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第35 卷 第 2期西北农林科技大学学报(自然科学版) V ol. 35 N o. 2
2007 年2月Jou rn al of N or t hw est A & F U niver s ity ( N at . Sci. E d. ) Feb . 2007
不同碳、氮源组合对小麦全蚀病菌
产生胞外-1,3-葡聚糖酶的影响
余永廷,谢媛媛,黄丽丽,康振生
(西北农林科技大学 植保学院,陕西 杨凌 712100)
[摘 要] 利用改进的M S 液体培养基,通过改变碳、氮源组合 ,分别在振荡培养小麦全蚀病菌 7, 14, 2 1 d 时
( 26 ℃, 150 r/min ) , 用3, 5-二硝基水杨酸(DN S )比色法测定培养滤液中的
-1, 3-葡聚糖酶活性。结果表明,培养基
中分别以小麦茎秆、叶片,玉米茎秆、叶片和根系为碳源与不同氮源组合,培养滤液中-1, 3-葡聚糖酶活性有明显差
异,其中以小麦叶片为碳源时酶活性最高,以玉米根系为碳源时酶活性较低,但两者之间酶活性无明显差异。培养
基中加入有机氮时酶活性均明显高于加入无机氮,但两种有机氮培养基中的酶活性变化趋势完 全不同。以牛肉膏
为氮源时,在小麦全蚀病菌培养7d时培养滤液中的酶活性最高,且酶活性随病菌 培养时间的延长而逐渐下降;以
蛋白胨为氮源时酶活性则呈上升趋势,在病菌培养21d时最高。以上结果表明,供试各组合中以牛肉膏为氮源、小
麦叶片为碳源的组合为最佳组合, 7 d时有相对较高的酶活性。
[关键词] 小麦全蚀病菌;禾顶囊壳小麦变种;-1, 3-葡聚糖酶; M S 培养基;碳源;氮源
[中图分类号] S4 35. 12 1 [文献标识码] A [ 文章编号] 1671-9 387 ( 2007) 02-01 10 -04
Effects of different combinations of carbon and nitrogen sources
in MS medium on activit ies of extracellular
-1, 3-
glucanase produced by take-
all pathogen
YU Y ong -t ing, X IE Yuan-yu an, HU AN G Li-li, K AN G Zhen-sheng
(College of Plant p r ote ct ion,N orth west A &F U niv ersi ty ,Y ang lin g,S ha anx i 712100, C hina)
Abstract: T h e p at hog enic f u ngi Gaeumannomy ces g rami nis var. trit ici ( Gg t ) w a s cult ur ed in m odif ied
M S mediu m ( 26 ℃, 150 r/m in )wit h dif ferent combinat ion s of carb on and nit rog en sour ces.T he enzyme
activit y in t he cult u re f iltrat e w as det ected by 3, 5-
dinitros alicylic acid (DN S)in 7, 14, 21 d after cultu ring
the fungu s . T he result s show ed the enzy me activities w ere obviously d iff erent in t h e culture f ilt rat e w it h
w heat stalks, w he at leav es, m aize s t al ks, m aiz e lea ves and m aize r oot s as ca rbo n s ou rce com bin ed w it h
dif fere nt nit ro gen so urc es .T h e h ighest enzy me activit ies w ere detected in t he culture filt rat e w ith w heat
leaves as the carbon s ource and the low est enzyme activit ies w ere in t h e culture filtr ate w ith m aize roots as
the carbon s ource. T he enzyme activities w ere not significant ly different in t he cultu re filtrat e w ith w h eat
tissues as comp ared wit h th at w it h maize tissues. Com paring 4 nit ro gen sources, t he enzym e activities w ere
ob viou sly hig her in the cult u re f ilt rat e w it h o r gan ic n it ro g en t ha n t h at w it h inor g anic nit ro g en.T he h ighest
enzy me activit ies were detected in t he culture f ilt rate w ith beef ex t ract as nit rog en sou rce 7d aft er
cult u ring the fung u s. Th e enzym e act ivities detected in t he culture filt rat e wit h pept one were low and
[收稿日期] 2006-01-23
[基金项目] 国家自然科学基金项目( 30270863) ; 教育部“长江学者和创新团队”支持计划( PC S IRT 2 00558) ; 西北农林科技大学创新团队
资助项目
[作者简介] 余永廷( 1980- ) , 男,安徽淮北人,在读硕士,主要从事小麦全蚀病致病机理研究。E -m ail: y uy o ngt ing@ 126. com
[通讯作者] 黄丽丽( 1961- ) , 女,陕西周至人,教授,主要从事植物病害综合防治研究。E-mail: hua nglili1@ ho t mail. com
reached t h e peak 21 d after cult uring t h e fu ng us. T he enzy me activit ies in t he cult ure filtrat e w ith b eef
ext ract decreased gr aduall y during t he cult u re st ag e.T h e best ca rb on and n itr og en co mb in at io n in t he
me diu m fo r e nzym e act iv itie s w as be ef e x act and w heat leave det ect ed 7 d a fte r cu ltur ing t he f ung us .
