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Il Rinascimento della diagnostica allergologica

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Abstract

Riassunto Sin dall'introduzione del primo test per la determi-nazione delle IgE specifiche sono stati preparati estratti più o meno purificati a partire dalle varie sor-genti allergeniche (pollini, epiteli animali, acari, muf-fe, alimenti, imenotteri), con lo scopo di legare le immunoglobuline circolanti. Nonostante i notevoli e continui sforzi profusi dai produttori per migliora-re la qualità di tali estratti, però, la loro standardizza-zione ha sempre presentato difficoltà e criticità. Durante le ultime due decadi le molecole allergeni-che maggiori e minori delle principali sorgenti aller-geniche sono state identificate, caratterizzate a livel-lo molecolare e, nella maggior parte dei casi, ripro-dotte sotto forma di proteine ricombinanti, renden-do possibile l'allestimento di test diagnostici, sia tra-dizionali che in forma di microarray, basati sull'uti-lizzo di singole molecole allergeniche. Oltre a sem-plificare i processi di standardizzazione dei prepara-ti, ciò permette la definizione dello specifico profilo allergenico di ciascun soggetto (Component Resol-ved Diagnosis) (CRD). La CRD rappresenta, quindi, un concetto del tutto innovativo e per certi versi ri-voluzionario nell'ambito della diagnostica allergolo-gica, dal momento che sul piano teorico permette la discriminazione tra cross-sensibilizzazione e co-sen-sibilizzazione, nonché di predire la risposta alla im-munoterapia e la potenziale gravità di alcune sensi-bilizzazioni verso specifici allergeni alimentari. Prima che i test diagnostici basati sulla definizione molecolare trovino ampio utilizzo nella pratica clini-ca, comunque, è opportuno che vengano predisposti opportuni programmi di verifica di qualità, e che cli-nici e laboratoristi concorrano a meglio definire l'ac-curatezza diagnostica dei vari metodi e delle singole molecole in essi usate.
RIMeL / IJLaM 2008; 4 (Suppl.)
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Ricevuto: 11-08-2008 Pubblicato on-line: 19-09-2008
Corrispondenza a:
Dott. Danilo Villalta, Allergologia e Immunologia clinica, Dipartimento di Medicina di Laboratorio.
A.O. “Santa Maria degli Angeli”, Via Montereale n.24, 33170 Pordenone. Tel. 0434-399281, fax 0434-399344,
e-mail: danilo.villalta@aopn.fvg.it
Il Rinascimento della diagnostica allergologica
D. Villalta
Allergologia e Immunologia clinica, Dipartimento di Medicina di Laboratorio, A.O. “S. Maria degli Angeli”, Pordenone
Riassunto
Sin dall’introduzione del primo test per la determi-
nazione delle IgE specifiche sono stati preparati
estratti più o meno purificati a partire dalle varie sor-
genti allergeniche (pollini, epiteli animali, acari, muf-
fe, alimenti, imenotteri), con lo scopo di legare le
immunoglobuline circolanti. Nonostante i notevoli
e continui sforzi profusi dai produttori per migliora-
re la qualità di tali estratti, però, la loro standardizza-
zione ha sempre presentato difficoltà e criticità.
Durante le ultime due decadi le molecole allergeni-
che maggiori e minori delle principali sorgenti aller-
geniche sono state identificate, caratterizzate a livel-
lo molecolare e, nella maggior parte dei casi, ripro-
dotte sotto forma di proteine ricombinanti, renden-
do possibile l’allestimento di test diagnostici, sia tra-
dizionali che in forma di microarray, basati sull’uti-
lizzo di singole molecole allergeniche. Oltre a sem-
plificare i processi di standardizzazione dei prepara-
ti, ciò permette la definizione dello specifico profilo
allergenico di ciascun soggetto (Component Resol-
ved Diagnosis) (CRD). La CRD rappresenta, quindi,
un concetto del tutto innovativo e per certi versi ri-
voluzionario nell’ambito della diagnostica allergolo-
gica, dal momento che sul piano teorico permette la
discriminazione tra cross-sensibilizzazione e co-sen-
sibilizzazione, nonché di predire la risposta alla im-
munoterapia e la potenziale gravità di alcune sensi-
bilizzazioni verso specifici allergeni alimentari.
Prima che i test diagnostici basati sulla definizione
molecolare trovino ampio utilizzo nella pratica clini-
ca, comunque, è opportuno che vengano predisposti
opportuni programmi di verifica di qualità, e che cli-
nici e laboratoristi concorrano a meglio definire l’ac-
curatezza diagnostica dei vari metodi e delle singole
molecole in essi usate.
Summary
The Renaissance of allergy testing
Since the first introduction of the in vitro diagnostic test
for the determination of IgE, crude or purified extracts
prepared from various allergen-containing biological ma-
terial (e.g. pollens, animal danders, mites, moulds, foods,
insects) have been used as agents for capturing IgE anti-
bodies in serum. In spite of the continuous efforts produ-
ced by the manufactures to improve the quality of the
allergenic material applied in these tests, they remain cum-
bersome to standardize regarding their allergen content.
During the last two decades, the major and minor IgE
binding proteins of the most prevalent allergy-causing
natural sources have been characterized on a molecular
level, and many of them have been produced as recombi-
nant proteins. Diagnostic tests based on single recombi-
nant (or natural) allergens, both in classical and in microar-
ray format, have been developed and today it is possible
to determine the complex reactivity profile of allergic pa-
tients (Component Resolved Diagnosis) (CRD). The CRD
represents an innovative and revolutionary concept in al-
lergy diagnosis because it allows the discrimination betwe-
en cross and co-sensitization, the prediction of the effi-
cacy of immunotherapy and the prediction of the severity
of the clinical manifestations in food allergy. However,
before the CRD tests, and in particular the microarray-
based tests, become a standard diagnostic tool in clinical
laboratory, the quality assurance programs for specific IgE
have to be revised ad adapted for these new assays, and
clinicians and pathologists have to better define their dia-
gnostic accuracy and their impact on the clinical outcome.
