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Germinación simbiótica y asimbiótica en semillas de
orquídeas epifitas
Symbiotic vs. asymbiotic seed germination in epiphytic orchids
¹Joel Tupac Otero Ospina, ² Paul Bayman
¹Departamento de Ciencias Biológicas, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Nacional de Colombia Sede Palmira,
AA. 237, Palmira, Valle del Cauca, Colombia. 2Departamento de Biología, Universidad de Puerto Rico - Río Piedras. P. O. Box
23360, San Juan, PR 00931-3360. Autor para correspondencia: jtoteroo@unal.edu.co
Rec.: 12-03-08 Acept.: 01-10-09
Resumen
Se compara el crecimiento de plántulas de la orquídeas epifita Tolumnia variegata en medios de agar
con y sin hongos micorrízicos. Los métodos de germinación simbiótica produjeron embriones de T.
variegata más desarrollados que los métodos de germinación asimbiótica y las diferencias fueron
estadísticamente significativas. Las semillas en los controles en medio de celulosa sin hongos micorrízicos
no germinaron. Las semillas de Epidendrum ramosum, Lepanthes rupestris y Psychilis monensis no
mostraron diferencias significativas en germinación entre métodos simbiótica y asimbiótica utilizando
hongos aislados de raíces de T. variegata, incluso algunos aislados del grupo Rhizoctonia parasitaron
las semillas. Los resultados sugieren que las semillas de orquídeas epifitas y sus hongos micorrízicos
son más específicos de lo que anteriormente se había creído y por tanto es necesario utilizar los hongos
específicos para cada especie de orquídea. Además, se sugiere que los cultivadores de orquídeas
podrían obtener mejores resultados en la propagación de orquídeas epifitas si utilizan metodologías de
germinación simbiótica apropiados.
Palabras clave: Tolumnia variegata, Epidendrum ramosum, Lepanthes rupestres, Psychilis monensis.
Orchidaceae, germinación, hongos micorrízicos
Abstract
We compared seedling growth of the epiphytic orchid, Tolumnia variegata in agar media with and
without inoculated mycorrhizal fungi. Symbiotic germination produced more-developed embryos than
asymbiotic germination. Differences were highly significant, although some isolates of Rhizoctonia-like
fungi were parasitic on seeds. Control seeds in a cellulose medium without Rhizoctonia-like fungi did
not germinate. Seeds of Epidendrum ramosum, Lepanthes rupestris and Psychilis monensis showed no
significant differences between asymbiotic and symbiotic germination using mycorrhizal fungi isolated
from T. variegata roots, suggesting high mycorrhizal specificity. Our data suggest that the relationship
between epiphytic orchids and the mycorrhizal fungi is more specific than previously thought. The use
of the right fungal strain may enhance germination performance. Orchid growers may achieve better
results in the propagation of some epiphytic orchids using symbiotic germination.
Key words: Tolumnia variegata, Epidendrum ramosum, Lepanthes rupestris and Psychilis monensi,
Orchidaceae, germination, mycorrhizal fungi
¹ Biólogo, Ph.D. en Biología y Filosofía.
2 Biólogo, Ph.D. en Botánica.
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Introducción
Desde los trabajos pioneros de Knudson
(1921), los horticultores han germinado las
semillas de orquídeas mediante la utilización
de combinaciones de nutrientes en condicio-
nes estériles (Arditti 1992). Sólo cuando estos
métodos fallan, los orquicultores retoman las
técnicas de germinación de semillas usando
los simbiontes naturales (Bernard 1899).
Todas las orquídeas requieren una aso-
ciación micorrízica para la germinación de
sus semillas, principalmente con hongos
basidiomicetos del grupo de Rhizoctonia
(Rasmussen, 1995). Rhizoctonia sensu latu
es un grupo artificial que incluye hongos cu-
yas etapas sexuales pertenecen a los géneros
Thanatephorus, Ceratobasidium, Sebacina y
Tulasnella (Sneh et al. 1991). Esta depen-
dencia se asocia con las mínimas cantidades
de nutrientes almacenados en las diminutas
semillas de las orquídeas (Arditti y Ghani
2000). Sin embargo, los hongos del grupo
de Rhizoctonia son bien conocidos por sus
capacidades patogénicas en muchos grupos
diferentes de plantas.