Key words: t ake-all pat h ogen o f w heat ; Ga eum annomy ces gr aminis va r . tritici ;-1, 3-g lucanases; M S
medium;ca rbo n so urc e;nit rog en sour ce
小麦全蚀病是由禾顶囊壳小麦变种
(G aeumannomyces g r amin is ( S acc. ) von . A rx an d
O livier v ar . tr itici Walk er) 侵染小麦引起的重要根
茎部病害,主要引起黑根、分蘖减少、枯白穗等症状,
造成严重的产量和经济损失。由于该病在世界小麦
种植区广泛分布,且在小麦生育期均可危害,加之没
有免疫和高抗品种,使得病害防治更加困难。国内外
植物病理工作者在小麦全蚀病的化学防治、生物防
治、致病机理等方面已经进行了大量的研究工
作[ 1-8],基本明确了小麦全蚀病菌侵染过程的细胞学
行为以及细胞壁降解酶在致病过程中的作用[ 5-8] ,特
别是对病菌分泌的纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶在
侵染、致病过程中的作用进行了研究,但目前关于小
麦全蚀病菌分泌胞外
-1, 3-葡聚糖酶及其与致病过
程的关系研究报道甚少。
本课题组在对受小麦全蚀病菌侵染的根组织进
行细胞化学研究时证实,小麦根组织受侵染后产生
的防御反应结构——“木质管(l ig n in -
tube)”中含有
大量的
-1, 3-葡聚糖[ 9-10] ,据此推测小麦全蚀病菌在
穿透木质管的过程中可能会分泌胞外-1, 3-葡聚糖
酶,以降解-1, 3-葡聚糖,达到穿透木质管而入侵、
扩展和定殖的目的。另外,采用液体发酵方法培养小
麦全蚀病菌,用生物化学方法已经证实培养滤液中
含有病菌分泌的胞外-1, 3-葡聚糖酶[ 11] ,但由于该
酶产量少、活性低,分离纯化困难,所以目前仍未明
确其酶学性质、结构及其功能。因此,本研究在前期
工作的基础上,筛选有利于产酶的培养基,为进一步
研究小麦全蚀病菌胞外 -1, 3-葡聚糖酶的性质、结
构,揭示其在病菌侵染、致病过程中的作用奠定基
础。
1 材料与方法
1. 1 材 料
1. 1. 1 供试菌种 禾顶囊壳小麦变种
Gaeumannomy ce s gr aminis var .trit ici (Ggt ) 9826 菌
株,由西北农林科技大学植物病理研究所提供。病菌
按常规方法在P DA 平板培养基上繁殖、保存备用。
1. 1. 2 基础培养基 液体发酵产酶培养基(改进的
M S 液体培养基) , 参考 V an Ho o f 等[ 12] 和 王旭丽
等[ 11] 的方法。
1. 1. 3 供试碳源 将1. 1. 2 改进的M S 液体培养基
中的麸皮分别改为收获后晒干的小麦茎秆、叶片及
玉米根系、茎秆和叶片,用量为1 % 。
1. 1. 4 供试氮源 将1. 1. 2 改进的M S 液体培养基
中的酵母浸膏分别改为牛肉膏、蛋白胨、硝酸铵、氯
化铵,用量为1% 。