Key-words: allergy, component resolved diagnosis (CRD),
microarray, recombinant allergens.
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Note Storiche
L’inizio della diagnostica allergologica può essere fatto
risalire al 1880, anno in cui Charles Blackley, un soggetto
affetto da oculorinite primaverile, instillandosi un estratto
pollinico da lui preparato nel naso e nella congiuntiva, fu in
grado di riprodurre i sintomi della malattia, dimostrando
così una ipotesi posta mezzo secolo prima da Ellioston,
ma da esso non verificata. L’esperimento di Blackley, quindi,
rappresentò il primo test di provocazione con estratto al-
lergenico. Lo stesso ricercatore, inoltre, applicando l’estratto
alla cute lievemente abrasa, osservò la comparsa di un
pomfo circondato da eritema, eseguendo di fatto il primo
prick test, che tuttora rappresenta l’approccio diagnostico
iniziale delle malattie allergiche.
Nel 1920 Prausnitz e Küstner dimostrarono come alla
base della sensibilizzazione allergica ci fosse una compo-
nente sierica non meglio identificata che definirono “reagi-
na”. Dovettero passare quasi altri 50 anni prima che il grup-
po di Ishizaka e il gruppo di Johanson, in maniera indi-
pendente, nel 1967 identificassero nella nuova classe im-
munoglobulinica E (IgE) la natura della “reagina”. Nello
stesso anno Wide et al.1 misero a punto il Radioallergosor-
bent test (RAST) per il dosaggio delle IgE specifiche, dan-
do il via all’era della diagnostica allergologica in vitro, che
negli anni successivi divenne un importante step nell’algorit-
mo diagnostico del paziente allergico.
Alla fine degli anni ’80, con l’introduzione della seconda
generazione dei sistemi per il dosaggio delle IgE specifi-
che, furono apportate varie modifiche al test originale, quali
lo sviluppo di fasi solide con elevata capacità legante l’an-
tigene, l’uso di traccianti enzimatici legati ad anticorpi anti-
IgE monoclonali, nonché l’uso di curve di calibrazione
eterologhe tarate sullo standard IgE WHO 75/502, che
resero il test realmente quantitativo. All’inizio degli anni 2000,
infine, è comparsa la terza generazione dei sistemi diagno-
stici per la determinazione delle IgE specifiche, caratteriz-
zati dall’alta sensibilità analitica e da una totale automazio-
ne.
Nonostante il miglioramento continuo dei metodi dia-
gnostici, però, analisi comparative dei dati ottenuti con test
di terza generazione2 hanno dimostrato come per alcuni
allergeni permanga una scarsa concordanza fra metodi e
in alcuni casi ci siano significative discrepanze tra dati ana-
litici e clinica. Varie possono essere le motivazioni di tali
osservazioni, ma la più importante è legata alla composi-
zione degli estratti allergenici. Sebbene siano stati profusi
diversi sforzi nel tentativo di migliorare la purificazione e
la standardizzazione degli estratti allergenici usati sia per la
diagnostica in vivo e in vitro, nonché per l’immunoterapia
specifica, essi continuano a presentare una discreta variabi-
lità nella loro composizione, sia tra metodi che tra lotti.
La maggiore limitazione degli estratti allergenici, però, è
che essi rappresentano una miscela di proteine allergeniche
e non, e quindi non sono in grado di dare informazioni
precise circa le singole specificità allergeniche verso le quali
un singolo soggetto è sensibilizzato.
Durante l’ultima decade, numerose molecole allergeni-
che sono state identificate, clonate e sequenziate, grazie al-
l’uso di tecniche di biologia molecolare, e ora disponiamo
di molti allergeni ricombinanti che possono essere utilizza-
ti in diagnostica, facendo presagire che è già iniziata l’era di
transizione dalla diagnostica allergologica basata sull’uso di
estratti allergenici a quella molecolare.
Le molecole allergeniche
Negli ultimi anni sono stati identificati centinaia di aller-
geni provenienti da diverse fonti allergeniche quali erbe,
alberi, acari, epiteli animali, cibi, imenotteri, etc, la maggior
parte dei quali sono stati espressi come molecole ricombi-
nanti in cellule procariote o eucariote, in forme in grado di
mantenere l’attività biologica, nonché la struttura antigeni-
ca della molecola nativa. Per molti allergeni è stata identifi-
cata la localizzazione dei residui aminoacidici responsabili
del legame con le IgE, come pure degli epitopi responsa-
bili della attivazione dei linfociti T specifici. Per circa 40
molecole, infine, fra le quali Bet v 1, Der p 1, Der p 2,
Bla g 2, Bos d 2, Ara h 1, è stata definita la struttura tridi-
mensionale tramite risonanza magnetica e cristallografia a
raggi X.
La lista delle molecole è costantemente aggiornata nella
Official list of allergens dell’International Union of Immunological
Societies Allergen Nomenclature sub-committee del WHO (WHO/
IUIS) (http://www.allergen.org). Altri database, però, sono
disponibili per consultazioni, quali Allergome (http://
www.allergome.org), il Food Allergy Research and Resource
Program Allergen database (http://www.allergononline.com)
e l’InFormAll database (http://foodallergens.ifr.ac.uk).
L’analisi di tali database suggerisce che le molecole aller-
geniche possono appartenere a oltre 120 distinte famiglie
proteiche, anche se in realtà gli allergeni responsabili della
maggior parte delle reazioni allergiche sono ristretti a po-
che famiglie proteiche con un ristretto numero di funzioni
biologiche3.
Ai fini pratici e per una migliore comprensione di quan-
to seguirà, va ricordato che, in base alla nomenclatura in-
ternazionalmente accettata, un allergene viene definito usan-
do le prime tre lettere del genere, seguito da una singola
lettera indicante la specie e un numero indicante la crono-
logia della purificazione allergenica; ad esempio l’allergene
maggiore (allergene 1) del gatto (Felix domesticus) verrà de-
finito come Fel d 1, quello del Dermatophagoides pteronissinus
come Der p 1, e così di seguito.
