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Extractos de neem en el comportamiento
de
Aphis nerii
y la transmisión del virus
de la mancha anular del papayo
1,2
Elías Hernández-Castro
3
, Víctor Utrera-Landa
3
,
Juan A. Villanueva-Jiménez
3,4
, Daniel A. Rodríguez-Lagunes
5
y Mario M. Ojeda-Ramírez
6
J. Agric. Univ. P.R. 89(1-2):75-84 (2005)
RESUMEN
Se determinó el efecto de extractos de neem en el comportamiento de
alimentación y la transmisión del Virus de la Mancha Anular del Papayo
(PRSV-p) por
Aphis nerii
. Se evaluó un extracto acuoso al 10% de semillas
de neem sin escarificar, y un testigo con agua, asperjados en plantas de pa-
payo en el laboratorio. El comportamiento de alimentación del áfido se
estudió en dos fases: exploratoria (0 hasta 3 min) y de alimentación (>3
hasta 20 min). Se determinó la mortalidad de áfidos a las 24 h. El análisis de
la transmisión del virus se realizó con base en pruebas de ELISA. No se de-
tectaron diferencias significativas (p > 0.05) en cuanto al comportamiento
de alimentación para la fase exploratoria, lo que indica que el neem no
afecta la búsqueda y el probado inicial del áfido sobre la planta. En cambio,
un número significativamente mayor de áfidos (p < 0.05) dejó de alimentarse
en la fase >3 hasta 20 min. Además, la mortalidad de áfidos es mayor (p <
0.05) en el tratamiento con plantas asperjadas con neem (37% vs. 10%). No
se encontraron diferencias significativas (p > 0.05) en la transmisión del
PRSV-p por
Aphis nerii
, lo que indica que los extractos acuosos de semillas
de neem no impiden la transmisión del virus.
Palabras clave:
Azadirachta indica
, transmisión viral, VMAP, virus no persis-
tente
ABSTRACT
Neem extracts on
Aphis nerii
behavior and papaya ringspot
virus transmission
The effect of neem extracts on feeding behavior of
Aphis nerii
, as well as
Papaya Ringspot Virus (PRSV-p) transmission, was determined. We evalu-
ated papaya seedlings sprayed under laboratory conditions with a 10%
aqueous extract of unpeeled neem seed and with a water control. Two time
1
Manuscrito sometido a la junta editorial el 12 de junio de 2003.
2
Financiado por el CONACYT-México: G33672-B. Se agradece a Alberto Pantoja,
UPR, y Juan Cibrián-Tovar, C.P., por revisar el manuscrito.
3
Campus Veracruz, Colegio de Postgraduados, Apdo. Postal 421, C.P. 91700, Veracruz,
Ver., México. Tel. (52) (229) 934-9485. Fax: (52) (229) 934-9100.
4
Resp. publicación. javj@colpos.mx.
5
Fac. C. Biol. y Agropec., U. Veracruzana, Córdoba, Ver., México. darola@correoweb.com.
6
Fac. Estadística e Informática, U. Veracruzana, Apdo. Postal 475, Xalapa, Ver., México.
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ET
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EXTRACTOS
DE
NEEM
periods, exploratory (0 to 3 min) and feeding (>3 to 20 min), were used to
evaluate aphid feeding behavior. Aphid mortality was determined 24 h after
spraying. Viral transmission was measured by ELISA tests. No significant
differences (p > 0.05) were obtained in the exploratory feeding behavior.
However, significantly more aphids (p < 0.05) stopped feeding on neem-
sprayed plants from the >3 to 20 min period. Also, higher (p < 0.05) aphid
mortality (37% vs. 10%) was found in neem-sprayed plants. However, no sig-
nificant differences (p > 0.05) were found in PRSV-p transmission, thus indi-
cating that neem seed aqueous extracts did not prevent viral transmission.