La germinación artificial de semillas de
orquídeas terrestres de zonas templadas es
extremadamente difícil y requiere formulacio-
nes de nutrientes muy específicas en medios
asépticos de germinación (Arditti, 1992). Por
tanto muchos cultivadores e investigadores
utilizan hongos simbióticos para la propaga-
ción. Esto contrasta con el cultivo de muchas
orquídeas epifitas tropicales, que en general
son relativamente fáciles de germinar en
condiciones asimbióticas. En consecuencia,
los cultivadores de orquídeas tropicales no
utilizan la germinación simbiótica para su
propagación. Por estas razones se conocen
mucho mejor las interacciones simbióticas de
germinación de las orquídeas terrestres de
zonas templadas que las de orquídeas epífi-
tas tropicales. Sin embargo, las técnicas de
germinación simbiótica de semillas epifitas
tropicales podrían mejorar el éxito de cultivo
de estas orquídeas tanto para fines comer-
ciales como de conservación. El objetivo de
este estudio fue comparar el éxito en pro-
gramas de propagación de orquídeas epifitas
tropicales utilizando técnicas simbióticas y
asimbióticas de germinación.
Materiales y métodos
Tolumnia variegata (Sw.) Braem (Orchidaceae;
subfamilia Epidendroideae; tribu Maxilla-
rieae) es una orquídea epifita tropical endé-
mica de las Antillas Mayores, con excepción
de Jamaica. Su nombre hace referencia a su
alta variación en sus características florales
(Foto 1) (Ackerman 1995). Las semillas para
Foto 1: Planta adulta de Tolumnia variegata en su hábitat natural.
GERMINACIÓN SIMBIÓTICA Y ASIMBIÓTICA EN SEMILLAS DE ORQUÍDEAS EPIFITAS
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ACTA AGRONÓMICA . 58 (4) 2009, p 270-276
este estudio se recolectaron en una población
en la zona adyacente a la reserva Natural
Laguna de Tortuguero en Manatí (18° 27’ 37”
N, 66° 25’ 30” O), Puerto Rico, entre 5 y 10
m.s.n.m. La precipitación promedio anual
es de 1.688 mm y la temperatura de 25.4 ºC.
La zona es clasificada como bosque húmedo
tropical en la escala de Holdrige (Ewel y
Whitmore 1973).
Se realizaron cuarenta y ocho aisla-
mientos de Rhizoctonia (Figura 1) a partir
de plantas adultas y juveniles de diferentes
poblaciones puertorriqueñas de T. variegata
(Otero et al., 2002, 2004, 2005, 2007). Las
raíces de plantas epifitas encontradas sobre
arbustos de Randia aculeata L. (Rubiaceae)
y Psidium guajaba L. (Myrtaceae) se lavaron
con Tween 20 en agua corriente y se este-
rilizaron superficialmente mediante baños
seriales en etanol (70%, 1 min), hipoclorito
de sodio (2.5%, 2 min) y etanol (70%, 1min).
Los segmentos de raíces fueron inoculados
en condiciones asépticas en agar de papa y
dextrosa (PDA) y agar de extracto de malta
(MEA). Los hongos endófitos fueron identifi-
cados en el microscopio utilizando la guía de
Sneh et al. (1991). Los hongos con caracte-
rísticas microscópicas de Rhizoctonia fueron
transferidos a PDA y caracterizados hasta
morfoespecies. Caracterizaciones molecula-
res están disponibles en la literatura (Otero
et al. 2002, 2004, 2005, 2007).
Los frutos de T. variegata fueron reco-
lectados del sitio de estudio y esterilizados
superf icialmente utilizando los mismos
procedimientos que se usaron para las raí-
ces. Las semillas fueron extraídas del fruto
en condiciones estériles y su viabilidad fue
evaluada con tinción de cloruro de trifenil
tretrazolio (TTC, por sus siglas en inglés)
(Otero et al., 2005).
