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244
Italus Hortus 16 (2), 2009: 244-248
Sistemi di controllo della qualità del materiale micropropagato nella
varietà commerciale Elide di Gerbera jamesonii
Luca Pipino1*, Enrico Francia2, Nicola Pecchioni2, Caccia Riccardo3, Monica Miriana Albani3e
Annalisa Giovannini1
¹CRA - FSO, Corso Inglesi 508, 18038 Sanremo (IM)
²Dipartimento di Scienze Agrarie e degli Alimenti, Università di Modena e Reggio Emilia, via
Amendola 2, 42100 Reggio Emilia
³Albani Vincenzo e Ruggieri Italina s.s.a., via Fontanatetta 158, 00053 Civitavecchia (Roma)
Quality control in micropropagated
Gerbera jamesonii
, Elide commer-
cial cultivar
Abstract. The methylation status of the genomic
DNA was investigated in the experimental test consti-
tuted by the two phenotypes of the commercial variety
Elide®, the “wild type” and “bushy”, in vitro propagat-
ed. The onset of the bushy phenotype was reduced
when Elide was cultured in the media added with the
fungicide Imazalil. The genomic DNA digestion with
10 different methylation-sensitive enzymes showed,
for both phenotypes, a low GC content and a high
level of methylation. The Methylation-Sensitive
Amplification Polymorphism (MSAP) technique, mak-
ing use of fluorescent primers, has been applied for
the first time in Gerbera jamesonii. Different polymor-
phic bands were obtained, showing different methyla-
tion sites in all phenotypic conditions observed.
Key words: MSAP, methylation, Imazalil.
Introduzione
Nell’anno 1732 l’Imperatrice Anna di Russia inca-
ricò il botanico tedesco Traug Gerber di collezionare
piante rare della Siberia; il sig. Gerber battezzò quindi
la gerbera con il suo nome. Le piante, distribuite in
circa 80 specie, sono spontanee dell’Africa del Sud e
dell’Asia, si trovano anche nel Nord della Cina e della
Siberia, nelle Indie fino al Nepal (Calvino, 1992). Le
gerbere oggi coltivate (G. jamesonii Bolus) derivano
dagli altipiani del Transvaal (Sud Africa), importate
in Europa dal commerciante coltivatore di piante
Jameson. Il botanico Dalton Hooker descrisse per la
prima volta esattamente la pianta e gli dette il nome di
Gerbera jamesonii. Gli ibridi attualmente coltivati
derivano da un lungo lavoro di miglioramento geneti-
co, iniziato verso la fine del secolo scorso, da un
incrocio con la G. viridifolia ad opera del capo giardi-
niere del giardino botanico di Cambridge (Pacini,
1975). L’industria della micropropagazione commer-
ciale delle piante ornamentali ha come obiettivo la
rapida propagazione clonale delle ultime varietà otte-
nute. L’omogeneità genetica del materiale propagato è
una caratteristica qualitativa per la commercializza-
zione delle piante. Le condizioni della coltura in vitro
(stress biotici ed abiotici) possono indurre variabilità
indesiderata (variabilità somaclonale) a carico di
caratteri cariotipici, morfo-agronomici e molecolari
(Karp, 2000). La micropropagazione della Gerbera
jamesonii presenta un ben noto problema di percen-
tuali di accestimento eccessivamente alte, a scapito
della qualità dei germogli stessi sviluppati. Tali ger-
mogli infatti presentano un fenotipo visibilmente alte-
rato, denominato bushy (Topoonyanont, 1999). Il
fenotipo “wild type” (wt) ha generalmente un asse
composto da 7-8 foglie in sequenza regolare e con fil-
lotassi a spirale. Nel fenotipo bushy, si formano più
apici allineati sul bordo di un fusto, che è collassato in
una sorta di corona priva della fillotassi a spirale. Il
meristema apicale infatti perde la propria dominanza
favorendo lo sviluppo dei meristemi ascellari che cre-
scono quasi simultaneamente ad esso, creando quindi
una pianta notevolmente accestita (Debergh et al.,
2000). Inoltre, sono state riscontrate anomalie anche a
carico della forma del fiore, con relativa perdita della
conformità clonale. I germogli con fenotipo bushy tra-
smettono nelle successive sub-colture lo stesso fenoti-
po ai germogli che generano, andando così ad aumen-
tare progressivamente la percentuale di germogli non
adatti alla successiva fase di acclimatazione. Tuttavia,
aggiungendo ai mezzi di coltura in vitro fungicidi a
base di imidazolo (quali ad esempio Imazalil), indu-
centi diverse alterazioni dei fenotipi (Werbrouck e
Debergh, 1995; 1996), è stata ridotta l’insorgenza del
fenotipo bushy (Topoonyanont, 2001). La variazione
indotta dalle colture in vitro può essere studiata con
descrittori fenotipici e genetici.