Key words:
Azadirachta indica
, viral transmission, PRSV-p, non-persistent
virus
INTRODUCCIÓN
En México se cultivan 20,780 ha de papayo, de las cuales aproxima-
damente 6,000 ha se siembran en el Estado de Veracruz (INEGI-CP,
1998). El principal limitante del cultivo en este país es la enfermedad
producida por el virus de la mancha anular del papayo (PRSV-p), que
ocasiona pérdidas que van desde un 10% y pueden alcanzar el 100% si
los ataques son en los primeros meses de crecimiento vegetativo (De
León y Becerra, 1991). La enfermedad se puede localizar en todas las
zonas agrícolas donde se produce papayo en México y en varios países
tropicales de América. Esta enfermedad viral limita la productividad y
longevidad del cultivo, que ha pasado de un sistema productivo multi-
anual a uno anual, con los consecuentes incrementos en costos de
producción y riesgo de pérdidas (De los Santos et al., 2000). El PRSV-p
es transmitido de manera no persistente por varias especies de áfidos
(Homoptera: Aphididae), como
Myzus persicae
Sulzer,
Aphis gossypii
Glover,
A. fabae
Scopoli,
A. spiraecola
Patch,
A. nerii
Boyer de Fonsco-
lombe, y
Macrosiphum euphorbiae
(Thomas) (García et al., 1988). En
Veracruz se han reportado a
Aphis gossypii
y
A. nerii
en relaciones epi-
demiológicas significativas con la mancha anular del papayo (Mora et
al., 1992; GIP, 1995). Ambas especies presentan alta eficiencia de trans-
misión del PRSV-p, siendo en el caso de
A. nerii
de 83 a 88% (Célis et
al., 2002; García et al., 1988; Villanueva y Villanueva-Jiménez, 1994;
Mora et al., 1992).
Desde 1990, el Grupo Interdisciplinario de Papayo (GIP), del Colegio
de Postgraduados en Ciencias Agrícolas en México, ha venido desarro-
llando una estrategia de manejo integrado del cultivo de papayo (MIP)
con énfasis en esta enfermedad viral. El GIP investiga tácticas de
manejo novedosas o ampliamente probadas, que al integrarse retrasen
la incidencia y disminuyan la severidad de la enfermedad, con aumen-
tos en la producción y productividad del cultivo (GIP, 1992; 1995).
Algunas de las prácticas validadas incluyen la protección del semillero
con una malla antiáfido o de polipropileno, mayores densidades de
siembra (2,800 plantas por hectárea), eliminación de plantas con
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síntomas iniciales del PRSV-p hasta el inicio de la fructificación, es-
tablecimiento de barreras que limpian el estilete del áfido vector [con
maíz—
Zea mays
(L.), y jamaica o sorrel—
Hibiscus
sabdariffa
L.), apli-
cación de emulsiones de aceite mineral (citrolina) al 1.8% para el mismo
fin, así como una adecuada fertilización y control de malezas para man-
tener la sanidad y nutrición óptima del cultivo (GIP, 1992, 1995).
Entre las tácticas de manejo ensayadas, tanto en investigación como
por algunos productores, el uso de plaguicidas disponibles de manera
comercial no ha logrado el control eficiente de la enfermedad viral a
través de afectar a sus vectores (De los Santos et al., 2000). La investi-
gación en el área de viricidas aún se encuentra en etapa de investigación
básica para humanos (Ooi et al., 2004; Armaka et al., 1999), por lo que
no se espera contar con viricidas agrícolas de manera comercial en los
próximos años. Sin embargo, la búsqueda de nuevas moléculas insecti-
cidas para el manejo de vectores sigue siendo atractiva, debido a su
facilidad de aplicación e implicaciones comerciales para usuarios y fabri-
cantes potenciales. Además, la tendencia actual es hacia la sustitución
de los productos organo-sintéticos en la agricultura por aquellos de ori-
gen natural (Boeke et al., 2004; George et al., 2000). En 1998, el GIP
consideró necesario explorar la aplicación de algún insecticida botánico
para el posible manejo del complejo de vectores en campo dentro del
manejo integrado del papayo en Veracruz, México (Pérez et al., 2000). Se
seleccionó al neem (
Azadirachta indica
A. Juss.) por tener efectos repe-
lentes y antialimentarios contra áfidos y, en general, por regular la
fecundidad y la oviposición de insectos (Holmes y Hassan, 1996). Brech-
elt y Fernández (1995) reportan que al realizar aplicaciones de extractos
acuosos de neem al 5% lograron controlar a
A. gossypii
,
Lypaphis ery-
simi
(Kaltenbach),
Brevicoryne brassicae
(L.) y
Aphis (op. cit.)