1. 1. 5 化学试剂及来源 昆布多糖( L am inar in) 为
S igm a 公司产品,其他试剂均为国产。
1. 2 方 法
1. 2. 1 培养方法 将在PDA 平板培养基上黑暗培
养( 26 ℃) 3～5 d 的小麦全蚀病菌,用打孔器取直径
5mm 的菌饼4块,放入装有50 m L 液体培养基的
150 mL 三角瓶中,设3个重复,置恒温摇床振荡培
养( 26 ℃、150 r/ min, 黑暗)。并根据不同碳、氮源设
为不同处理。
1. 2. 2 酶液的提取 分别在振荡培养 7, 14, 21 d
时,于无菌条件下吸取培养液, 4 ℃、10 000 r/m in
离心5 min, 取上清液备用。
1. 2. 3 酶活性的测定 酶活性的测定采用 3, 5-二
硝基水杨酸(DNS)比色法。取0. 05 m o l/L pH 5. 5
的乙酸钠-乙酸缓冲液配制的 0. 1% 底物昆布多糖
100 L , 37 ℃水浴预热5 min 后加入10 0 L酶液,
混匀,置37 ℃保温30 min。采用DNS 法测定生成的
还原性糖[ 11] 。
一个酶活力单位(U)定义为: 37 ℃,每min 分解
底物昆布多糖产生1m ol 葡萄糖的酶量。
2 结果与分析
2. 1 以小麦组织为碳源对产酶的影响
由图1可以看出,分别以小麦茎秆、叶片为碳源
与牛肉膏、蛋白胨、硝酸铵、氯化铵组合,培养滤液中
小麦全蚀病菌胞外
-1, 3-葡聚糖酶活性在不同培养
时间、不同组合之间明显不同。从图1a可以看出,以
小麦茎秆与牛肉膏组合,培养滤液中 -1, 3-葡聚糖
酶活性在病菌培养7 d 时较高,为0. 062 U / mL , 明
显高于其他组合, 14 d时酶活性略有下降( 0. 0 6 U/
111
第2期 余永廷等:不同碳、氮源组合对小麦全蚀病菌产生胞外
-1, 3-葡聚糖酶的影响
mL ) , 但仍然高于其他组合,到21d时酶活性下降至
0. 051 U/mL ,较第7天下降了17. 7% 。以小麦茎秆
与蛋白胨组合,培养滤液中-1, 3-葡聚糖酶活性在
病菌培养过程中呈明显上升趋势, 7 d 时酶活性较
低,只有 0. 027 U/m L , 14 d时酶活性为0. 044 U/
m L , 较第 7天时增加了63. 0% , 到21 d 时酶活性继
续上升,较第 7天时增加了 12 2. 2 % , 达到0. 06 U/
m L 。而以小麦茎秆与硝酸铵和氯化铵的组合,培养
滤液中-1, 3-葡聚糖酶活性在整个病菌培养过程中
均较低,且酶活性变化不大。
图1 以小麦组织为碳源时不同氮源对小麦全蚀病菌产生胞外-1, 3-葡聚糖酶的影响
-◇- . 牛肉膏; - ●- . 蛋白胨; - △- . 硝酸铵; - □- . 氯化铵;a.小麦茎秆;b.小麦叶片
Fig . 1 Ex tra ce llula r -1, 3-gluc an as e activit y det e cted in t he dif f ere nt m edia of wh eat s talk as the sin g le
C arbo n so u rce an d beef ex t ract , p ept one , N H 4
