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Azospirillum: Cell physiology, plant response, agronomic and environmental research in Argentina

Authors:
1
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3
Azospirillum sp.: cell physiology,
plant interactions and agronomic research
in Argentina
Fabricio Dario Cassán & Inés García de Salamone
EDITORES
Asociación Argentina de Microbiología
República Argentina
2008
I International Workshop on Azospirillum:
CELL PHYSIOLOGY, PLANT RESPONSE AND AGRONOMIC
RESEARCH IN ARGENTINE 2007
Desarrollado del 12 al 13 de Octubre de 2007. Córdoba. Argentina.
asociación
argentina de
microbiología
4
Cassán, Fabricio Darío. Azospirillum sp. : cell physiology, plant interactions and agronomic research in
Argentina / Fabricio Darío Cassán e Inés García de Salamone
1a ed.
Buenos Aires : Asoc. Argentina de Microbiología, 2008.
276 p.; 15x23 cm.
ISBN 978-987-98475-8-9
1. Microbiología. 2. Azospirillum. I. Cassán Fabricio, II. García de Salamone, Inés II. Título
CDD 579.16
Fecha de catalogación: 16/04/2008
Azospirillum sp.: cell physiology, plant interactions and agronomic
research in Argentina
Fabricio Darío Cassán e Inés García de Salamone (compiladores)
Primera Edición: Abril de 2008
Tirada: 200 ejemplares
Queda hecho el depósito que marca la ley 11.723
Impreso en Argentina - Printed in Argentina.
Queda prohibida la reproducción total o parcial del texto de la presente obra en cualquiera de sus
formas, electrónica o mecánica, sin el consentimiento previo y escrito del Autor.
5
Comisión Organizadora del
IWA 2007
Dr. Fabricio Dario Cassán
Dra. Inés García
Bioq. Claudio Penna
Ing. Carlos Bonfiglio
Ing. Agr. Ada Albanesi
Ing. Agr. Silvia Benintende
Lic. Lina Lett
Ing. Agr. Alejandro Perticari
Ing. Agr. Silvia Toresani
Ing. Agr. María Iglesias
Mic. Oscar Masciarelli
Dr. Edgardo Jofré
Dr. Walter Giordano
AAM
COMISION DIRECTIVA
Presidente Jorge Santoianni
Vicepresidente Horacio Frade
Secretario Adriana Sucari
Secretario de actas Manuel Boutureira
Prosecretario Marta Tokumoto
Tesorero Manuel Gómez Carrillo
Protesorero Adriana De Paulis
Vocal titular 1º Ricardo Negroni
Vocal titular 2º Claudio Penna
Vocal titular 3º Ana María Casimiro
Vocal titular 4º Maria Cecilia Freire
Vocal Suplente 1º Marta Rivas
Vocal Suplente 2º Alejandra Picconi
Vocal Suplente 3º Marta Rocchi
Vocal Suplente 4º Emma Sutich
6
La publicación de esta obra ha sido posible gracias al apoyo de las siguientes empre-
sas e instituciones:
Empresas
Instituciones
SMAyA
SUBCOMISIÓN DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y AMBIENTAL
COMISION DIRECTIVA
Coordinador: Claudio Penna
Miembros: Alejandro Perticari; Silvia Torresani; Diego Sauka; Fabricio Cassan;
Inés García de Salamone; Luis Wall; Susana Vázquez; Luis Ruberto; Claudio
Valverde
REDCAI
RED DE CONTROL DE CALIDAD DE INOCULANTES
COMISION DIRECTIVA
Coordinador: Silvia Torresani
Miembros: Claudio Penna; Alejandro Perticari; Lina Lett; Ada Albanesi;
Fernanda Gonzalez-Fiqueni; Fabricio Cassan; Silvia Benintende; Alejandro
Rossi; Jorge Chavellini
7
Índice de Contenidos
PRÓLOGO ....................................................................................................15
CAPÍTULO 1
REGULATION OF NITROGEN FIXATION IN AZOSPIRILLUM BRASILENSE ..................................17
Huergo, Luciano F.; Monteiro, Rose A.; Bonatto, Ana C.; Rigo, Liu U.; Steffens, M. B. R.; Cruz,
Leonardo M.;Chubatsu, Leda S.; Souza, Emanuel M. & Pedrosa, Fabio O.