Le tecniche molecolari si distinguono principal-
mente in base al tipo di sequenze e regioni del DNA
*luca.pipino@yahoo.it
Innovazione in micropropagazione - sessione orale
245
analizzate (RAPD, SSR AFLP, microsatelliti, traspo-
soni e retro-transposoni, etc). Inoltre, i marcatori
molecolari consentono di caratterizzare direttamente il
genotipo (ovvero non vengono influenzati dall’am-
biente), permettendo così di individuare polimorfismi
specifici e variazioni ereditabili (in grado di superare
il filtro meiotico) e non. L’applicazione di queste tec-
niche molecolari nel campo della micropropagazione
può essere un valido strumento per l’identificazione
delle eventuali modificazioni indotte a livello del
genoma da un sistema di coltura in vitro, che come
atteso, influenzeranno la morfologia e la fisiologia
(fioritura) delle piante micropropagate. I pattern di
metilazione del DNA avvengono tipicamente in regio-
ni ricche di basi CG (le cosiddette “CpG island”),
sono ereditabili, tessuto specifici e correlano con l’e-
spressione genica. Conseguentemente, la metilazione
CpG è stata postulata avere un ruolo nella differenzia-
zione e nell’espressione genica. Si può qui citare ad
esempio la modificazione fenotipica definita mantled,
osservata nelle piante di palma da olio micropropaga-
te, che è stata associata ad una ipometilazione del
DNA genomico totale (Jaligot et al., 2000, Matthes et
al., 2001).
Il lavoro svolto ha esaminato la variabilità indotta
dalle colture in vitro utilizzate per la moltiplicazione
massale di nuove varietà di gerbera. Si è scelto di
valutare lo stato di metilazione dei siti ‘CCGG’ del
DNA genomico totale, in un sistema sperimentale
costituito da un unico genotipo, la varietà commercia-
le Elide®manifestante il fenotipo wt e quello bushy,
micropropagati in due diversi terreni di coltura (con e
senza il fungicida Imazalil).
Materiali e metodi
Per l’esperimento è stato allestito un sistema di
micropropagazione di Gerbera jamesonii varietà Elide
(ditta Albani Vincenzo e Ruggieri Italina s.s.a.) su ter-
reno di coltura GM costituito da: Sali MS modif. Van
Der Salm (1994), vitamine MS, saccarosio 30 g l-1,
Kinetina 3 mg l-1, Acido Indol Acetico 0,1 mg l-1, pH
5,6, agar 8 g l-1. Il terreno GM + IMA prevedeva l’ag-
giunta di Imazalil (IMA) 25 µM al terreno GM. Le
microtalee sono state moltiplicate in vasi di vetro di 9
cm di diametro e mantenute in camera di crescita alla
temperatura di 24°C, con fotoperiodo 16 ore luce. Il
numero di germogli neoformati wt o bushy, dopo 30 e
60 giorni di coltura rispettivamente, è stato calcolato
utilizzando 5 repliche da 8 espianti ciascuna. L’analisi
statistica è stata effettuata tramite il test t per 2 cam-
pioni accoppiati per medie. Per una prima analisi del
DNA genomico di germogli interi wt e bushy, tramite
digestione con enzimi di restrizione (tab. 1) sensibili
alla presenza di gruppi metile (CH3) legati alle basi
nucleotidiche, è stato utilizzato il protocollo di estra-
zione da tessuti vegetali mini-DNAeasy Plant Kit
(Qiagen). Il DNA è stato digerito seguendo le istru-
zioni previste per ogni enzima di restrizione utilizzato
e visualizzato su gel di agarosio all’1%. Per la succes-
siva analisi di sensibilità alla metilazione (MSAP) il
DNA genomico totale è stato estratto dai germogli
micropropagati seguendo il protocollo CTAB di Stein
et al. (2001). Il DNA è stato valutato qualitativamente
mediante corsa elettroforetica su gel di agarosio allo
0,8% e colorato con etidio bromuro e, quantitativa-
mente, utilizzando il sistema Nanodrop ND-1000
(Thermo Scientific). I tre campioni biologici esamina-
ti sono stati: fenotipo bushy coltivato per 60 giorni sul
terreno GM; fenotipo wt coltivato per 60 giorni sul
terreno GM; fenotipo bushy coltivato per 60 giorni sul
terreno GM + IMA. L’analisi di ogni campione di
Elide è stata condotta su due repliche biologiche. I
fenotipi in studio sono stati analizzati con la tecnica
Methylation-sensitive amplification polymorphism
assay (MSAP), modificando il protocollo utilizzato da
Portis et al. (2004). MSAP è una tecnica AFLP basata
sull’uso degli isoschizomeri HpaII e MspI come “fre-
quent cutter” (che differiscono per la sensibilità alla
metilazione nella loro sequenza di riconoscimento sul
DNA genomico), mentre l’enzima “rare-cutter”
EcoRI è lo stesso rispetto ad altri protocolli AFLP
standard. Le due combinazioni di enzimi di restrizio-
ne utilizzate sono state: EcoRI/HpaII, EcoRI/MspI.