L’uso delle molecole allergeniche nella
diagnostica allergologica
L’uso di allergeni ricombinanti (o nativi altamente puri-
ficati) al posto degli estratti allergenici rappresenta una no-
tevole conquista in allergologia, per diversi motivi.
Il primo è che esso permette di superare uno degli sco-
gli più importanti legati all’uso di estratti allergenici, che è
quello della standardizzazione, e ciò a causa della loro va-
riabilità in composizione e in contenuto antigenico, dovuti
alla diversità delle fonti di approvvigionamento, alla pre-
senza di enzimi proteolitici, a quella di allergeni contamina-
ti, etc. Recentemente il comitato per la standardizzazione
del WHO/IUIS ha intrapreso un nuovo programma al
fine di produrre nuovi standard a partire da proteine nati-
ve purificate o ricombinanti, da distribuire a industrie o
enti accademici per la preparazione dei test in vitro, oppu-
re ad enti regolatori per la comparazione dei prodotti al-
lergenici. L’uso di tali standard permette di definire il con-
tenuto allergenico in unità di massa, e se ciò può avere un
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significato relativo in diagnostica ha invece un significato
importantissimo nelle preparazioni utilizzate per l’immu-
noterapia specifica. Se uno standard è ottenuto utilizzando
molecole ricombinanti, inoltre, ha il vantaggio di poter
essere riprodotto immodificato e in quantità praticamente
illimitata nel tempo.
Un altro grosso vantaggio della diagnostica molecolare
è la capacità di discriminare se uno stato di polisensibiliz-
zazione identificato in vivo o in vitro, usando preparati
estrattivi, è dovuto a co-sensibilizzazioni, e cioè a sensibi-
lizzazioni primarie verso specifiche proteine allergeniche
maggiori o minori presenti nelle singole sorgenti allergeni-
che, oppure a cross-sensibilizzazioni, cioè cross-reattività
verso molecole omologhe presenti in diverse sorgenti al-
lergeniche, a volte senza significato clinico.
Il vantaggio senz’altro più importante, però, è a livello
di definizione diagnostica. Una diagnostica basata sugli
estratti allergenici, infatti, può arrivare solo alla identifica-
zione della sorgente allergenica (es. allergia alla betulla, agli
acari, etc), ma non ad identificare l’entità molecolare verso
cui un paziente si è sensibilizzato (es. Bet v1, Bet v2, Bet v4,
Der p1, Der p10, etc). La individuazione del profilo aller-
genico individuale di un paziente (Component Resolved Dia-
gnosis, CRD) non rappresenta solo un affinamento diagno-
stico4, ma ha notevoli ripercussioni sia prognostiche che
terapeutiche, come viene esemplificato di seguito.
Esempi di utilizzo della diagnostica molecolare
nell’allergia a pollini
L’allergia a pollini arborei o di erbe rappresenta una del-
le cause più frequenti di allergia. Essa può essere determi-
nata dalla presenza di IgE rivolte verso diverse proteine
con diverse funzioni. Alcune di queste proteine allergeni-
che sono altamente conservate e sono presenti in forme
omologhe in specie botaniche fra loro non imparentate
(panallergeni); altre molecole, invece, sono dotate di speci-
ficità a livello di specie o genere botanico. Quest’ultime
sono molecole utili per definire una sensibilizzazione pri-
maria (“genuina”) verso una singola specie pollinica. Nel
caso delle Graminaceae molecole appartenenti ai gruppi 1,
2, 5 e 6 sono esclusivamente presenti in tali erbe e pertanto
IgE rivolte verso tali molecole sono indice di una sensibi-
lizzazione specifica alle Graminaceae. In particolare le mole-
cole del gruppo 1 sono presenti in circa il 95% dei pazienti
affetti da allergia a Graminaceae. Fra queste, quella apparte-
nente al Phleum pratense (codolina) (Phl p1), è quella che
viene maggiormente usata in diagnostica e presenta omo-
logie superiori all’ 85% con molecole del gruppo 1 delle
altre Graminaceae e superiori al 90% con quelle di Lolium
perenne (loglierella) (Lol p 1). Le molecole appartenenti al
gruppo 2 (Phl p 2) sono presenti in circa il 60% dei pazien-
ti affetti da allergia a Graminaceae, ma non in quelli allergici
al Cynodon dactylon (Erba canina) e Zea mays (granoturco).
Analogamente le molecole del gruppo 5 (Phl p 5) sono
presenti in circa l’85% di pazienti con allergia a Graminaceae,
ma in genere non in pazienti con sensibilizzazione a Cyno-
don dactylon e Zea mays. Molecole del gruppo 6 (Phl p 6),
infine, sono state identificate solo nella loglierella e grami-
gna dei prati (Poa pretensis). Da quanto sopra, quindi, pa-
zienti con IgE specifiche verso Phl p1, Phl p 2, Phl p 5, Phl
p 6 sono da considerarsi primariamente sensibilizzati alle
Graminaceae; pazienti che presentano solo positività per Phl
p 1 sono con ogni probabilità sensibilizzati a Cynodon dactylon
o Zea mays; pazienti con positività per Phl p 6 presentano
sensibilizzazione per loglierella e gramigna dei prati5. I sog-
getti con positività verso tali molecole, infine, a differenza
di quelli sensibilizzati a panallergeni, in genere rispondono
bene all’immunoterapia, la quale è standardizzata verso
molecole appartenenti ai gruppi 1, 2 e 5.
Un altro esempio di molecola con specificità di genere è
Ole e 1, l’allergene maggiore dell’olivo. Quando sono pre-
senti IgE specifiche verso tale molecola, quindi, si è di fronte
ad una sensibilizzazione primaria all’olivo, anche se va ri-
cordato come ci sia una notevole omologia con molecole
di altre Oleaceae e in particolare del frassino (Fraxinus excel-
sior) (Fra e 1) del ligustro (Ligustrum vulgaris (Lig v 1). Pa-
zienti, quindi, con positività verso Ole e 1 e residenti in
zone dove non c’è l’olivo si sono con alta probabilità sen-
sibilizzati a Frassino e Ligustro, i cui allergeni maggiori hanno
una omologia superiore all’ 85% con Ole e 16. Pazienti con
positività cutanea all’ estratto di olivo e positività in vitro
per Ole e 1, rispondono bene all’immunoterapia specifica
(ITS).