INTRODUCTION ................................................................................................................................17
AZOSPIRILLUM BRASILENSE .........................................................................................................18
HISTORICAL PERSPECTIVE...........................................................................................................18
REGULATION OF THE NITROGEN METABOLISM .........................................................................19
The nitrogen regulation (Ntr) system of Enterobacteriaceae......................................................... 19
The Ntr system of Azospirillum brasilense.......................................................................................20
The glutamine synthetase glnA gene in Azospirillum brasilense................................................... 20
Posttranslational modification of GlnB and GlnZ by uridylylation ..................................................21
Metabolic control of nitrogenase activity ........................................................................................22
The ammonia channel protein AmtB ...............................................................................................23
The two-component regulatory systems NtrBC and NtrYX in Azospirillum brasilense .................25
Regulation of Azospirillum brasilense nifA gene expression......................................................... 25
Control of Azospirillum brasilense NifA protein activity................................................................... 26
Azospirillum brasilense mutants with constitutive nitrogenase activity ..........................................27
CONCLUDING REMARKS ............................................................................................................... 28
ACKNOWLEDGEMENTS .................................................................................................................28
REFERENCES..................................................................................................................................28
CAPÍTULO 2
BACTERIAS PROMOTORAS DE CRECIMIENTO EN PLANTAS Y MICROALGAS VERDES:
UN MODELO CONVENIENTE PARA EL ESTUDIO BÁSICO DE LAS INTERACCIONES
PLANTA-BACTERIA .............................................................................................................................. 37
de Bashan, Luz E. & Bashan, Yoav
RESUMEN ........................................................................................................................................37
INTRODUCCIÓN................................................................................................................................ 38
MATERIALES Y MÉTODOS............................................................................................................. 40
Microorganismos y condiciones axénicas de cultivo................................................................... 40
8
Fabricio Darío Cassán e Inés García Salamone
Inmovilización conjunta de los microorganismos.......................................................................... 41
RESULTADOS................................................................................................................................... 42
Construcción y operación del modelo experimental involucrando a la microalga y a la bacteria .... 42
DISCUSIÓN.......................................................................................................................................42
AGRADECIMIENTOS .......................................................................................................................43
REFERENCIAS................................................................................................................................. 44
CAPÍTULO 3
POTENCIALIDAD DE AZOSPIRILLUM EN OPTIMIZAR EL CRECIMIENTO VEGETAL BAJO
CONDICIONES ADVERSAS ................................................................................................................. 49
Barassi, Carlos A.; Sueldo, Rolando J.; Creus, Cecilia M.; Carrozzi, Liliana E.; Casanovas,
Elda M. & Pereyra, María A.
INTRODUCCIÓN................................................................................................................................49
ANTECEDENTES PREVIOS............................................................................................................50
Azospirillum y especies hortícolas .................................................................................................51
Envejecimiento de las semillas ......................................................................................................53
Perspectivas adicionales ................................................................................................................ 55
CONCLUSIONES.............................................................................................................................. 56
BIBLIOGRAFÍA..................................................................................................................................56
CAPÍTULO 4
PRODUCCIÓN DE FITOHORMONAS POR AZOSPIRILLUM SP.
