louveaux et al. (1966), a été caractérisé à nouveau lors de notre étude réalisée en 2002-2003 avec
le soutien financier du Programme Communautaire pour l’apiculture.
Cette étude éco-éthologique n’a pas seulement un intérêt pour la mise en évidence éventuelle d’un
écotype mais elle est aussi importante pour améliorer les connaissances de la biologie des
populations locales en vue de leur utilisation par les apiculteurs (élevage, production, douceur, …)
Plutôt que les associations apicoles impliquées dans la mise en place des conservatoires réalisent
des études avec des protocoles différents selon les régions – ce qui serait un handicap certain pour
la comparaison des résultats – nous avons proposé que les protocoles soient standardisés. Parmi les
études qu’il semble particulièrement important de réaliser pour caractériser les populations locales
d’abeilles, figurent les mesures de surface du couvain et l’évolution du poids des ruches et des
récoltes de pollen en fonction du temps (saison apicole). Par ailleurs, il est également important de
connaître la composition des congrégations de mâles dans les environs des conservatoires afin de
s’assurer que les fécondations de reines vierges issues de ces conservatoires soient réalisées par des
mâles de même origine.
Les protocoles détaillés de ces différentes analyses sont fournis sur demande aux associations
apicoles intéressées.
Comme ces études sont lourdes à réaliser, nous avons déjà signalé que nous ne pouvions pas les
prendre en charge en totalité, a fortiori dans plusieurs régions à la fois. Ces études doivent donc être
50
réalisées, pour leur plus grande part par les associations concernées. Toutefois, nous proposons de
participer à l’encadrement scientifique de ces études et au traitement statistique de leurs résultats,
puisque nous disposons de tous les outils pour le faire.
Pour le cas particulier de l’analyse de la composition génétique des congrégations de mâles, nous
proposons une assistance technique lors de la capture (utilisation d’un dispositif spécial) et pour
l’analyse génétique des mâles, dans la limite de nos possibilités en personnels.
Au cours de l’année 2003-04, aucune demande de collaboration pour la réalisation de ces analyses
n’a été formulée par les associations apicoles. Des demandes ont été formulées pour l’année 2004-
05 ; elles devront être confirmées avant le 1er février 2005 afin que nous puissions organiser au
mieux le travail.
4/ Perspectives
4-1/ 2ème année du projet
Les conservatoires actuels:
Les efforts de mise en place de conservatoire génétique seront poursuivis :
Landes
Un rucher conservatoire a été mis en place cette année par l’association « Abeille noire des
Landes » (Aquitaine) avec le soutien scientifique de notre équipe. L’analyse du fonctionnement de
la population, en particulier l’analyse de la composition génétique des congrégations de mâles, et
des fécondations de reines a également été poursuivie cette année et semblent confirmer le début
d’isolement reproductif entre l’abeille locale et la souche Buckfast. Ce résultat nous a amené à
conseiller aux apiculteurs désirant travailler avec de l’abeille noire locale, d’élever leurs reines en
fin de saison, et ceux désirant travailler avec la souche Buckfast de faire leurs élevages plutôt en
début de saison.
L’analyse de la descendance de reines Buckfast et locales fécondées de manière naturelle aux deux
périodes sera poursuivie cette année afin de savoir si l’isolement reproducteur est complet dans
cette région.
51
Provence
A Porquerolle, 12 des 24 colonies triées ont été introduites sur l’île (Conservatoire Abeille Noire
Provençale). Dans ce conservatoire, il est important de s’assurer que les colonies introduites
correspondent bien au standard du tri. Un échantillonnage plus conséquent à l’échelle de chaque
colonie sera réalisé (10 abeilles par colonies) et l’analyse moléculaire effectuée.
Une analyse moléculaire initiée en fin d’année 2004 sur la population d’abeilles du Var est en cours
et permettra également de trier des colonies supplémentaires qui seront introduites ultérieurement
dans le conservatoire de Porquerolle. A l’issue de ces nouvelles introductions, le niveau de
variabilité de la population du conservatoire sera comparé à celui des populations continentales afin
de s’assurer du maintien de la diversité génétique. En Provence continentale, l’utilisation
potentielle des résultats obtenus sera également de rechercher une zone de moindre introgression
qui pourrait servir de réservoir de gènes afin de maintenir le niveau de diversité de la population
insulaire.