Par j 1 e Par j 2 rappresentano gli allergeni maggiori
della Parietaria judaica e hanno una elevatissima omologia
con molecole analoghe presenti nella Parietaria officinalis. La
presenza di tali allergeni, quindi, è indice di una sensibiliz-
zazione genuina alla Parietaria.
L’allergia alle Betulaceae, dopo quella alle Gramianceae, è la
più frequente allergia a pollini nel Nord Italia. Parecchie
sono le molecole allergizzanti individuate nei pollini delle
betulle, fra le quali Bet v 1, Bet v 2, Bet v 4, Bet v 6, Bet v 7.
L’allergene maggiore, indice di una sensibilizzazione pri-
maria alla betulla, è Bet v 1 una Pathogenesis related protein
(PR10) presente in oltre l’80% dei pazienti affetti da aller-
gia alla betulla. Molecole con alta omologia a Bet v 1 si
trovano in altre piante dell’ordine delle Fagales quali l’onta-
no (Aln g 1), il nocciolo (Cor a 1), il carpino (Car b 1), la
quercia (Que a 1), ma anche in alcuni tipi di frutta quali la
mela (Mal d 1), la ciliegia (Pru av 1), l’albicocca (Pru ar 1),
la pera (Pyr c 1), in alcuni vegetali come il sedano (Api g 1),
la carota (Dau c 1), la soia (Gly m 4), le arachidi (Ara h 8).
Da quanto sopra, quindi, una positività per Bet v 1 fa pre-
supporre che il paziente presenti reazioni anche con altre
piante contenenti le molecole omologhe, nonché possa
avere la sindrome orale allergica (SOA) in seguito ad inge-
stione di frutta o verdura che contengono tale molecola.
Sappiamo però che tale molecola è labile e non resiste al
calore, per cui le persone sensibilizzate verso questa mole-
cola che presentano la SOA tollerano bene i cibi cotti e
comunque rarissimamente potranno avere anafilassi in se-
guito ad ingestione di tale frutta o verdura per cui non
necessitano di precauzioni particolari. La positività al solo
Bet v1 è un marcatore predittivo di risposta alla ITS7.
Un allergene minore della betulla è Bet v 2. Esso è una
profilina, componente importante del citoscheletro delle
cellule eucariote in grado di legarsi all’actina. Ha una fun-
zione biologica altamente conservata e, come spesso acca-
de per tale tipo di proteine, presenta un’alta omologia fra
molecole appartenenti a diversi organismi, anche di specie
non affini. Pazienti con IgE specifiche alla profilina, quin-
di, possono manifestare reazioni allergiche a pollini di piante
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appartenenti a generi diversi, nonché a vari tipi di frutta,
verdure, semi, spezie, lattice. Trattasi, quindi di un panaller-
gene, spesso chiamato in causa nel caso di reattività multi-
ple a test cutanei. In tal caso non si tratta di co-sensibilizza-
zioni, ma di cross-sensibilizzazioni, dovute alla reattività
crociata tra molecole omologhe (profiline) contenute in
diversi estratti, ottenuti a partire da varie specie botaniche.
Un paziente, quindi, apparentemente polisensibilizzato a
vari pollini, ma che risulta al test molecolare positivo per
Bet v 1 e Bet v 2 è un paziente primariamente sensibilizza-
to alla betulla, ma che nel corso della storia naturale della
sua allergia ha sviluppato anche una sensibilizzazione alla
profilina (Bet v 2), in grado di dare cross-reattività con
molti altri estratti pollinici e che clinicamente può estrinse-
carsi in una SOA verso una quantità di alimenti ancora
maggiore rispetto a quella dovuta a Bet v 1. Tale paziente
risponde meno bene alla ITS, che notoriamente è standar-
dizzata per Bet v 1. Ovviamente non risponde ad alcuna
ITS per altri pollini. Anche se ora non disponibile, teorica-
mente potrebbe trovare giovamento da un ITS contenen-
te Bet v 2. Molecole omologhe a Bet v 2 già disponibili e
che possono essere analogamente usate per definire una
sensibilizzazione alla profilina sono Phl p 12 (da Phleum
pratense), Ole e 2 (da Olea europea), Hev b 8 (da Havea brasi-
lensis), Mer a 1 (da Mercurialis annua), Hel a 2 (da Helianthus
annuus) ed altre ancora.
Un altro panallergene del mondo vegetale è rappresen-
tato dalle proteine con due siti di legami per il calcio (Two-
EF-Hand calcium-Binding Pollen Allergens). Esse sono protei-
ne contenute nei pollini, ma non in altri tessuti delle piante
e quindi, a differenza delle profiline, non sono responsabili
di SOA. Queste proteine, anch’esse presentanti alta omo-
logia, sono evidenziabili in vari pollini quali quelli di Grami-
naceae (Phl p 7; Cyn d 7), betulla (Bet v 4), ontano (Aln g 4),
olivo (Ole e 3), frassino (Fra a 3), etc. Un paziente sensibi-
lizzato primariamente alle Graminaceae (Phl p 1, Phl, p 2,
Phl p 5, Phl p 6), ma anche sensibilizzato a Phl p 7, quindi,
presenterà cross-reattività con altri pollini, ma non SOA
con frutta o verdura. Esso risponderà meno bene alla ITS,
rispetto ai pazienti con sola sensibilizzazione agli allergeni
maggiori e non risponderà alla ITS con estratti allergenici
di altri pollini.