ASPECTOS FISIOLÓGICOS Y TECNOLÓGICOS DE LA PROMOCIÓN
DEL CRECIMIENTO VEGETAL ........................................................................................................... 61
Cassán, Fabricio; Sgroy, Verónica; Perrig, Diego; Masciarelli, Oscar & Luna, Virginia
INTRODUCCIÓN................................................................................................................................61
Mecanismos de promoción del crecimiento vegetal en Azospirillum .........................................62
Auxinas .............................................................................................................................................62
Biosíntesis bacteriana de auxinas ..................................................................................................63
Rol fisiológico de las auxinas producidas por Azospirillum sp.................................................... 64
Giberelinas........................................................................................................................................66
Biosíntesis y Metabolismo ..............................................................................................................67
Biosíntesis y metabolismo de GAs por Azospirillum sp. en medio de cultivo ........................... 67
Biosíntesis y metabolismo rizosférico de GAs por Azospirillum sp. ........................................... 68
Rol Fisiológico de las GAs producidas por Azospirillum sp........................................................ 69
Citocininas.........................................................................................................................................70
Producción microbiana de citocininas............................................................................................71
Etileno ...............................................................................................................................................72
Producción de etileno por Azospirillum..........................................................................................73
Acido Abscísico ...............................................................................................................................74
Producción de Ácido Abscísico por Azospirillum.......................................................................... 74
Interacción de fitohormonas producidas por Azospirillum sp. y su efecto sobre el
crecimiento del sistema vegetal..................................................................................................... 75
Inoculantes a base de Azospirillum sp. y la complejidad de la respuesta vegetal.................... 75
BIBLIOGRAFÍA..................................................................................................................................78
9
ÍNDICE DE CONTENIDOS
CAPÍTULO 5
AZOSPIRILLUM BRASILENSE-PLANT GENOTYPE INTERACTIONS MODIFY
TOMATO RESPONSE TO BACTERIAL DISEASES, AND ROOT AND FOLIAR
MICROBIAL COMMUNITIES ................................................................................................................ 87
Correa, Olga Susana; Romero, Ana María; Soria, Marcelo Abel & de Estrada, Mercedes
INTRODUCTION ................................................................................................................................87
TOMATO GENOTYPE AND AZOSPIRILLUM INOCULATION INDUCED CHANGES IN
MICROBIAL COMMUNITIES ............................................................................................................88
Rhizoplane and phyllosphere communities................................................................................... 88
Rhizosphere communities............................................................................................................... 88
A. brasilense strains differentially affect changes in the physiological profiles of
microbial communities of the rhizosphere .....................................................................................88
AZOSPIRILLUM INTERACTIONS WITH PLANT PATHOGENS .......................................................90
Changes in Xanthomonas diversity on leaves............................................................................... 90
Changes in plant disease susceptibility .........................................................................................90
PLANT GENOTYPE ALSO AFFECTED THE ESTABLISHMENT OF Azospirillum ON ROOTS.... 92
CONCLUSIONS ................................................................................................................................ 93
REFERENCES..................................................................................................................................94
CAPÍTULO 6
LA PARED CELULAR COMO TARGET EN LA PROMOCIÓN DEL CRECIMIENTO DE LAS
PLANTAS POR AZOSPIRILLUM .......................................................................................................... 97
Creus, Cecilia M.; Pereyra, M. Alejandra; Molina-Favero, Celeste; Ramella, Nahuel A.;
Casanovas, E. Mabel; Pereyra, Cintia M.; Arruebarrena-Di Palma, Andrés;
Lamattina, Lorenzo; Sueldo, Rolando J. & Barassi, Carlos A.