maidis
(Fitch) en los cultivos de chile (
Capsicum annuum
L.), sandía (
Citrullus
vulgaris
Schrad.), pepino (
Cucurbita pepo
L.), coliflor (
Brassica
spp.) y
maíz [
Zea mays
(L.)] en la República Dominicana.
En Veracruz, México, Pérez et al. (2000) evaluaron en el campo ex-
tractos acuosos de semilla escarificada de neem al 2.5% y 5%, y un
testigo en el cultivo de papayo bajo la propuesta MIP. Los resultados no
mostraron diferencias significativas en la disminución de la incidencia
de la enfermedad. Este trabajo creó varias interrogantes en cuanto al
potencial del neem como repelente de la alimentación de áfidos vec-
tores, como aficida y como agente preventivo de la infección del PRSV-
p. Estas interrogantes requerían contestarse con estudios de laborato-
rio, por lo que se decidió utilizar una especie vectora de importancia,
como
Aphis nerii
(Mora et al., 1992), que sirviera de modelo para re-
visar el efecto en laboratorio de este producto natural en la
interferencia de la relación virus-vector.
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EXTRACTOS
DE
NEEM
Este trabajo tuvo como objetivo evaluar en el laboratorio el efecto de
los residuos de semillas de neem, aplicados a plantas de papayo, sobre
el comportamiento de alimentación de
Aphis nerii
. Además, se estudió
su relación con la transmisión del PRSV-p.
MATERIALES Y MÉTODOS
El presente estudio se realizó en el laboratorio de Protección de Agro-
ecosistemas del Campus Veracruz, Colegio de Postgraduados. Se
utilizaron hembras partenogenéticas adultas ápteras de
Aphis nerii
, cria-
das en jaulas entomológicas sobre plantas provenientes de semillas de su
hospedera silvestre, asclepia (
Asclepias curassavica
L.). La cría del áfido
se realizó en un invernadero rústico a temperatura ambiente, con prome-
dio anual de 27.8°C, humedad relativa entre 60 y 100%, y un régimen de
fotoperiodo natural entre 10 y 14 h de luz. Se sembraron semanalmente
semillas de papayo cv. Maradol roja en vasos térmicos de unicel de 150 ml,
durante los meses de agosto, septiembre y octubre de 1999.
El experimento se dividió en dos etapas, en la primera se observó el
comportamiento y la mortalidad de los áfidos, y en la segunda se evaluó
la transmisión del PRSV-p; en ambos casos con la presencia del trata-
miento de residuos frescos de extractos acuosos de neem.
Tratamientos.
Se evaluaron como tratamiento: a) el extracto
acuoso (10%) de semilla de neem sin escarificar, y b) plantas asperjadas
con agua potable, como testigo. La solución del extracto acuoso se
preparó 24 h antes de la aplicación, y se dejó bajo sombra a tempera-
tura ambiental hasta su aplicación. Se utilizaron 25 g de semilla de
neem con cáscara en 250 ml de agua para obtener una concentración de
extracto acuoso al 10%, equivalente a 5% de semilla escarificada. Cada
aplicación a las plantas se realizó una hora antes de iniciar las obser-
vaciones. Se emuló una aspersión comercial mediante un atomizador
manual, aplicando cinco veces a la planta hasta el punto de goteo, por
el haz y el envés de todas las hojas. El tratamiento testigo fue asperjado
de igual forma con agua. Se utilizaron plantas de papayo con 12 hasta
15 hojas verdaderas.