Esempi di utilizzo della diagnostica molecolare
nell’allergia ad acari
Gli acari rappresentano uno delle maggiori cause di al-
lergia nel mondo e circa il 50% dei pazienti allergici sono
sensibilizzati alle proteine di tali artropodi. Dalla prima iden-
tificazione dell’allergene maggiore del Dermatophagoides pte-
ronyssinus (Der p 1), altri 20 gruppi di molecole allergeni-
che, con funzione enzimatica o strutturale, e con stretta
omologia fra i due acari maggiori (pteronyssinus e farinae)
sono state identificati e caratterizzati a livello molecolare8.
Der p 1, Der p 2 (oppure Der f 1 e Der f 2) rappresen-
tano gli allergeni maggiori in grado di identificare da soli la
maggior parte dei pazienti affetti da allergia agli acari do-
mestici. Pazienti con positività a tali allergeni sono quindi
primariamente sensibilizzati agli acari domestici ed è alta-
mente probabile che rispondano alla ITS.
Come noto da parecchio tempo, inoltre, alcuni soggetti
con sensibilizzazione agli acari possono presentare sintomi
respiratori, cutanei e a volte sistemici in seguito ad inge-
stione di crostacei o lumache. Più studi hanno dimostrato
come ciò sia legato a una sensibilizzazione alla tropomiosi-
na, proteina presente in forma altamente conservata fra le
varie specie di invertebrati quali artropodi, insetti, crosta-
cei, molluschi, e quindi le IgE specifiche prodotte a partire
dalla tropomiosina di una di questi invertebrati presenta
un alto grado di cross-reattività con tutte le altre; non ci
sarebbe cross-reattività, invece, con le tropomiosine dei
vertebrati. Sul piano pratico, quindi, un soggetto sensibiliz-
zato verso la tropomiosina degli acari (Der p 10), presenta
reattività con la tropomiosina dei gamberetti (Penaeus azte-
cus, Pen a 1; Penaeus monodon, Pen m 1), di altri crostacei
quali l’aragosta (Panulirus stimsoni, Pan s 1; Homarus america-
nus, Hom a 1), di molluschi quali i calamari (Todarodes paci-
ficus, Tod p 1), di ostriche (Crassostea gigas, Cra g 1) e di altri
invertebrati e di conseguenza possibili reazioni avverse in
seguito alla ingestione di tali alimenti. La presenza di IgE
specifiche verso Pen a 1 o Pen m 1 viene usata come mar-
catore di tale allergia.
Una nostra recente esperienza, usando sia rPen a 1 che
nPen m 1, comunque, ha evidenziato come solo una pic-
cola parte dei pazienti con allergia ad acari e reazioni av-
verse da ingestione di crostacei presentasse positività per
tali molecole, facendo ipotizzare o che le molecole attual-
mente utilizzate in diagnostica non esprimono in maniera
ottimale i siti leganti le IgE specifiche, o che la reattività
crociata tra acari e gamberetti può essere dovuta anche a
molecole diverse dalla tropomiosina. Sono attualmente in
corso valutazioni tramite immunoblot e RAST inibizione
al fine di verificare tali ipotesi.
Esempi di utilizzo della diagnostica molecolare
nell’allergia alimentare
L’allergia alimentare presenta maggiori difficoltà diagno-
stiche rispetto alle allergie respiratorie, anche perchè i test
attualmente a disposizione difettano in sensibilità, ma so-
prattutto in specificità, e ciò fa sì che il test diagnostico di
riferimento per l’allergia alimentare rimanga il test di scate-
namento in doppio cieco controllato con placebo
(DBPCFC), il quale, comunque, oltre al rischio di provo-
care reazioni gravi, è indaginoso e necessità di strutture
adeguate per la sua esecuzione. La possibilità di disporre
di test quantitativi per IgE specifiche ha senz’altro rappre-
sentato un passo in avanti, permettendo di stabilire livelli
di predittività per vari allergeni, cioè livelli soglia sopra i
quali si ha una probabilità di positività del DBPCFC del
95%, come dimostrato dagli studi di Sampson9. Tale ap-
proccio, però, non è sempre facilmente realizzabile, dal
momento che i livelli sono metodo dipendenti e in lettera-
tura sono riportati solo per pochi allergeni. Ogni centro,
quindi, dovrebbe farsi i propri valori, ma se ciò è possibile
per le allergie più comuni, è praticamente impossibile per
quelle dovute ad allergeni più rari.
La diagnostica molecolare ha in sé delle grandi poten-
zialità anche nel campo dell’allergia alimentare, come già
sopra dimostrato per le SOA legate a Bet v 1 o a profiline.
Sempre rimanendo nell’ambito dell’allergia alla frutta, la
positività per molecole appartenenti alla categoria delle Lipid
Tranfer Proteins (LTPs) è stata associata a reazioni gravi, si-
stemiche a differenza di quanto avviene nel caso delle sen-
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sibilizzazioni a proteine appartenenti alla famiglia delle PR10
(Bet v 1) o alle profiline e ciò è messo in relazione alla loro
stabilità al calore e alla resistenza all’azione dei succhi ga-
strici. La positività a una LTP derivata dalla pesca (Pru p 3)
o dalla nocciola (Cor a 8), oggi a disposizione, è predittiva
di possibili reazioni sistemiche in seguito ad ingestione di
tali alimenti, anche cotti o sotto forma di succhi di frutta, o
di altri alimenti appartenenti alle Rosaceae.
Altre molecole già identificate, non ancora disponibili
per la diagnostica ma di probabile prossima introduzione,
sono quelle appartenenti alla famiglia delle 2S albumine,
responsabili di importanti reazioni allergiche in seguito ad
ingestione di senape (Sin a 1, Bra j 1), noce brasiliana (Ber
e 1), noce (Jug r 1), sesamo (Ses i 1), anacardio (Ana o 3) e
altri alimenti; alla famiglia delle Vicilin-like proteins, respon-
sabili di importanti reazioni in seguito alla ingestione di
arachidi (Ara h 1), lenticchie (Len c 1), nocciola (Cor a 11),
noce (Jug r 2), anacardio (Ana o 1), sesamo (Ses i 3); alla
famiglia delle parvalbumine, responsabili delle reazioni al
pesce (Cyp c 1; Gad c 1, etc).