Para examinar el efecto de los aislados
de Rhizoctonia en la germinación de semillas,
en placas Petri con Agar de Celulosa (CA) se
sembró una mezcla de por lo menos 100 semi-
llas de las tres plantas con mayor viabilidad,
en cada una de las cuales se había inoculado
un aislado diferente de Rhizoctonia tres días
antes. Se evaluaron siete hongos y se inclu-
yeron placas control inoculadas con semillas,
pero sin el hongo. La germinación asimbiótica
para cada especie de orquídea fue evaluada
en cinco placas con medio comercial Knudson
C (KC, Sigma Aldrich Inc.). Se realizaron
dos tomas de datos, a las dos semanas y,
dos meses después de la inoculación. Para
ello se midieron diez plántulas escogidas al
azar de cada placa Petri. Adicionalmente,
cada semilla fue asignada a un estado de
desarrollo de acuerdo con Stenberg y Kane
(1998). En ausencia de germinación la se-
milla se registró en estado cero (0) (Figura
2B). El embrión < 1000 µm se registró en
estado 1 (Figura 2C), con pelos absorbentes se
registró en estado 2, con un primordio foliar
se registró en estado 3 (Figura 2D), con una
hoja en desarrollo y un primordio foliar se
registró en estado 4, y con 2 hojas se regis-
tró en estado 5 (Figura 2E). Finalmente, las
plántulas pequeñas se registraron en estado
Figura 1: Rhizoctonia sp., cepa aislada de raíces de Tolumnia variegata. (A) Constricción en la ramificación de las hifas de
Rhizoctonia. (B) Células monilioides.
A B
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GERMINACIÓN SIMBIÓTICA Y ASIMBIÓTICA EN SEMILLAS DE ORQUÍDEAS EPIFITAS
6 (Figura 2F). Las semillas parasitadas,
determinadas por el crecimiento de hifas a
partir de las semillas (Figura 2A), registraron
valor negativo (-1).
El efecto de los hongos aislados de T.
variegata también fue evaluado en la ger-
minación de Epidendr um ramosum Jacq.
(subfamilia Epidendroideae), Lepanthes ru-
pestris Stimson (subfamilia Pleurotallidiinae)
y Psychilis monensis Sauleda (subfamilia Epi-
dendroideae). Los datos fueron recolectados
dos semanas después de la siembra de las
semillas en la misma forma descrita anterior-
mente para los experimentos de germinación
de semillas de T. variegata. Para el análisis
de los resultados se utilizó la varianza de
una vía ya que cumplían con los requisitos
de normalidad exigidos para el análisis.
Resultados
En total fueron aislados 55 hongos (clasifi-
cados en 26 morfoespecies) de raíces de T.
variegata y 48 hongos (21 morfoespecies) con
características de Rhizoctonia (87.3%), 31 de
los cuales (en 13 morfoespecies) fueron eva-
luados como micorrizantes. Algunos aislados
fueron micorrízicos, pero otros parasitaron
las semillas. Trece (6 morfoespecies) mos-
traron un efecto positivo en la germinación
de semillas.
Los embriones de T. variegata que germi-
naron en presencia de uno de los 13 aislados
de Rhizoctonia aislados a partir de T. varie-
gata fueron significativamente más grandes
que aquellos que germinaron en el medio de
Knudson (ANOVA de una vía, F(1,9) = 63,00,
P < 0.0001) dos semanas después de haber
sido inoculados (Figura 3). También se encon-
traron diferencias significativas (ANOVA de
una vía, F(1,9) = 62,32, P < 0.0001) dos meses
después de la inoculación (Figura 4).
La germinación de otras especies de or-
quídeas con hongos micorrízicos de T. varie-
gata no mostró ventajas relativas en relación
con la germinación simbiótica (ANOVA de
una vía, E. ramosum F(1,7) = 1,15, P = 0.32; L.
rupestris F1,7 P = 0.32; y P. monensis F1,7 =
0,53 P = 0.50). Las semillas de L. rupestris y
P. monensis iniciaron germinación con todos
los hongos, mientras que en E. ramosum la
germinación se indujo con todos, menos dos
hongos (Figura 5).
Figura 2: Estados de germinación de semillas y desarrollo de protocormos en Tolumnia
variegata.
274
Figura 4: Germinación de semillas de Tolumnia variegata 2 meses después de la inoculación
con diferentes aislados y con controles. Kc Medio Knudson C. Cell: Medio de
celulosa sin hongo micorrízico.