NO4and N H4Cl as ni tro g en so ur ce, respect ivel y , in t he diff e rent incu bat ion t ime
-◇- . Beef e x t ract ; - ●- . Pe pt o ne ; - △- . amm onium nitr ate; - □- . A mmonium chlo rine ; a. Wheat st alk; b . Whe at leaves
由图 1 b 可以看出,小麦叶片与牛肉膏组合,培
养滤液中-1, 3-葡聚糖酶活性在病菌培养过程中呈
逐渐下降趋势;以小麦叶片与蛋白胨组合,培养滤液
中
-1, 3-葡聚糖酶活性在病菌培养过程中呈明显上
升趋势;以小麦叶片为碳源与牛肉膏、蛋白胨组合
时,培养滤液中
-1, 3-葡聚糖酶活性在病菌培养过
程中均高于小麦茎秆与牛肉膏、蛋白胨组合。以小麦
叶片为碳源与硝酸铵和氯化铵组合,培养滤液中
-1, 3-葡聚糖酶活性在整个病菌培养阶段均较低,
且酶活性变化不大。从图1还可以看出,以硝酸铵和
氯化铵为氮源时,-1 , 3 -葡聚糖酶活性在病菌培养
期间明显低于以牛肉膏和蛋白胨为氮源,说明有机
氮较无机氮有利于小麦全蚀病菌胞外
-1, 3-葡聚糖
酶的产生。
2. 2 以玉米组织为碳源对产酶的影响
由图2可以看出,以玉米茎秆、叶片及根系分别
为碳源,与牛肉膏、蛋白胨、硝酸铵、氯化铵组合,小
麦全蚀病菌胞外 -1, 3-葡聚糖酶活性在小麦全蚀病
菌不同培养时间、不同组合之间明显不同。从图2 a
可以看出,以玉米茎秆与牛肉膏组合,培养滤液中-
1, 3-葡聚糖酶活性在病菌培养过程中呈逐渐下降趋
势,在7d时最高,为0. 057 U/m L, 14 d之后酶活性
明显下降, 21 d时酶活性下降至0. 03 U/mL ,较第7
天时下降了47. 4% , 且明显低于其他组合;而以蛋白
胨为氮源的组合酶活性呈现升高趋势,7d时酶活
性为0. 037 U/mL , 1 4 d时达到0. 049 U/mL ,较第7
天时升高了13. 3% , 21 d时酶活性上升至0. 075 U/
m L ,明显高于其他组合;以硝酸铵及氯化铵为氮源
的组合酶活性均较低( 0. 0 21～0. 027 U/mL ) , 在病
菌培养过程中酶活性虽有上升,但幅度较小。
以玉米叶片为碳源与不同氮源组合,在不同培
养时间-1, 3-葡聚糖酶活性变化趋势以及酶活性水
平与以玉米茎秆为碳源时相似(图2 b ) 。以蛋白胨为
氮源, 21 d 时以玉米叶片为碳源的酶活性比以玉米
茎秆为碳源的低10. 7% ; 以硝酸铵为氮源, 21 d 时
以玉米叶片为碳源的酶活性比以玉米茎秆为碳源的
高11. 1 % 。
从图2c可以看出,以玉米根系为碳源与牛肉膏
组合,
-1, 3-葡聚糖酶活性水平在不同时间与以玉
米茎秆、叶片为碳源的相似,酶活性在14 d 时比7 d
时略高,之后明显下降;以蛋白胨为氮源的组合,酶
活性水平在不同时间均较以玉米茎秆、叶片为碳源
的组合低,在21 d 时相差更明显,分别比二者低35.