Se tali molecole, quindi, rappresentano una speranza reale
di migliorare la diagnostica delle allergie alimentari, ren-
dendo marginale l’uso del DBPCFC, rimane da valutare
se la presenza di IgE specifiche verso di esse rappresenti
sempre un rischio reale di scatenamento della reazione al-
lergica e quindi siano sempre dotate di elevato valore pre-
dittivo positivo. Ciò sarà importante da definire in consi-
derazione di quello che comporta per il paziente una dia-
gnosi di allergia alimentare IgE mediata..
La diagnostica molecolare con tecniche
tradizionali e microarray
Attualmente con il sistema ImmunoCap di Phadia sono
disponibili oltre 30 molecole, relative ad allergeni apparte-
nenti alle Graminaceae, betulla, olivo, parietaria, acari, lattice,
Aspergillus, olivo, cane e gatto. Il numero limitato di mole-
cole disponibili, comunque, non permette per ora di sosti-
tuire l’uso degli estratti con quello delle singole molecole,
ma quest’ultime possono essere di volta in volta usate per
definire alcuni specifici profili, in base allo specifico quesi-
to clinico. Ad esempio è possibile determinare se un sog-
getto con multi-sensibilizzazioni a pollini rilevate al prick
test presenti reali co-sensibilizzazioni o se si tratta di cross-
sensibilizzazioni, in base a quanto in precedenza riportato.
E’ possibile anche meglio definire la natura di una reazione
allergica alla frutta, definendo se si tratta di una SOA da
Bet v 1, da Bet v 2, oppure di una reazione con risvolti ben
più gravi legata a una sensibilizzazione a Pru p 3. Qualora
si avessero a disposizione molte altre molecole si potreb-
be ipotizzare di poter sostituire gli estratti allergenici con le
singole molecole. Al momento, però, tale strada sembra
poco percorribile, essenzialmente per questione di costi;
una alternativa potrebbe essere la sostituzione degli estratti
attuali con miscele di molecole. Ciò senz’altro porterebbe
ad un miglioramento della standardizzazione e della ripro-
ducibiltà del sistema, ma farebbe venir meno i vantaggi
della CRD precedentemente descritti.
Un modo per superare i limiti intrinseci legati alle meto-
diche tradizionali ci viene offerto dai microarray proteo-
mici. In campo allergologico essi sono già una realtà ed è
già commercializzato l’ISAC (Immuno Solid-phase Aller-
gen Chip), in cui in un supporto di vetro sono presenti
quattro siti di reazione, ognuno di 7x7 mm. Ogni sito con-
tiene 90 diverse molecole immobilizzate in tripletta sulla
superficie del vetrino, ma in teoria può contenerne oltre
400. E’ già in preparazione una seconda versione conte-
nente oltre 100 molecole per sito. Il vantaggio maggiore
del microarray è di poter determinare un profilo allergo-
logico molto ampio in un unico dosaggio, con soli 20 µL
di siero. A parità di numero complessivo di determinazio-
ni anticorpali, inoltre, ha costi decisamente inferiori in quan-
to, per ogni singola specificità IgE, sono necessari solo
qualche centinaio di picogrammi di molecola, anche se il
costo fisso per singolo paziente si aggira oggi sui 100 euro.
Esso, comunque, permette di passare da una visione par-
ticolaristica dello stato di sensibilizzazione del paziente, ad
una olistica, con la definizione dell’intero profilo di sensi-
bilizzazione, suddiviso per allergeni maggiori e minori.
Nonostante gli indiscussi vantaggi rispetto alla diagno-
stica tradizionale, però, prima dell’introduzione su larga
scala nella pratica clinica, i microarray per la diagnostica
allergologica dovranno essere ottimizzati e attentamente
valutati sul piano analitico e clinico. In particolare andrà
valutato se i risultati ottenuti per le singole molecole siano
sovrapponibili a quelli ottenuti con metodi tradizionali, e i
primi studi, limitati a pochi allergeni, riportano risultati
confortanti per Der p 1, Der p 2, Fel d 1, Bet v 1, Bet v 2,
Phl p 1, Phl p 2, Phl p 5, Phl p 6, Phl p 7, ma non, per
esempio, per Art v 110. Dovranno essere, inoltre, essere
allestiti dei sieri da usarsi sia per il controllo di qualità inter-
no che per le verifiche esterne di qualità, i quali necessaria-
mente avranno caratteristiche diverse da quelli ora in uso
in quanto dovranno essere molecola e non estratto specifi-
ci. Parallelamente alle valutazioni analitiche dovranno esse-
re condotti ampi studi di validazione clinica, al fine di de-
finire la reale accuratezza diagnostica di tali sistemi e se le
premesse teoriche, che vedono nella diagnostica moleco-
lare un’arma formidabile a supporto dell’allergologo cli-
nico, siano realmente in grado, come atteso, di tradursi in
un miglioramento dell’outcome clinico. Allergologi clinici e
di laboratorio, pertanto, saranno chiamati ad una collabo-
razione sempre più stretta, mirata a rispondere a tali im-
portanti quesiti.
In conclusione, quindi, la possibilità di passare da una
diagnostica basata sull’utilizzo di estratti allergenici a una
basata sull’utilizzo delle singole molecole allergeniche, in
grado di definire lo specifico profilo allergenico di ciascun
paziente (CRD), grazie anche all’uso di tecnologie proteo-
miche su microarray, sembra essere in grado di rivoluzio-
nare la diagnostica allergologica e, probabilmente, in futu-
ro anche l’immunoterapia. Stiamo quindi assistendo, in cam-
po allergologico, a un fermento culturale e a dei cambia-
menti che, rapportati al campo della storia dell’arte, pos-
sono essere paragonati a quanto avvenuto nel passaggio
dal medioevo al Rinascimento. Il laboratorio è l’artefice
principale di tale rivoluzione culturale e avrà il compito, in
stretta collaborazione con la parte clinica, di valutare e va-
lidare i nuovi sistemi diagnostici affinchè essi diventino re-
almente strumenti importanti e indispensabili della diagno-
stica allergologica, evitando così che referti composti di
centinaia di sigle, di non immediata comprensione, porti-
no ad un “imbarocchimento” della diagnostica, creino
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RIMeL / IJLaM 2008; 4 (Suppl.)
nuove diffidenze da parte dell’utilizzatore clinico e, in defi-
nitiva, conducano al fallimento della prima vera grande
rivoluzione innovativa in campo allergologico dall’epoca
di Charles Blackley.