Comportamiento de
Aphis nerii
a los extractos acuosos de semillas de neem
Se seleccionaron suficientes áfidos adultos ápteros de la colonia ali-
mentada con asclepia, y se pasaron a una placa petri para un periodo
de ayuno de dos horas. Posteriormente se seleccionaron tres áfidos, los
cuales fueron transferidos mediante un pincel a cada una de las plan-
tas de papayo asperjadas con cada uno de los tratamientos. Estos
insectos se observaron detenidamente por un periodo total de 20 min,
a fin de determinar la reacción de comportamiento de los áfidos que se
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describe más adelante. Posteriormente, los adultos se confinaron en la
planta por 24 h dentro de tubos de acrílico transparente de 16 cm de
diámetro y 40 cm de altura, sellados con malla de tela. Al final del pe-
riodo de 24 h, se registró la mortalidad de los áfidos en ambos
tratamientos. Cada prueba se repitió 39 veces para cada tratamiento,
con tres áfidos por planta cada uno.
El periodo de 20 min de observación del comportamiento se dividió
en dos fases: la exploratoria que duró los primeros 3 min (0 hasta 3
min), y la de alimentación que consumió el resto del periodo de obser-
vación (>3 hasta 20 min). La primera fase se designó como exploratoria
debido a que los áfidos son chupadores, y al posarse sobre una planta
primero realizan inserciones de su estilete de corta duración; las pica-
duras de prueba pueden, en ciertos casos, conducir al insecto a aceptar
o rechazar la planta (Acosta, 1989). En la etapa exploratoria es cuando
se realiza la mayor proporción de transmisiones de virus no persis-
tentes (Urias-M. y Alejandre-A., 1999). Esta etapa se dividió en cuatro
criterios de comportamiento basados en observaciones preliminares:
Exploratorio sin alimentarse
(ESA), cuando durante los primeros tres
minutos el insecto exploraba la planta pero no realizaba ningún intento
de probado;
Exploratorio arrastrando el estilete
(EAE), cuando el in-
secto hizo movimientos táctiles con el estilete sobre la superficie de la
hoja, sin llegar a insertarlo;
Exploratorio interrumpido
(EI), cuando el
insecto hizo movimientos de exploración sobre la hoja, insertando
brevemente el estilete en varias ocasiones, sin establecerse en algún si-
tio para su alimentación; y
Alimentación durante los tres minutos
iniciales
(A3), cuando insertó el estilete desde el inicio de la prueba y
durante los tres minutos de la fase exploratoria.
La segunda fase se denominó de alimentación, ya que durante este
tiempo el áfido decide utilizar la planta para su alimentación. Esta
etapa se dividió en tres criterios de comportamiento basados en obser-
vaciones preliminares:
Alimentación definitiva
(A20), cuando el áfido
permaneció con el estilete dentro de la planta entre el minuto 3 y el
minuto 20 de la prueba;
Alimentación interrumpida durante la prueba
(AIDP), cuando el insecto insertó el estilete para alimentarse, pero dejó
de hacerlo pasado algún tiempo; y Sin alimentarse (SA), cuando el in-
secto no hizo el menor intento de alimentarse durante la segunda fase.
Prueba de la transmisión del PRSV-p
La cría de áfidos, el periodo de ayuno de los áfidos y la aspersión de
los tratamientos se realizaron de la misma manera que para la prueba
de comportamiento. Para realizar la prueba de transmisión se obtuvie-
ron plantas de papayo con síntomas característicos del PRSV-p, que
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dieron positivas en una prueba de inmunoabsorbancia con enzimas
conjugadas (ELISA) con un kit para PRSV-p (AGDIA, Inc., USA)
7
.
Para esta prueba se utilizaron 70 plantas de papayo, 35 para el
tratamiento de neem y 35 para el testigo. La prueba de transmisión del
virus se realizó con 10 áfidos por planta. Los áfidos ayunados se pasa-
ron con un pincel a las hojas de papayo enfermas, de dos a cinco meses
de edad, permitiendo un tiempo estimado de alimentación suficiente
para la adquisición del virus, de 35 hasta 55 segundos. Luego los insec-
tos se pasaron a plantas sanas de dos meses de edad, asperjadas con los
tratamientos, donde se confinaron por 24 h (tiempo de inoculación).