Corse
La situation est différente de celle de la Provence puisqu’il s’agit de constituer un conservatoire in
situ. La recherche d’une possible structuration de la diversité sur l’île, sera réalisée grâce à un
nouvel échantillonnage. Celui-ci, mené en concertation avec de l’association « Mele di Corsica »),
sera effectué dans deux régions montrant des différences climatiques et écologiques
particulièrement marquées. Cet échantillonnage sera constitué de deux populations de 100 colonies.
Projets de conservatoires
D’autres associations ont déjà mis en place des conservatoires d’abeilles, ou s’apprêtent à le faire:
Abeille noire du pays du Puy de Dôme en Combrailles (Auvergne), Abeille noire bretonne
(Bretagne), Abeille Noire de l’Orne (Basse-Normandie), CETA du Merval (Haute-Normandie),
Centre d’élevage et de fécondation de reines en Vendée (Pays de la Loire), CETA de Savoie
(Rhône-Alpes), Abeille noire du Sud du Hainaut (Belgique, Nord Pas de Calais).
La plupart de ces associations ont déjà participé de manière active à l’étude du cheptel français.
Nous disposons donc des résultats de l’étude mitochondriale qui nous donnent une bonne base de
travail pour la mise en place de ces nouveaux conservatoires.
Des études telles que celles réalisées pour les Alpes de Haute-Provence et la Corse seront initiées
pour ces régions.
52
4-2/ Perspectives ultérieures
Etant donné le nombre de régions montrant un vif intérêt pour la conservation de l’abeille noire, le
travail initié lors de la seconde année ne sera pas terminé. Il est nécessaire de prévoir une
prolongation de l’étude au delà de Août 2005.
Dans l’avenir, il sera également particulièrement important d’assurer le suivi de ces zones
conservatoires afin de ne pas réduire à néant l‘important travail effectué jusqu’à présent. En
particulier, il s’agira de s’assurer du maintien de la diversité génétique dans les zones
conservatoires et de l’absence de nouvelles introgressions. Ceci pourra être assuré par l’étude
régulière à l’aide des outils morphométriques et moléculaires sur un nombre plus restreint de
colonies que celui utilisé pour la mise en place des conservatoires.
53
3ème partie : Diffusion des résultats
Les protocoles de ces expérimentations ainsi que les résultats obtenus ont été (et seront) présentés
aux niveaux national et international.
1/ Au niveau national
1-1/ Diffusion des résultats aux apiculteurs
- Analyse de la biodiversité du cheptel français de l’abeille domestique
Dès que les analyses de l’ADNmt d’une population d’abeilles sont réalisées, et que les niveaux
d’introgression sont calculés, les résultats globaux sont envoyés aux apiculteurs qui ont réalisé
l’échantillonnage.
- Etudes d’impact en vue de la mise en place de conservatoires génétiques
Dès que les niveaux d’introgression des colonies sont calculés, ils sont transmis aux associations
afin qu’elles ne retiennent que les colonies de la lignée M, non introgressées, pour les installer dans
les conservatoires.
1-2/ Première réunion de travail
Nous avons organisé une première réunion de travail sur ce projet le 12 novembre 2003 dans le
Parc Naturel Régional des Landes de Gascogne. Cette réunion avait pour but d’informer les
organisations apicoles régionales et nationales du déroulement du projet, et en particulier d’en
présenter le but, les protocoles, et les résultats attendus.
Les participants potentiellement intéressés avaient été contactés en fonction des informations dont
nous disposions, et en particulier sur les projets de conservatoires d’abeilles en France.
Les associations nationales d’apiculture étaient également représentées.
Un compte rendu de réunion a été envoyé à chaque participant.
Le lieu de cette réunion avait été choisi à l’invitation de l’équipe dirigeante du Parc Naturel des
Landes de Gascogne et de l’association Abeille Noire des Landes, qui sont très impliquées dans le
programme d’étude de l’écotype landais et dans sa protection.