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Article
Full-text available
Riassunto L'individuazione delle singole molecole responsabili delle reazioni allergiche verso uno specifico allerge-ne ha rappresentato una delle maggiori conquiste degli ultimi anni in campo allergologico. La possibilità di disporre di tali molecole in forma ricombinante o nativa, infatti, ha permesso l'allestimento di test in vitro in grado di definire il singolo profilo allergeni-co di ciascun paziente (Component Resolved Dia-gnosis – CRD), con notevoli ripercussioni sul piano clinico, come quello di distinguere tra stato di co-sensibilizzazione e cross-reattività, nonché la possi-bilità di predire l'eventuale gravità della reazione ver-so alcuni alimenti di origine vegetale. Nonostante tale innegabile utilità, la CRD presenta ad oggi alcu-ne limitazioni. In alcune circostanze, infatti, non può ancora sostituire completamente la diagnostica ba-sata su estratti allergenici e in particolare: a) quando non sono ancora a disposizione, in forma ricombi-nante o nativa, le principali molecole responsabili delle reazioni ad uno specifico allergene; b) quando non sono del tutto note le principali molecole respon-sabili delle reazioni ad uno specifico allergene; c) quando, pur essendo note e disponibili per test in vitro le principali molecole di uno specifico allerge-ne, il paziente con sintomatologia suggestiva per al-lergia allo stesso risulti negativo al test molecolare. La CRD, inoltre, non sembra, allo stato attuale, po-ter ancora rispondere ad alcuni quesiti clinici nell'am-bito dell'allergia alimentare e in particolare: a) quali pazienti con sensibilizzazione a Bet v1 potranno svi-luppare SOA e verso quali tipi di frutta e/o verdura; b) quali pazienti con sensibilizzazioni alimentari pre-senteranno sintomi dopo ingestione dell'alimento e quali risulteranno tolleranti; c) quando bambini con sensibilizzazione a latte, uova, arachidi avranno su-perato l'allergia e potranno reintrodurre l'alimento. Solo il test di provocazione in doppio cieco control-lato con placebo (DBPCFC), test indaginoso e non scevro di rischi, è per il momento in grado di dare risposta a tale domande. Sono in sviluppo dei micro-array, comunque, che non usano la molecola intera, ma sequenze peptidiche della stessa, (peptide micro-array) i cui risultati preliminari sono estremamente interessanti e che, se confermati, potranno aprire la strada all'utilizzo di tale metodica nella pratica clini-ca, in particolare in alcune allergie alimentari dei bam-bini, con il duplice vantaggio di evitare il DBPCFC e di utilizzare limitatissime quantità di sangue.
Article
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During the past decade an increasing number of recombinant allergens have become available, representing a significant proportion of the epitope complexity of natural allergen extracts. Component-resolved diagnosis with recombinant allergens reveals the antibody reactivity profile of allergic patients and identifies the disease-eliciting allergen molecules. This article exemplifies how recombinant allergen molecules with high cross-reactive potential can be used as marker allergens to identify allergic patients who are cross-sensitized to a variety of allergen sources. It further demonstrates how the use of allergens with a restricted distribution in a certain group of allergen sources may allow the identification of patients who have been genuinely sensitized by a particular allergen molecule. Drawing from those examples, it is suggested how diagnostic tests based on such recombinant marker allergens may be used to improve the choice and monitoring of currently available forms of specific immunotherapy.
Article
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Our aims were to evaluate the performance of a fully automated system for measuring circulating allergen-specific IgE (sIgE) against an established in vitro assay and to assess the system's diagnostic accuracy against objective clinical criteria for identifying sensitization to specific allergens. Using both the IMMULITE 2000 Allergy system (IML) and an assay based on the widely used ImmunoCAP technology (CAP), we measured sIgE in serum samples from 169 persons with suspected allergies to airborne or insect venom allergens. Skin testing outcome served as the clinical comparison method. Interassay classification agreement between the IML and CAP, relative to the usual allergen-specific IgE cutoff of 0.35 kIU/L, ranged from 76% (yellow jacket venom) to 95% (orchard grass); agreement was 88.3% for all 9 allergens combined (766 results). The 90 discordant results, when resolved by skin testing, showed better agreement with the IML (72%) than with the CAP (28%). Compared with skin testing, for each of the 9 allergens studied, the area under the ROC curve was at least as large for the IML as for the CAP, reflecting in part the more extensive working range of the IML (0.10-100 kIU/L vs 0.35-100 kIU/L for CAP). Laboratory testing for sIgE can be performed on a fully automated, random-access system with an extended working range and with diagnostic accuracy for representative allergens equivalent to or better than that of the semiautomated CAP technology.
Article
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Allergen-specific immunotherapy (SIT) is the only allergen-specific treatment for allergy. It can prevent progression of the disease and has a long-lasting therapeutic effect. Since SIT is allergen-specific, the identification of the disease-eliciting allergen is an essential prerequisite for the accurate prescription of treatment. Diagnostic tests based on allergen extracts consist of mixtures of various allergens of which some are specific for the allergen source and others occur as cross-reactive allergens in various unrelated allergen sources. It may therefore be difficult and sometimes impossible to identify the disease-causing allergen with such tests, particularly in patients who are sensitized to more than one allergen source. Sensitization to pollens from olive, grasses, and Parietaria in the Mediterranean area is frequently treated with SIT. Here, we describe allergen molecules from these sources that can be used for component-resolved diagnosis of allergy to facilitate the selection of patients for SIT and monitor the immunological effects of treatment.