A las 24 h los insectos supervivientes se removieron con un pincel.
Las plantas inoculadas se confinaron en jaulas entomológicas de PVC
(altura 0.8 m, profundidad 0.8 y ancho 1.0 m) cubiertas con tela de
organdí, y se observaron al término de 60 días para determinar la
presencia de síntomas virales. Además, al final de este periodo se rea-
lizó una prueba de ELISA para determinar la presencia del virus en
cada una de las plantas inoculadas; para ello se seleccionó la tercera
hoja de cada planta. Las hojas seleccionadas se etiquetaron y se coloca-
ron en bolsas de plástico selladas individualmente, posteriormente se
colocaron en un termo con hielo gel azul para mantenerlas frescas hasta
su análisis al día siguiente. Para la prueba de ELISA (Téliz y Mora,
1986) se utilizó un kit con antisuero de PRSV-p (AGDIA, Inc., USA).
Análisis de resultados
Los resultados del ensayo de comportamiento y los de la prueba de
ELISA se analizaron mediante χ
2
para homogeneidad de los tratamien-
tos, considerando los datos de frecuencias (Ramírez y López, 1993).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Comportamiento de Aphis nerii a residuos de neem
La Figura 1 muestra el porcentaje de áfidos que respondieron a cada
uno de los criterios en las dos fases de comportamiento evaluadas.
Gráficamente, para el tratamiento con neem al 10%, tanto el compor-
tamiento Exploratorio sin alimentarse (ESA) como el Exploratorio
arrastrando el estilete (EAE) obtuvieron los valores porcentuales más
altos, a diferencia del Exploratorio interrumpido (EI) y el de Alimenta-
ción durante los tres minutos iniciales (A3); los mayores porcentajes
correspondieron al tratamiento testigo. Sin embargo, la prueba no
7
Las marcas registradas sólo se usan para proveer información específica y su uso no
constituye garantía ni endoso sobre otros productos o equipo que no se mencionan.
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paramétrica para la fase de comportamiento de 0 a 3 min, en sus cuatro
criterios de comportamiento, no presenta diferencias significativas (p >
0.05), por lo tanto, el comportamiento en esta primera fase se considera
independiente del tratamiento aplicado.
En un ensayo en el campo con papayo Maradol roja, Pérez et al.
(2000) no encontraron disminución de la incidencia de la enfermedad
después de aplicar extractos acuosos de semilla con cáscara de neem al
2.5% y 5%. Estos resultados sugieren que a pesar de la aplicación del
extracto acuoso (desde 2.5 hasta 10%, en campo o laboratorio), es proba-
ble que los áfidos inserten el estilete en el probado inicial el tiempo
suficiente para permitir la transmisión del virus. La transmisión del
PRSV-p es no persistente, lo que ayuda a explicar la inefectividad de los
extractos acuosos de semilla de neem para evitar que los áfidos piquen
y reduzcan la incidencia viral.
El comportamiento de los áfidos en la segunda fase de observación
es diferente, ya que tanto los porcentajes del comportamiento de
Alimentación definitiva (A20) a los 20 min y los de Alimentación
interrumpida durante la prueba (AIDP) fueron significativamente
mayores (p < 0.05) en el testigo; así como el porcentaje del compor-
tamiento Sin alimentarse (SA) fue más alto en el tratamiento aplicado
con neem 10%. Estos resultados indican que en la etapa de alimenta-
FIGURA 1. Efecto de residuos acuosos de neem, asperjados en plantas de papayo, en
el comportamiento de alimentación de áfidos ápteros (Aphis nerii), durante dos fases de
observación, y mortalidad de los áfidos a las 24 h. Fase Exploratoria (0 a 3 min): ESA =
Exploratorio sin alimentarse, EAE = Exploratorio arrastrando el estilete, EI = Explorato-
rio interrumpido, A3 = Alimentación durante los tres minutos iniciales. Fase de
A
limentación (>3 a 20 min): A20 = Alimentación definitiva, AIDP = Alimentación inte-
rrumpida durante la prueba, SA = Sin alimentarse (mayor explicación en materiales y
métodos). Cada tratamiento con 39 repeticiones, tres áfidos adultos ápteros por repetición.