INTRODUCCIÓN................................................................................................................................ 97
La pared celular de los vegetales.................................................................................................. 98
Expansión celular: el rol de la pared .............................................................................................99
Azospirillum modifica la extensibilidad de la pared celular ........................................................100
Azospirillum afecta la actividad de peroxidasas de la pared celular .........................................101
Óxido nítrico: ¿un nuevo factor en la interacción Azospirillum-raíces? ...................................... 101
Azospirillum produce NO por diferentes vías metabólicas......................................................... 102
Azospirillum promueve el crecimiento por un mecanismo que involucra NO...........................103
Discusión: modelo propuesto de interacción planta-Azospirillum sobre la pared celular .......104
BIBLIOGRAFIA................................................................................................................................106
CAPÍTULO 7
MOLECULAR ASPECTS OF THE POLYSACCHARIDE PRODUCTION IN
AZOSPIRILLUM BRASILENSE AND ITS ROLE IN THE ESTABLISHMENT OF
THE AZOSPIRILLUM-PLANT ASSOCIATION ................................................................................... 113
Jofré, Edgardo; Príncipe, Analía; Castro, Marina; Fischer, Sonia; Lagares, Antonio
& Gladys Mori
INTRODUCTION .............................................................................................................................. 113
A. brasilense surface components and their role during the establishment
of the plant-bacteria association.................................................................................................... 114
10
Exopolysaccharide production in A. brasilense........................................................................... 114
Flocculation..................................................................................................................................... 114
Molecular weight distribution of EPS produced by A. brasilense under
different environmental conditions ................................................................................................ 115
Saline conditions modify the monosaccharide composition of the
EPS produced by A. brasilense.................................................................................................... 116
Wheat Root exudates influence the monosaccharide ratio of the A. brasilense EPS ............... 117
Lipopolysaccharide........................................................................................................................ 117
Phenotypic and genetic characterization of the Tn5 LPS mutant A. brasilense EJ1 ..................117
Sugar analysis of the LPSs produced by A. brasilense Cd and the EJ1 mutant ...................... 119
Colonization phenotype of maize roots by Azospirillum brasilense and EJ1 mutant................. 119
Characterization of a D-alanine-D-alanine ligase (ddlB) mutant of A. brasilense ........................120
Generation of mutants affected in genes, possibly associated to LPS and EPS
biosynthesis, localized in the p90-MDa plasmid of A. brasilense...............................................123
DISCUSSION AND FUTURE PERSPECTIVES ............................................................................. 123
Does A. brasilense produce more than one EPS?..................................................................... 124
ACKNOWLEDGMENTS.................................................................................................................. 126
REFERENCES................................................................................................................................126
CAPÍTULO 8
THE GENETIC DIVERSITY OF AZOSPIRILLUM AMAZONENSE AND ITS
AGROBIOTECNOLOGICAL POTENTIAL ........................................................................................ 131
dos Santos Teixeira,Ka tia Regina; Massena Reis, Veronica; Divan Baldani, Vera Lúcia
& Baldani, José Ivo
INTRODUCTION ..............................................................................................................................131
Ecology survey of Azospirillum amazonense............................................................................... 131
Azospirillum amazonense genetic diversity.................................................................................. 132
Plant growth-promoting potential of A. amazonense ....................................................................136
CONCLUSIONS ..............................................................................................................................138
ACKNOWLEDGEMENTS ...............................................................................................................139
REFERENCES................................................................................................................................139
CAPÍTULO 9
INFLUENCIA DE LA COINOCULACIÓN AZOSPIRILLUM-RIZOBIOS
SOBRE EL CRECIMIENTO Y LA FIJACIÓN DE NITRÓGENO DE LEGUMINOSAS
DE INTERÉS AGRONÓMICO ............................................................................................................. 143
Dardanelli,Marta Susana; Rodríguez-Navarro, Dulce Nombre; Megias-Guijo, Manuel
& Okon, Yaacov
INTRODUCCIÓN.............................................................................................................................. 143
Influencia de la coinoculación con Azospirillum sobre leguminosas .........................................144
Experimentos de campo............................................................................................................... 146
Efecto de Azospirillum en la exudación de leguminosas y en la inducción de
genes de nodulación de rizobios ................................................................................................147
Efectos del estrés salino............................................................................................................... 149
CONCLUSIONES............................................................................................................................ 149
Fabricio Darío Cassán e Inés García Salamote
11
ÍNDICE DE CONTENIDOS
AGRADECIMIENTOS .....................................................................................................................150
BIBLIOGRAFÍA................................................................................................................................150
CAPÍTULO 10
ANÁLISIS DE LA PRODUCCIÓN DE CEREALES INOCULADOS CON AZOSPIRILLUM
BRASILENSE EN LA REPÚBLICA ARGENTINA ............................................................................. 155
Díaz-Zorita, Martín & Fernandez Canigia, María Virginia
INTRODUCCIÓN.............................................................................................................................. 155
Cultivos de trigo y de cebada para producción de granos........................................................157
Cereales de invierno forrajeros ....................................................................................................160
Cultivos de maíz............................................................................................................................. 161
CONCLUSIONES............................................................................................................................ 164
BIBLIOGRAFÍA................................................................................................................................164