Article
An in-vitro method, called the radioallergosorbent test, has been developed for the detection of allergen-specific antibodies of a new immunoglobulin class, provisionally called IgND. Antibodies to 14 different allergens were detected in sera of allergic patients. A 96% agreement was obtained between results from provocation tests and the in-vitro test for allergy. The results strongly support the hypothesis that reagins belong to the immunoglobulin class IgND. The method described might become of great importance for
Article
The double-blind, placebo-controlled food challenge is considered the gold standard for diagnosing food allergy. However, in a retrospective analysis of children and adolescents with atopic dermatitis and food allergy, discrete food-specific IgE concentrations were established that could predict clinical reactivity to egg, milk, peanut, and fish with greater than 95% certainty. The purpose of this investigation was to determine the utility of these 95% predictive decision points in a prospective evaluation of food allergy. Sera from 100 consecutive children and adolescents referred for evaluation of food allergy were analyzed for specific IgE antibodies to egg, milk, peanut, soy, wheat, and fish by using the Pharmacia CAP System FEIA. Food-specific IgE values were compared with history and the results of skin prick tests and food challenges to determine the efficacy of previously established 95% predictive decision points in identifying patients with increased probability of reacting during a specific food challenge. One hundred children (62% male; median age, 3.8 years; range, 0.4-14.3 years) were evaluated for food allergy. The diagnosis of food allergy was established by means of history or oral food challenge. On the basis of the previously established 95% predictive decision points for egg, milk, peanut, and fish allergy, greater than 95% of food allergies diagnosed in this prospective study were correctly identified by quantifying serum food-specific IgE concentrations. In a prospective study of children and adolescents referred for evaluation of food allergy, previously established 95% predictive decision points of food-specific IgE antibody concentrations for 4 major food allergens were effective in predicting clinical reactivity. Quantification of food-specific IgE is a useful test for diagnosing symptomatic allergy to egg, milk, peanut, and fish in the pediatric population and could eliminate the need to perform double-blind, placebo-controlled food challenges in a significant number of children.
Article
The examination of house dust mite extracts has indicated that over 30 different proteins can induce IgE antibody in patients allergic to the house dust mite. There are however dominant specificities especially the group 1 and 2 allergens which can account for much of the allergenicity of extracts. Of the 19 denominated allergens, the major IgE binding has been reported for the group 1, 2, 3, 9, 11, 14 and 15 allergens. The high-molecular-weight group 11, 14 and 15 allergens have only recently been described and although high IgE binding has been anticipated from immunoblotting, there is a need for considerable corroboration. Similarly, the study of the group 3 and 9 serine protease allergens has been incomplete. The group 4, 5, 7 and 8 allergens have shown intermediate IgE binding and the group 10 tropomyosins are of interest because of their potential cross-reactivity with allergen from disparate species. Although the progress with the production of recombinant group 1 allergens has been recent, many of the allergens can be produced as high IgE-binding polypeptides. The tertiary structure of the group 2 allergens has been determined from recombinant proteins and they are an excellent model for the investigation of modified allergens. An unexpected property of the group 1, 2 and 3 allergens has been the high degree of polymorphism found by cDNA analysis. It has however been possible to identify sequences to represent the variation in the natural allergens. The group 7 and 14 allergens show secondary modifications which vary in different extracts creating batch variation. While some estimate of the importance of allergens can be obtained from IgE binding, few analyses of T-cell responses have been made and these regulate both the development of, and the protection from sensitization.
Article
Tree pollens are among the most important allergen sources. Allergic cross-reactivity to pollens of trees from various plant orders has so far been classified according to botanical relationships. In this context, cross-reactivities to pollens of trees of the Fagales order (birch, alder, hazel, hornbeam, oak, chestnut), fruits and vegetables, between pollens of the Scrophulariales (olive, ash, plantain, privet, lilac) and pollens of the Coniferales (cedar, cypress, pine) are well established. The application of molecular biology methods for allergen characterization has revealed the molecular nature of many important tree pollen allergens. We review the spectrum of tree pollen allergens and propose a classification of tree pollen and related allergies based on major allergen molecules instead of botanical relationships among the allergenic sources. This molecular classification suggests the major birch pollen allergen, Bet v 1 as a marker for Fagales pollen and related plant food allergies, the major olive pollen allergen, Ole e 1, as a possible marker for Scrophulariales pollen allergy and the cedar allergens, Cry j 1 and Cry j 2, as potential markers for allergy to Coniferales pollens. We exemplify for Fagales pollen allergy and Bet v 1 that major marker allergens are diagnostic tools to determine the disease-eliciting allergen source. Information obtained by diagnostic testing with marker allergens will be important for the appropriate selection of patients for allergen-specific forms of therapy.
Article
Existing allergen databases classify their entries by source and route of exposure, thus lacking an evolutionary, structural, and functional classification of allergens. We sought to build AllFam, a database of allergen families, and use it to extract common structural and functional properties of allergens. Allergen data from the Allergome database and protein family definitions from the Pfam database were merged into AllFam, a database that is freely accessible on the Internet at http://www.meduniwien.ac.at/allergens/allfam/. A structural classification of allergens was established by matching Pfam families with families from the Structural Classification of Proteins database. Biochemical functions of allergens were extracted from the Gene Ontology Annotation database. Seven hundred seven allergens were classified by sequence into 134 AllFam families containing 184 Pfam domains (2% of 9318 Pfam families). A random set of 707 sequences with the same taxonomic distribution contained a significantly higher number of different Pfam domains (479 +/- 17). Classifying allergens by structure revealed that 5% of 3012 Structural Classification of Proteins families contained allergens. The biochemical functions of allergens most frequently found were limited to hydrolysis of proteins, polysaccharides, and lipids; binding of metal ions and lipids; storage; and cytoskeleton association. The small number of protein families that contain allergens and the narrow functional distribution of most allergens confirm the existence of yet unknown factors that render proteins allergenic.