8% 和42. 7% , 且酶活性在培养期间增幅较小, 14 和
21 d 的酶活性分别较7 d 时增长12. 9% 和38. 7% ;
以硝酸铵及氯化铵为氮源的组合,酶活性水平均比
以玉米茎秆、叶片为碳源的组合低,酶活性变化趋势
112 西北农林科技大学学报(自然科学版)第35 卷
也与二者不同。
图2 以玉米组织为碳源时不同氮源对小麦全蚀病菌产生胞外
-1, 3-葡聚糖酶的影响
-◇- . 牛肉膏; - ●- . 蛋白胨; - △- . 硝酸铵; - □- . 氯化铵;a.玉米茎秆;b.玉米叶片;c.玉米根系
Fig . 2 Ext r a cellul ar -1, 3-g lucana se a ctiv it y d et ect ed in th e dif fe ren t media of ma ize s t alk as t he s ingle
C arbo n so u rce an d beef ex t ract , p ept one , N H 4
NO4and N H4Cl as ni tro g en so ur ce, respect ivel y , in t he diff e rent incu bat ion t ime
-◇- . Beef ex tr act; - ●- . P e pt o ne; - △- . a mmo niu m n itr ate ; - □- . A mmonium chlo rine;a.M aize st al k;b.M a ize l eav es ;c.M aize r oo t s
从图2还可以看出,以玉米茎秆、叶片及根系为
碳源,有机氮明显较无机氮有利于小麦全蚀病菌胞
外-1, 3-葡聚糖酶的产生;以牛肉膏为氮源,在病菌
培养早期酶活性较高;以蛋白胨为氮源,在病菌培养
后期酶活性较高;以硝酸铵和氯化铵为碳源,无论何
种供试氮源均不利于病菌产酶。
综合以上结果可以看出,以小麦茎秆、叶片及玉
米茎秆、叶片和根系为碳源与不同氮源组合,-1, 3-
葡聚糖酶活性受碳源的影响较小而受氮源的影响较
大,有机氮明显比无机氮有利。从培养时间来看,以
牛肉膏为氮源时在培养初期即可获得较高的酶活
性,较王旭丽等[ 11] 报道的培养时间缩短了2倍,更有
利于酶的分离纯化。
3 讨 论
小麦全蚀病菌侵染过程的细胞化学研究结果显
示,病菌的侵染过程可能涉及-1, 3-葡聚糖酶[ 9-10] ,
该病菌在液体培养过程中也能够产生胞外-1, 3-葡
聚糖酶[ 11] 。因此,为了分离纯化出足量的小麦全蚀
病菌胞外
-1, 3-葡聚糖酶,明确该酶在病菌侵染过
程中的作用,以及为抗病基因工程研究提供物质基
础,首先应筛选出产酶培养基和利于小麦全蚀病菌
分泌胞外
-1, 3-葡聚糖酶的条件。
利于不同植物病原真菌生长和产生胞外-1, 3-
葡聚糖酶的碳、氮源不同,如大麦葡聚糖或茯苓多糖
有利于里氏木霉菌(T rich od er ma ree se i)产生胞外-
1, 3-葡聚糖酶,但在以葡萄糖为碳源的培养基中产酶
量较少[ 13] ;燕麦麸皮和酵母浸膏利于炭色旋孢腔菌
(Cochl iob ol us carbonum )产酶,少量蔗糖则抑制其产
酶[ 12] ;而San to s 等[ 14] 利用以葡萄糖和硝酸钠分别为
碳、氮源的查氏( Czapek) 培养基培养意大利青霉菌,
使其产生胞外-1, 3-葡聚糖酶,但同时研究发现培养
基中过量的葡萄糖会抑制意大利青霉菌产酶,王旭丽
等[ 11] 在研究小麦全蚀病菌产酶条件筛选时也发现,
葡萄糖和蔗糖会抑制病菌分泌胞外-1, 3-葡聚糖酶,
以小麦麸皮和牛肉膏分别为碳、氮源的组合比其他组
合更利于产酶。本研究发现,供试各组合中以牛肉膏
为氮源,小麦叶片为碳源的组合最好,在病菌培养早
期-1, 3-葡聚糖酶活性就达到较高水平。这些研究结
果对前期的结果是很好的补充和完善。
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