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ción posterior a los tres primeros minutos, el comportamiento es
dependiente del tratamiento aplicado; la aplicación del neem ocasiona
una reacción de repelencia en la alimentación de los áfidos.
Estos resultados podrían ser prometedores en cultivos donde los áfi-
dos colonizan al cultivo, o para enfermedades virales de tipo persistente
o semipersistente, ya que el neem podría disminuir la actividad de ali-
mentación sobre el hospedero en periodos de tiempo mayores a tres
minutos (Brechelt y Fernández, 1995). Sin embargo, éste no es el caso
en el cultivo de papayo, ya que los áfidos no colonizan y el virus es no
persistente, por lo que el neem no reduce la incidencia del PRSV-p.
Además, se observó un porcentaje significativamente mayor (p <
0.05) de áfidos muertos (37%) en el tratamiento con neem al 10%, com-
parado con el porcentaje de áfidos muertos observado en el testigo
(10%). Se puede inferir, por lo tanto, que la aplicación de neem incre-
menta la mortalidad de los áfidos. Holmes y Hassan (1996) evaluaron
extractos acuosos al 18% de semilla de neem en rosales para controlar
a M. persicae, y observaron un control total a las 24 h después de apli-
cado el producto. Schumutter (1990) menciona que, bajo condiciones de
laboratorio, altas concentraciones de extractos de semilla de neem,
aplicados sobre Vicia faba, causan mortalidad en Acyrtosiphon pisum y
en A. fabae. Además, el neem afecta el desarrollo y fecundidad de estos
homópteros. A pesar de haber obtenido mortalidad de áfidos en las
pruebas de laboratorio con papayo, no es posible asegurar la inhibición
de la transmisión del PRSV-p, además de ser el papayo una planta que
estos insectos no colonizan.
Prueba de transmisión viral
Los resultados obtenidos en la prueba de ELISA se muestran en la
Figura 2. El análisis estadístico indicó que no existen diferencias sig-
nificativas (p > 0.05) en la transmisión del PRSV-p entre los
tratamientos evaluados.
En la prueba de comportamiento de alimentación de A. nerii se ob-
servó que, a pesar de la aplicación del extracto acuoso de semillas de
neem al 10%, los áfidos realizaron el probado inicial de las hojas de pa-
payo, por lo que es posible que al llevar el virus en su estilete la
transmisión del PRSV-p no se haya prevenido. Estos resultados corro-
boran lo encontrado por Pérez et al. (2000), quienes no encontraron
diferencias estadísticas en cuanto a la incidencia y severidad del PRSV-
p con las dosis de extractos acuosos de semillas de neem evaluadas en
el campo. Lo anterior también se confirma con la ausencia de diferen-
cias en el probado inicial de A. nerii sobre plantas de papayo con y sin
residuos de neem en este ensayo (Figura 1).
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Los extractos acuosos al 10% de semillas de neem con cáscara aplica-
dos sobre plantas de papayo no disminuyen la transmisión del virus de
la mancha anular de papayo, ya que la transmisión de este virus es del
tipo no persistente y basta unos segundos para que la infección ocurra.
Sin embargo, los extractos de neem al 10% sí influyen en el compor-
tamiento de alimentación del áfido en tiempos de tres hasta 20 min.
Inclusive, los extractos acuosos ocasionan una mortalidad significativa
de áfidos a las 24 h. Esta respuesta a los extractos acuosos puede ser de
utilidad en la prevención de la transmisión de virus semipersistentes o
persistentes, o en el control del áfido como plaga directa en otros cultivos.
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FIGURA 2. Plantas de papayo detectadas con reacción positiva y negativa al virus
PRSV-p en pruebas de ELISA, luego de ser asperjadas con extractos acuosos de neem, y
posteriormente sometidas a la transmisión del virus por el áfido vector Aphis nerii.
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