54
Cette réunion, qui a réuni une quarantaine de personnes, a été passionnante grâce aux nombreux
échanges entre les participants. Tous sont intervenus et ont fait part de leur expérience d’éleveurs et
de sélectionneurs d’abeilles.
Les associations suivantes ont présenté leur travail:
ANERCEA
Abeille noire du pays du Puy de Dôme en Combrailles (Auvergne)
Abeille noire des Landes (Aquitaine)
Abeille noire bretonne (Bretagne)
Abeille Noire de l’Orne (Basse-Normandie)
CETA du Merval (Haute-Normandie)
Centre d’élevage et de fécondation de reines en Vendée (Pays de la Loire)
CETA de Savoie (Rhône-Alpes)
1-3/ Deuxième réunion de travail
Une deuxième réunion se tiendra le 6 janvier 2005 au Muséum National d’Histoire Naturelle à
Paris, dans l’amphithéâtre de la grande galerie de l’Evolution. Elle est destinée à présenter les
résultats obtenus en 2003-04 et le programme pour 2004-05.
1-4/ Article de vulgarisation
A la suite de cette réunion, un article présentant les principaux résultats obtenus au cours de la 1ère
année du contrat sera rédigé et proposé aux revues apicoles nationales en vue d’une publication, si
elles le souhaitent.
1-5/ Site web
Un site Web dédié à cette étude est actuellement en cours de construction, et sera opérationnel en
2005.
2/ Au niveau international
2-1/ Congrès internationaux
i) 1ère Conférence Européenne d’Apidologie (EURBEE), Udine (Italie), 19-23 septembre 2004.
Une partie des résultats y a été présentée, sous la forme de plusieurs communications :
55
Communications orales
- Rortais A., J. Strange, N. Dechamp, G. Arnold, W.S. Sheppard, L. Garnery. Genetic structure and
functioning of a honeybee population in South-West of France : Application to bees conservation.
- Garnery L., W.S. Sheppard, M. Baylac, G. Arnold. Genetic diversity of European honeybees.
Communication affichée
- Rortais A., G. Arnold, M. Baylac, L. Garnery. Analysis of the genetic diversity of honeybees in
France & establishment of genetic conservatories.
ii) Conférence internationale Biodiversité, science et gouvernance, UNESCO, Paris 24-28 janvier
2005.
Un poster a été proposé : Rortais A., G. Arnold, M. Baylac, L. Garnery Analyse de la biodiversité
du cheptel français de l’abeille domestique. Etudes d’impact en vue de la mise en place de
conservatoires génétiques.
iii) 8th International Conference on Tropical Bees
Communications orales
Strange J.P. L. Garnery & W.S. Sheppard. Study of differencial genotype contributions in honey
bee mating area
L. Garnery, W.S. Sheppard, M. Baylac & G. Arnold Genetic diversity of European Honeybees
iv) Congrès international apicole Apimondia, Dublin, 21-26 août 2005.
Les résultats de ce travail seront présentés à la fois sous forme de communication orale et de
posters.
2-2/ Articles scientifiques
Un article scientifique sur la diversité des haplotypes de la lignée M, et particulièrement en France,
est actuellement en cours de rédaction et sera proposé dans une revue internationale à comité de
lecture.
Deux autres articles présentant les résultats de l’analyse nucléaire et ceux de l’analyse
morphométrique sont également en préparation.
56
4ème partie : Références bibliographiques et Annexes
Références bibliographiques
Battesti M.J. 1980 Etude biométrique de colonies d’abeilles corses. Rapport DEA écologie
Méditerranéenne , Univ. Aix-Marseille III. 69pp
Bonnet R., F. Pons, Y. Bidault 1987 Première contribution à l’inventaire, la sauvegarde et la
valorisation des lignées pures d’abeilles noires provençales . Rapport Page Paca. 45pp
Cavalli-Sforza L. L., Edwards A. W. F., 1967. Phylogenetic analysis : models and estimation
procedures, Am. J. Hum. Genet. 19, 233-257.