CAPÍTULO 11
INVESTIGACIÓN APLICADA DE AZOSPIRILLUM PARA SU USO COMO
PROMOTOR DEL CRECIMIENTO EN CULTIVOS DE INTERÉS AGRONÓMICO ......................... 167
Puente, Mariana L.; García, Julia E. & Perticari, Alejandro
ANTECEDENTES DE LA INVESTIGACIÓN SOBRE AZOSPIRILLUM EN EL INSTITUTO DE
MICROBIOLOGÍA Y ZOOLOGÍA AGRICOLA (IMYZA), INTA ......................................................... 167
INFORMACIÓN DISPONIBLE DE LAS CEPAS DE AZOSPIRILLUM DE
LA COLECCIÓN IMYZA INTA PGPB................................................................................................ 168
Selección de cepas.......................................................................................................................169
EVALUACIÓN DEL AZOSPRILLUM COMO PRÁCTICA VIABLE EN EL CONTEXTO PRODUCTIVO .. 171
RESUMEN DE INVESTIGACIONES CON OTROS CULTIVOS ....................................................172
Girasol............................................................................................................................................. 172
Maíz................................................................................................................................................. 173
Hortícolas ........................................................................................................................................174
Forestales....................................................................................................................................... 175
CONCLUSION ................................................................................................................................. 177
BIBLIOGRAFÍA................................................................................................................................177
CAPÍTULO 12
25 AÑOS DE INVESTIGACIÓN DE AZOSPIRILLUM BRASILENSE AZ 39 EN ARGENTINA ........ 179
Rodríguez Cáceres, Enrique A.; Di Ciocco, César A. & Carletti, Susana M.
INTRODUCCIÓN.............................................................................................................................. 179
Aislamiento de la cepa Az 39........................................................................................................179
Ensayos de selección de cepas en invernáculo........................................................................ 181
ENSAYOS EN CONDICIONES DE CAMPO .................................................................................181
Trigo ................................................................................................................................................181
Maíz................................................................................................................................................. 183
Hortalizas ........................................................................................................................................184
Soja.................................................................................................................................................185
Otros cultivos.................................................................................................................................. 185
12
Análisis económico de la rentabilidad por el uso de inoculantes a
bases de Azospirillum brasilense Az 39......................................................................................186
Nuevas áreas de investigación.....................................................................................................186
BIBLIOGRAFÍA................................................................................................................................187
CAPÍTULO 13
UTILIZACIÓN DE INOCULANTES CON AZOSPIRILLUM BRASILENSE EN CULTIVOS
DE INTERÉS REGIONAL EN EL NORDESTE ARGENTINO ........................................................... 189
Iglesias, María Cándida; Leconte, María Corina; Sotelo, Cristina Esther & Cossoli, Marcela Rosa
RESUMEN ......................................................................................................................................189
Introducción ....................................................................................................................................189
Metodologías..................................................................................................................................191
Metodología de ensayos a campo ..............................................................................................192
Metodología de ensayos en invernáculo.....................................................................................193
Resultados de las experiencias ................................................................................................... 193
I. Algodón (Gossypium hirsutum)................................................................................................. 193
II. Sorgo (Sorghum sp.) ..................................................................................................................194
III. Maíz (Zea mays) ........................................................................................................................ 195
IV. Girasol (Helianthus annuus)...................................................................................................... 195
V. Trigo (Triticum aestivum)........................................................................................................... 196
VI. Soja (Glycine max)....................................................................................................................197
VII .Hortalizas.................................................................................................................................. 197
VIII. Flores.......................................................................................................................................199
IX. Pasturas .....................................................................................................................................200
X. Casos Particulares..................................................................................................................... 201
CONSIDERACIONES .....................................................................................................................201
EXPERIENCIAS LOCALES............................................................................................................ 201
BIBLIOGRAFÍA................................................................................................................................205
CAPÍTULO 14
ECOFISIOLOGÍA DE LA RESPUESTA A LA INOCULACIÓN CON AZOSPIRILLUM
EN CULTIVOS DE CEREALES .......................................................................................................... 209
García de Salamone, Inés Eugenia & Monzón de Asconegui, María Azucena
INTRODUCCIÓN.............................................................................................................................. 209
ENSAYOS DE TRIGO..................................................................................................................... 211
ENSAYOS DE MAIZ.......................................................................................................................214
SÍNTESIS Y PERSPECTIVAS........................................................................................................221
BIBLIOGRAFÍA................................................................................................................................221
CAPÍTULO 15
INOCULANTS BASED ON NITROGEN-FIXING BACTERIA AZOSPIRILLUM SPP.