Gli isoschizomeri HpaII e MspI riconoscono entrambi
la sequenza tetranucleotidica 5’-CCGG-3’, ma la loro
MluI
DraI
BamH
BglII
KpnI
PstI
ClaI
EcoRI
PvuII
SalI
Non taglia quando CpG sono metilati
Tagli infrequenti per un’elevata concentrazione in GC
Taglia se residuo 5’C è 5metilcitosina
Taglia quando residuo 3’A è N6metiladenina
Non taglia quando residuo 3’C è 5metilcitosina
Non taglia quando A o residuo 3’C è N6metiladenina o
5metilcitosina
Non taglia quando 3’A o residuo C è N6metiladenina o
5metilcitosina
Non taglia quando residuo 3’A o C è N6metiladenina o
5metilcitosina
Non taglia quando residuo 3’C è 4 o 5metilcitosina
Non taglia se A o 5’C residuo sono N6metiladenina o
5metilcitosina
Enzima Attività
Tab. 1 - Enzimi di restrizione utilizzati per digerire il DNA
genomico totale dei fenotipi bushy e wt della varietà Elide.
Tab. 1 - List of restriction enzymes used for digesting total
genomic DNA from bushy and wt cultivar Elide phenotypes.
246
Pipino et al.
attività è influenzata dallo stato di metilazione dei
residui di citosina esterni o interni: HpaII è attivo
esclusivamente sulle sequenze 5’-CCGG-3’ emimeti-
late, mentre MspI taglia le sequenze 5’-CmCGG-3’
sia emi- che completamente metilate, ma non le
sequenze 5’-mCCGG-3’. I campioni sono stati digeriti
con le due diverse combinazioni di enzimi utilizzan-
do: 125 ng µl-1 di DNA genomico, buffer (10x)
“Tango™” (Fermentas), EcoRI (10U µl-1), MspI o
HpaII (10U µl-1) in un volume finale di reazione di 25
µl. L’incubazione è avvenuta a 37°C per 4 h, e suc-
cessivamente a 70°C per 15 min. Ai frammenti digeri-
ti da entrambe le combinazioni sono stati legati gli
adattatori per EcoRI e MspI o HpaII (tab. 2), incuban-
do a 20°C per 2 h una miscela di reazione composta
da: 24 µl di DNA genomico digerito precedentemen-
te, 5 µl buffer T4 ligasi, 1 µl adattatore EcoRI (2 µM),
1 µl adattatore MspI o HpaII (20 µM), 1 µl T4 DNA
ligasi (5 U µl-1), portando ad un volume finale di 50
µl con acqua. Il prodotto di ligazione è stato diluito
1:10 v/v in TE 0.1x (TrisHCl-EDTA, pH 8,0). La pre-
amplificazione è stata effettuata utilizzando una
miscela di reazione composta da: 5 µl di DNA ligato e
diluito, 5 µl di buffer (5x), 1,5 µl di MgCl2(25 mM),
0,6 µl dNTP (10 mM), 1 µl primer “E0” (10 µM), 1 µl
primer “HM0” (10 µM), 0,2 µl DNA taq polimerasi
(5 U µl-1; Fermentas), portando ad un volume finale di
25 µl con acqua. La reazione di PCR utilizzata è com-
posta da 35 cicli a 94°C per 30 sec, 56°C per 1 min e
72°C per 1 min, seguiti da 72°C per 10 min. Il prodot-
to finale è stato poi diluito 1:20 v/v in TE 0.1x. La
PCR selettiva è stata eseguita effettuando 10 cicli di
94°C per 1 min, 1 min di “annealing”, e 72°C per 1
min e 30 sec. La fase di “annealing” è iniziata a 65°C
ed è stata ridotta di 1°C per ogni ciclo fino a 56°C, e
mantenuta per i successivi 23 cicli a tale temperatura.