Chakraborty R., Jin L. 1993., A unified approach to study hypervariable polymorphism : statistical
considerations of determining relatedness and population distances, in Pena S. D. J Chakraborty R.,
Eplen J. T. Jeffreys A. J. (Eds.) DNA fingerprinting state of the Science , Birkhauser Verlag, Basel
153 -175.
Cornuet J.M., J. Albisetti, N. Mallet,et J. Fresnnye, 1982 Etude biométrique d’une population
d’abeilles landaises. Apidologie 13 (1), 3-13
Cornuet J.M., Piry S., Luikart G., Estoup A., Solignac M., 1999 – Comparison of methods
employing multilocus genotypes to select or exclude populations as origins of individuals.
GENECLASS (version 1.0.02;), http://www.ensam.inra.fr/URLB
De la Rùa P., Serrano J., Galliàn J., 1998. Mitochondrial DNA variability in the Canary Islands
honeybees (Apis mellifera L.), Mol. Ecol. 7, 1543-1547.
Estoup A., Garnery L., Solignac M., Cornuet J-M., 1995. Microsatellite variation in honey bees
(Apis mellifera) populations : hierarchical genetic structure and test of infinite and stepwise
mutation models. Genetics 140, 679-695.
Estoup A., Lagarder C. R., Perrot E., Chourrout D., 1996. Rapid one-tube test DNA extraction for
reliable PCR detection of fish polymorphic markers and transgenes. Molecular marine biology and
biotechnology 5, 295-298.
Franck P, L. Garnery, M. Solignac and J.-M. Cornuet, 1998. The origin of West European
subspecies of honeybees (Apis mellifera): new insights from microsatellite and mitochondrial data.
Evolution 52, 1119-1134.
Franck P, L. Garnery, G. Celebrano, M. Solignac, J.M. Cornuet, 2000a. Hybrid origins of the
Italian honey bee (Apis mellifera ligustica and A. m. sicula). Mol. Ecol. 9, 907-921.
57
Franck P., L. Garnery, M. Solignac, J.M. Cornuet 2000b Molecular confirmation of a fourth lineage
in honeybees from Near East. Apidologie 31, 167-180
Franck P., L. Garnery, A. Loiseau, B.P. Oldroyd, H.R. Hepburn, M. Solignac et J.M. Cornuet 2001;
Genetic diversity of the honeybee in Africa: microsatellite and mitochondrial data. Heredity 86,
420-430
Garnery L. 1992 Variabilité de l’ADN mitochondrial de l’abeille domestique: implications
phylogénétiques Thèse doctorat Univ. Paris VI 170pp
Garnery L., J.M. Cornuet, and M. Solignac, 1992. Evolutionary history of the honeybee (Apis
mellifera L.) inferred from mitochondrial DNA analysis. Mol. Ecol. 3, 145-154.
Garnery L., M. Solignac, G. Celebrano, and J.M. Cornuet, 1993. A simple test using restricted
PCR-amplified mitochondrial DNA to study the genetic structure of Apis mellifera L.: Experientia
49:1016-1021.
Garnery L., E.H. Mosshine and J.M. Cornuet, 1995. Mitochondrial DNA variation in Morrocan and
Spannish honey bee populations. Mol. Ecol. 4:465-471.
Garnery L., P. Franck, E. Baudry, D. Vautrin, J.M. Cornuet, et M. Solignac, 1998a. Genetic
biodiversity of the West european honey bee (Apis mellifera mellifera and A. m. iberica) I:
Mitochondrial DNA. Gen. Sel. Evol. 30 (1): 31-47.
Garnery L., P. Franck, E. Baudry, D. Vautrin, J.M. Cornuet, et M. Solignac, 1998b. Genetic
biodiversity of the West european honey bee (Apis mellifera mellifera and A. m. iberica) II:
Microsatellite loci. Gen. Sel. Evol. 30 (1): 49-74.
Kauhausen-Keller D. and Keller R., 1994. Morphometrical control of pure race breeding in the
honeybee. Apidologie 25, 133-143.
Langella, 1999 logiciel POPULATIONS (version 1.2.21,).
Langella, 2001 logiciel TREEPLOT (version 0.6,) .
Langella 2001programme NUEES (version 0.8,).