Discusión
Las semillas de T. variegata germinaron mejor
en presencia de hongos aislados de T. varie-
gata que en el medio de Knudson. Aunque
los hongos micorrízicos no son utilizados fre-
cuentemente para la germinación in vitro de
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a
bbb
d
-2
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Crecimiento
t9j-1 t10j-1 t10j-2 Kct5j-2t2j-2
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
t9j-1
t1j-2 t2j-2 t7j-1a t10j-2 t11a- Kc Cell1 Cell2
1
a a a a a a
b b b
Tratamiento
Germinación %
Figura 3: Germinación de semillas de Tolumnia variegata dos semanas después de la inoculación con
diferentes hongos y con controles. Kc Medio Knudson C. Cell: Agar de celulosa sin hongo
micorrízico.
semillas de orquídeas epifitas, la utilización
de cepas apropiadas de micorrizas podría
mejorar el cultivo de estas plantas a partir de
semillas. No obstante, los hongos micorrízi-
cos aislados de T. variegata no fueron tan be-
néficos para inducir la germinación de otras
275
especies de orquídeas epifitas. Los datos en
este estudio sugieren que las relaciones entre
orquídeas epifitas y sus micorrizas son más
específicas de lo que se había creído (Arditti
et al. 1990). Dicha especificidad puede com-
plicar la aplicación comercial de estos hongos
en el cultivo de orquídeas, porque implica que
cada especie necesita un grupo particular
de ellos. Se precisa más investigación para
identificar los simbiontes naturales asociados
con las especies de importancia económica y
con las especies amenazadas, con el fin de
mejorar las condiciones de cultivo a partir de
semillas. Esta meta se facilitaría mediante
la creación y el análisis in vitro de un ban-
co de cepas micorrízicas de orquídeas y la
evaluación de los efectos en la germinación
de diferentes especies de orquídeas. Estos
GERMINACIÓN SIMBIÓTICA Y ASIMBIÓTICA EN SEMILLAS DE ORQUÍDEAS EPIFITAS
Figura 5: Germinación de semillas de Epidendrum ramosum (A), Lepanthes rupestris (B), y Psychilis monensis
(C) 2 semanas después de la inoculación con diferentes hongos micorrízicos con controles. Kc Medio
Knudson C.
0,5
T1j-2 T2j-2 t5j-2
Epidendrum ramosum
t6j-2 t9j-1 t10j-1 t10j-2 Kc
0,4
%0,3
0,2
0,1
0
T1j-2 t5j-2
Lepanthes rupestris
t6j-2 t10j-1 t10j-2 Kc
1
0,8
0,6
0,4
0
0,2
1
0,8
0,6
%
0,5
0,5
0,5
T1j-2 T2j-2 t5j-2
Psycilis monensis
t6j-2 t9j-1 t10j-1 t10j-2 Kc
Tratamientos
resultados permitirán el aprovechamiento
sostenible de un recurso importante en la
floricultura, como lo son las orquídeas epifi-
tas tropicales.
La germinación simbiótica de semillas de
orquídeas también tiene otra ventaja sobre
la germinación asimbiótica. Los medios de
cultivo para germinación asimbiótica (como
el medio de Knudson C que se utilizó en este
ensayo) son ricas en azúcares y nutrientes,
y las plántulas tardan meses para estable-
cerse. Esta combinación pone las plántulas
suceptibles a la contaminación fúngica. La
inoculación de las semillas con un hongo
micorrízico contribuye a evitar el crecimiento
de otros hongos que las pueden contaminar
(Porras and Bayman, 2007).
276
Conclusiones
Las técnicas de germinación simbiótica uti-
lizando hongos micorrízicos de orquídeas
son una alternativa para la germinación de
semillas de estas plantas epifitas tropicales.
En comparación con la utilización de métodos
asimbióticos, el uso de simbiontes naturales
puede ser más eficiente si se cuenta con los
hongos apropiados para la germinación.
Desafortunadamente, aún se conoce muy
poco sobre cuáles son los simbiontes más
apropiados para las especies de orquídeas
con importancia económica y por tanto es
recomendable hacer estudios más profundos
que permitan identificar los mejores hongos
para estimular la germinación in vitro de
dichas especies.
Agradecimiento
A L. Amaury Castro, Angélica Carrillo, Jes-
syka García, Laura Fidalgo, Paola Pabón, An-
drea Porras y Sergio Rocafort por su ayuda en
el laboratorio. Nicola S. Flanagan nos brindó
un inmenso apoyo. Esta investigación fue
apoyada por una beca de NSF-EPSCoR (NSF
grant EPS-9874782) y de NASA-IRA otorgada
a J. T. Otero.
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