Al termine del ciclo 33, la temperatura è stata mante-
nuta a 72°C per 10 min. La miscela di reazione era
composta da: 5 µl di DNA pre-amplificato, 4 µl di
buffer (5x), 1,2 µl di MgCl2(25 mM), 0,4 µl dNTP
(10 mM), 0,2 µl DNA taq polimerasi (5 U µl-1;
Fermentas). Per la colorazione con tecnica “Silver
staining” sono stati aggiunti 0,6 µl di primers selettivi
(10 µM), mentre per la marcatura fluorescente è stato
aggiunto 1 µl di primer selettivo “E” (5 µM) e 1 µl di
primer selettivo marcato in fluorescenza “HM” (1
µM). Il volume finale di entrambe le reazioni è stato
di 25 µl, con aggiunta di acqua. La corsa elettroforeti-
ca per la determinazione dei polimorfismi con la tec-
nica del “Silver Staining” è stata effettuata secondo il
protocollo utilizzato da Portis et al. (2004).
I prodotti di amplificazione ottenuti con primers
marcati in fluorescenza, miscelati allo standard di
peso molecolare GS-500 Rox, sono stati separati con
lo strumento AB Genetic Analyzer 3130 XL, ed ana-
lizzati con il software GeneMapper (di AB). Tutti i
profili di corsa ottenuti sono comunque stati sottopo-
sti a verifica visiva. Sono state fatte le conte di tutti i
polimorfismi osservati e determinate le bande indica-
tive dello stato di emi o completa metilazione del
DNA, in tutti i confronti fatti (ovvero wt vs. bushy,
bushy + Imazalil vs. wt e bushy vs. bushy + Imazalil).
Risultati e discussione
Il sistema sperimentale costituito dalla varietà
commerciale di gerbera Elide propagata in vitro ha
permesso di studiare la modificazione fenotipica defi-
nita bushy. I risultati hanno evidenziato lo sviluppo di
un numero di germogli wt statisticamente superiore
rispetto a quelli bushy, in piante micropropagate sul
terreno arricchito con IMA a 30 e 60 giorni di coltura.
I risultati scaturiti dall’analisi condotta con 10 enzimi
di restrizione sensibili alla metilazione indicano un
basso contenuto in GC ed un elevato livello di metila-
zione del DNA genomico per entrambi i tipi di ger-
moglio (in particolare per quanto riguarda la 5-metil-
citosina), anche se quest’ultima è stata parzialmente
maggiore per i germogli bushy, in particolare per le
adenine in posizione 5’. Nessuna differenza è stata
individuata tra i germogli bushy in vitro e gli stessi
EcoRI adattatore 1
EcoRI adattatore 2
E0*
E1
E2
E3
E4
HpaII/MspI adattatore 1
HpaII/MspI adattatore 2
HM0*
HM1
HM2
HM3
HM4**
HM5**
Adattatori/Primers
5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’
5’-AATTGGTACGCAGTCTAC-3’
5’-GACTGCGTACCAATTCA-3’
5’-GACTGCGTACCAATTCAAC-3’
5’-GACTGCGTACCAATTCACG-3’
5’-GACTGCGTACCAATTCACT-3’
5’-GACTGCGTACCAATTCAGT-3’
5’-GATCATGAGTCCTGCT-3’
5’-CGAGCAGGACTCATGA-3’
5’-ATCATGAGTCCTGCTCGGT-3’
5’-ATCATGAGTCCTGCTCGGTAA-3’
5’-ATCATGAGTCCTGCTCGGTCC-3’
5’-ATCATGAGTCCTGCTCGGTTC-3’
5’-ATCATGAGTCCTGCTCGGTAG-3’
5’-ATCATGAGTCCTGCTCGGTCA-3’
Sequenza
Tab. 2 - Adattatori e primers utilizzati con la pre-amplificazione e
l’amplificazione selettiva per MSAP. Ogni primer “E” è stato
utilizzato in combinazione con tutti i primers “HM”.
Tab. 2 - Adapters and primer combinations used for pre- and
selective MSAP amplification in Gerbera jamesonii. Each “E”
primer was used in combination with all the other “HM” primers.