Louveaux J., Albisetti J. M., Theurkauff M., 1966. Les modalités de l'adaptation des abeilles (Apis
mellifica L.) au milieu naturel. Ann. Abeille 9 (4), 323-350.
Louveaux J.,1973. The acclimatization of bees to a heather region Bee World 54, 105-111
Mallet N., 1976, Etude biométrique d’une population locale d’abeilles dans la grande lande.
Mémoire ENITA 77pp
58
Mallet N. 1990 Etude biométrique et électrophorétique des populations d’abeilles dans le Puy-de-
Dome. Rapport de projet: Ministère de l’agriculture-région Auvergne 74pp
Mesquida J., 1975 Influence des facteurs écologiques sur le rythme annuel de développement des
colonies d’abeilles. Thèse doctorat Univ. Rennes 167pp
Nei M., 1978. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of
individuals, Genetics 47, 253-259.
Nei M., Tajima F., 1981. DNA polymorphism detectable by restriction endonucleases, Genetics 97,
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Raymond M., Rousset F., 1995. Genepop (Version 3.) : population genetics sofware for exact test
and ecumenism, J. Hered. 86, 248-250.
Ruttner F., Tassencourt L. et Louveaux J., 1978. Biometrical-statistical analysis of the geographic
variability of Apis mellifera, Apidologie 9, 363-381.
Ruttner F., 1988. Biogeography and taxonomy of honey bees, Springer-Verlag, Berlin, pp 284
Saitou N., Nei M., 1987. The neighbor-joining method : a new method for reconstructing
phylogenetic trees, Mol. Biol. Evol. 4, 406-425.
Sheppard W.S. and Berlocher S.H., 1985. New allozyme variability in Italian honey bees. J. Hered.
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Sheppard, W.S., M.C. Arias, M.D. Meixner and A. Grech. 1997. Apis mellifera ruttneri, a new
honey bee subspecies from Malta. Apidologie 28:287-293.
Sheppard et Meixner 2003. Apis mellifera pomonella, a new honey bee subspecies from Central
Asia. Apidologie 34 (2003) 367-375
Smith D.R., 1991 African bees in the Americas:insight from biogeography and genetics. Tree 6 (1),
17-21
Smith D.R., M.F. Palopoli, B.R. Taylor, L. Garnery, J.M. Cornuet, M. Solignac, and W.M. Brown
et al. 1991 Geographical overlap of two mitochondrial genomes in Spanish honeybees
(A.m.iberica) J. Hered. 82 (2), 96-100
Takezaki N, Nei M., 1996. Genetic distances and reconstruction of phylogenetic trees from
microsatellite DNA, Genetics 144, 389-399.
59
Annexe 1
Echantillonnage des abeilles du département XX
Année YY
Tube
(numéro des tubes à l’envoi) Apiculteur
(nom et prénom
des apiculteurs)
Rucher
(numéro DSV des
ruchers)
Colonie
(numéro des colonies et informations
supplémentaires*)
Localité
(nom, numéro de département et coordonnées GPS
du lieu d’échantillonnage)
Complément
d’information sur
les colonies*
* colonies transhumantes ou provenant d’essaims, reine achetée, origine de la souche (Buckfast, Starline,…) et du pays d’importation (Ligustica d’Italie ou de Nouvelle
Zélande, par exemple), quand ces données sont connues
60
ANNEXE 2
Validation des colonies choisies (astérisques noirs) et des autres colonies des ruchers des Alpes de Haut-
Provence (astérisques gris) par rapport aux populations de références.
Armenie
Maroc
Sabres
Italie
Caucase
Buckfast
Croatie
Valenciennes
Kazackstan
Grèce_Nord
-50 -40
-40
-30
-30
-20
-20
-10
-10
0
0
Axe 1
Axe 2
10
10
20
20
30
30
40
40
50
29,9 %
5,8 %
*
*
*
*
**
**
**
04-10
04-04
04-09
04-06 04-08
04-01
04-07
04-02
04-05
04-03
Canal
Armenie
Maroc
Sabres
Italie
Caucase
Buckfast
Croatie
Valenciennes
Kazackstan
Grèce_Nord
-50 -40
-40
-30
-30
-20
-20
-10
-10
0
0
Axe 1
Axe 2
10
10
20
20
30
30
40
40
50
29,9 %
5,8 %
Armenie
Maroc
Sabres
Italie
Caucase
Buckfast
Croatie
Valenciennes
Kazackstan
Grèce_Nord
-50 -40
-40
-30
-30
-20
-20
-10
-10
0
0
Axe 1
Axe 2
10
10
20
20
30
30
40
40
50
29,9 %
5,8 %
Rousset 1
04-11 04-17
04-15
04-13
04-12
04-16 04-14
**
***
**
Armenie
Maroc
Sabres
Italie
Caucase
Buckfast
Croatie
Valenciennes
Kazackstan
Grèce_Nord
-50 -40
-40
-30
-30
-20
-20
-10
-10
0
0
Axe 1
Axe 2
10
10
20
20
30
30
40
40
50
29,9 %
5,8 %
Armenie
Maroc
Sabres
Italie
Caucase
Buckfast
Croatie
Valenciennes
Kazackstan
Grèce_Nord
-50 -40
-40
-30
-30
-20
-20
-10
-10
0
0
Axe 1
Axe 2
10
10
20
20
30
30
40
40
50
29,9 %
5,8 %
Rousset 2
04-21
04-19
04-23
04-24
04-25
04-20
04-22
04-18
*
*
**
***
*
Armenie
Maroc
Sabres
Italie
Caucase
Buckfast
Croatie
Valenciennes
Kazackstan
Grèce_Nord
-50 -40
-40
-30
-30
-20
-20
-10
-10
0
0
Axe 1
Axe 2
10
10
20
20
30
30
40
40
50
29,9 %
5,8 %
04-46
04-49
04-48
04-45
04-50 04-51
04-47
**
*
*
*
*
*
4 chemins
Armenie
Maroc
Sabres
Italie
Caucase
Buckfast
Croatie
Valenciennes
Kazackstan
Grèce_Nord
-50 -40
-40
-30
-30
-20
-20
-10
-10
0
0
Axe 1
Axe 2
10
10
20
20
30
30
40
40
50
29,9 %
5,8 %
Blieux
**
*
*
*
*
04-107
04-109
04-110
04-111
04-112
04-108
Armenie
Maroc
Sabres
Italie
Caucase
Buckfast
Croatie
Valenciennes
Kazackstan
Grèce_Nord
-50 -40
-40
-30
-30
-20
-20
-10
-10
0
0
Axe 1
Axe 2
10
10
20
20
30
30
40
40
50
29,9 %
5,8 %
Chaudoul
04-111
04-112
04-113
04-114
04-115
04-116
04-117
04-118
04-119
04-120
04-121
*
*
**
*
*
*
**
*
*
Armenie
Maroc
Sabres
Italie
Caucase
Buckfast
Croatie
Valen ci e nn es
Kazackstan
Grèce_Nord
-50 -40
-40
-30
-30
-20
-20
-10
-10
0
0
Axe 1
Axe 2
10
10
20
20
30
30
40
40
50
29,9 %
5,8 %
Armenie
Maroc
Sabres
Italie
Caucase
Buckfast
Croatie
Valen ci e nn es
Kazackstan
Grèce_Nord
-50 -40
-40
-30
-30
-20
-20
-10
-10
0
0
Axe 1
Axe 2
10
10
20
20
30
30
40
40
50
29,9 %
5,8 %
Essaim
04-87 04-91
04-89
04-97
04-96
04-94
04-93
04-90 04-98
04-85
04-95 04-92
04-86
04-88
*
*
**
****
*
*
*
***
Armenie
Maroc
Sabres
Italie
Caucase
Buckfast
Croatie
Valen ci e nn es
Kazackstan
Grèce_Nord
-50 -40
-40
-30
-30
-20
-20
-10
-10
0
0
Axe 1
Axe 2
10
10
20
20
30
30
40
40
50
29,9 %
5,8 %
Habitation
04-122
04-124 04-125
04-126 04-127
04-128
04-129
04-130
04-131
04-132
04-133
04-134
04-135
04-137
04-138
04-139 04-140
04-141
04-142
04-143
04-144
**
*
*
****
**
*
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**
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Thesis
* Inra Poitou-Charentes, ERIST, Route de Saintes BP 6, 86600 Lusignan (FRA) Diffusion du document : Inra Poitou-Charentes, ERIST, Route de Saintes BP 6, 86600 Lusignan (FRA) Diplôme : Dr. d'Université
Article
Data on DNA polymorphisms detected by restriction endonucleases are rapidly accumulating. With the aim of analyzing these data, several different measures of nucleon (DNA segment) diversity within and between populations are proposed, and statistical methods for estimating these quantities are developed. These statistical methods are applicable to both nuclear and non-nuclear DNAs. When evolutionary change of nucleons occurs mainly by mutation and genetic drift, all the measures can be expressed in terms of the product of mutation rate per nucleon and effective population size. A method for estimating nucleotide diversity from nucleon diversity is also presented under certain assumptions. It is shown that DNA divergence between two populations can be studied either by the average number of restriction site differences or by the average number of nucleotide differences. In either case, a large number of different restriction enzymes should be used for studying phylogenetic relationships among related organisms, since the effect of stochastic factors on these quantities is very large. The statistical methods developed have been applied to data of Shah and Langley on mitochondrial (mt)DNA from Drosophila melanogaster, simulans and virilis. This application has suggested that the evolutionary change of mtDNA in higher animals occurs mainly by nucleotide substitution rather than by deletion and insertion. The evolutionary distances among the three species have also been estimated.