* utilizzato per PCR di pre-amplificazione
** non utilizzato per PCR selettiva con colorazione con la tecnica
del Silver staining
Innovazione in micropropagazione - sessione orale
247
dopo acclimatazione in serra, sottolineando che lo stato
di metilazione rimane inalterato anche dopo diverse
subculture e dopo 5 mesi di coltura in vivo. La determi-
nazione dei polimorfismi con la tecnica del “Silver stai-
ning” è risultata difficoltosa e quindi abbiamo deciso di
non processare le bande ottenute nei gel di poliacrilami-
de, ma di utilizzare i primers fluorescenti. In totale sono
stati ottenuti 1038 profili MSAP differentemente meti-
lati. Grazie alla precisione nel dimensionamento ed alla
sensibilità dello strumento AB3730-xl è stato possibile
quantificare le differenze nei confronti fra le tre condi-
zioni fenotipiche di Elide (wt vs. bushy , bushy +
Imazalil vs. wt e bushy vs. bushy + Imazalil). La meti-
lazione del fenotipo bushy se confrontata con il fenoti-
po wt è risultata del 12,5% (10,6% completamente
metilati e 1,9% emimetilati), mentre nei germogli wt il
livello di metilazione è apparso inferiore (3,7%). Il
fenotipo bushy è risultato maggiormente metilato anche
rispetto allo stesso fenotipo cresciuto su mezzo GM +
IMA (rispettivamente 9,7% e 2,8%). Tuttavia, quando
sono stati confrontati i profili di metilazione dei germo-
gli bushy + IMA e i germogli wt, è risultato che i primi
mantenevano un livello di metilazione superiore (6,3%)
rispetto ai secondi (1,2%), i quali invece presentavano
un livello di emimetilazione superiore (3,9) rispetto ai
germogli bushy + IMA (1,5%) (tab. 3). Il fenotipo
mutato bushy è quindi caratterizzato da un maggior
numero di profili di metilazione differentemente
espressi rispetto al fenotipo wt. Il fenotipo bushy + IMA
ha manifestato una percentuale di profili di metilazione
inferiore rispetto al fenotipo di origine bushy, pur
variando il tipo di metilazione. Sembra quindi che l’uso
di Imazalil nel mezzo di coltura in vitro abbia alterato il
livello di metilazione del fenotipo bushy.
In conclusione, la tecnica MSAP, già messa in luce
da studi condotti su altre specie e valorizzata nel pre-
sente lavoro dall’uso di primers marcati in fluorescen-
za, si prospetta quindi come una valida tecnica di dia-
gnostica molecolare per evidenziare differenze epige-
netiche (ovvero nello stato di metilazione del DNA)
fra cloni micropropagati.
Riassunto
La ricerca ha esaminato lo stato di metilazione del
DNA genomico totale nel sistema sperimentale costi-
tuito dalla varietà commerciale Elide®nei due fenoti-
pi wt e bushy, micropropagati in due diversi terreni di
coltura, con e senza l’aggiunta del fungicida Imazalil.
Sul terreno arricchito con Imazalil, è stata ridotta l’in-
sorgenza del fenotipo bushy. La digestione del DNA
genomico dei fenotipi wt e bushy, con 10 enzimi di
restrizione sensibili alla metilazione, ha mostrato, per
entrambi i tipi di germoglio, un contenuto in GC
basso ed un livello di metilazione elevato. La tecnica
Methylation-Sensitive Amplification Polymorphism)
MSAP, messa a punto per la prima volta in Gerbera
jamesonii, utilizzando primers marcati in fluorescen-
za, ha permesso di ottenere bande polimorfiche diver-
se a seconda dell’accessibilità del DNA. Il confronto
dei diversi profili di metilazione tra i 3 fenotipi ana-
lizzati (wt, bushy, bushy + IMA) ha evidenziato la
presenza di siti diversamente metilati in tutte le condi-
zioni fenotipiche esaminate.
Parole chiave: MSAP, metilazione, Imazalil, variabi-
lità epigenetica.
Ricerca finanziata dal MiPAAF, Progetto 192/7303/2006
“Individuazione, caratterizzazione e valorizzazione di specie
dotate di caratteristiche mediterranee (VIVAFLOR)”.
Pubblicazione n°18.
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Bushy vs wt
Bushy vs bushy + IMA
Bushy + IMA vs wt
12,5%
3,7%
9,7%
2,8%
7,8%
5,1%
bushy
wt
bushy
bushy + IMA
bushy + IMA
wt
1,9%
2,8%
2,8%
1,4%
1,5%
3,9%
Confronto Genotipo Emimetilazione Totale
10,6%
0,9%
6,9%
1,4%
6,3%
1,2%
Metilazione
Tab. 3 - Confronto tra profili di metilazione ottenuti tramite PCR selettiva effettuata utilizzando primers marcati a fluorescenza
(percentuale di bande differentemente metilate).
Tab. 3 - Methylation profile comparison of Elide phenotypes detected by MSAP making use with fluorescent labelled primers (methylation,
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