Article
This lecture, given at the Sixth Bee Research Association Conference at St. Andrews in June 1972, gives a brief summary of some of the research done by the author and his colleagues on the important question of acclimatization. One of the two areas used for the experiments is the open forest land on the south-west coast of France, where heather gives the main (late) honey flow. The other area is the Paris basin, where the seasonal cycle is a more usual one, with spring and summer flows.It is very easy nowadays to transport queens (and package bees) from one part of the world to another, and a strain of bees known to the beekeeper only from glowing descriptions may seem to offer him a miraculous solution to problems of low yields, poor wintering, and so on. The experiments described here show that the introduction of queens from a quite different type of region may be a traumatic experience for the colonies, and that the outcome is not necessarily beneficial.
Article
A new method called the neighbor-joining method is proposed for reconstructing phylogenetic trees from evolutionary distance data. The principle of this method is to find pairs of operational taxonomic units (OTUs [= neighbors]) that minimize the total branch length at each stage of clustering of OTUs starting with a starlike tree. The branch lengths as well as the topology of a parsimonious tree can quickly be obtained by using this method. Using computer simulation, we studied the efficiency of this method in obtaining the correct unrooted tree in comparison with that of five other tree-making methods: the unweighted pair group method of analysis, Farris's method, Sattath and Tversky's method, Li's method, and Tateno et al.'s modified Farris method. The new, neighbor-joining method and Sattath and Tversky's method are shown to be generally better than the other methods.
Article
Apis mellifera is composed of three evolutionary branches including mainly African (branch A), western and northern European (branch M), and southeastern European (branch C) populations. The existence of morphological clines extending from the equator to the Polar Circle through Morocco and Spain raised the hypothesis that the branch M originated in Africa. Mitochondrial DNA analysis revealed that branches A and M were characterized by highly diverged lineages implying very remote links between both branches. It also revealed that mtDNA haplotypes from lineages A coexisted with haplotypes M in the Iberian Peninsula and formed a south-north frequency cline, suggesting that this area could be a secondary contact zone between the two branches. By analyzing 11 populations sampled along a France-Spain/Portugal-Morocco-Guinea transect at 8 microsatellite loci and the DraI RFLP of the COI-COII mtDNA marker, we show that Iberian populations do not present any trace of 'africanization' and are very similar to French populations when considering microsatellite markers. Therefore, the Iberian Peninsula is not a transition area. The higher haplotype A variability observed in Spanish and Portuguese samples compared to that found in Africa is explained by a higher mutation rate and multiple and recent introductions. Selection appears to be the best explanation to the morphological and allozymic clines and to the diffusion and maintenance of African haplotypes in Spain and Portugal.