AND THEIR APPLICATION IN TROPICAL AGRICULTURE............................................................ 227
Divan Baldani, Vera Lúcia; Silva Ferreira, Joilson; dos Santos Teixeira, Kátia Regina; Baldani,
José Ivo & Verônica Massena Reis
INTRODUCTION ..............................................................................................................................227
Fabricio Darío Cassán e Inés García Salamone
13
ÍNDICE DE CONTENIDOS
THE ROLE OF BACTERIA TO PLANT GROWTH PROMOTION AND THE POTENTIAL OF BNF .... 228
FACTORS AFFECTING INOCULANTS EFFICIENCY ....................................................................228
OVERVIEW OF AZOSPIRILLUM BASED INOCULANTS IN THE WORLD WITH
ENPHASIS IN LATIN AMERICA .....................................................................................................229
PLANT RESPONSE TO AZOSPIRILLUM INOCULATION ............................................................. 230
FACTORS DETERMINATING INOCULANT QUALITY ....................................................................231
FUTURE PERSPECTIVES............................................................................................................. 233
ACKNOWLEDGEMENTS ...............................................................................................................233
REFERENCES................................................................................................................................234
CAPÍTULO 16
INOCULACIONES CON AZOSPIRILLUM BRASILENSE EN
PRODUCCIONES AGRÍCOLAS DEL NOA ........................................................................................ 239
Bellone, Carlos Hugo & de Bellone, Silvia Carrizo
INTRODUCCIÓN.............................................................................................................................. 239
AISLAMIENTOS DE Azospirillum EN DIFERENTES VEGETALES..............................................239
INOCULACIONES ...........................................................................................................................240
RESPUESTAS A LAS INOCULACIONES ...................................................................................... 240
INOCULACIONES A LEGUMINOSAS ............................................................................................243
PRODUCCIÓN DE PARA-NÓDULOS ............................................................................................243
BIBLIOGRAFÍA................................................................................................................................244
CAPÍTULO 17
UTILIZACIÓN DE INOCULANTES A BASE AZOSPIRILLUM BRASILENSE,
EN ESPECIES AGRÍCOLAS DE INTERÉS EN URUGUAY.
LA EXPERIENCIA CON EL MAÍZ ...................................................................................................... 251
Hoffman, Esteban; Mazzilli, Sebastián & Mesa, Pablo
INTRODUCCIÓN.............................................................................................................................. 251
Condiciones contrastantes para evaluar la respuesta vegetal ................................................... 252
Producción de biomasa en respuesta a la inoculación.............................................................. 252
Rendimiento y componentes ........................................................................................................ 254
Absorción de nitrógeno y N en grano.......................................................................................... 257
Comentarios finales........................................................................................................................258
BIBLIOGRAFIA................................................................................................................................259
CAPÍTULO 18
RESPUESTA DE MAÍZ A LA INOCULACIÓN CON AZOSPIRILLUM ..............................................261
Casaretto, Esteban & Labandera, Carlos
INTRODUCCIÓN.............................................................................................................................. 261
ANTECEDENTES ...........................................................................................................................261
OBJETIVOS .................................................................................................................................... 262
PARÁMETROS UTILIZADOS.......................................................................................................... 262
RESULTADOS................................................................................................................................. 262
14
Fabricio Cassán e Inés García Salamote
Ensayos de Invernáculo................................................................................................................262
ENSAYOS DE CAMPO.................................................................................................................. 265
CONCLUSIONES Y DISCUSIÓN ................................................................................................... 268
BIBLIOGRAFÍA................................................................................................................................268
15
La identificación y posible manipulación de rizobacterias promotoras del crecimiento, así como su
asociación con plantas superiores, ha sido motivo de numerosas publicaciones en todo el mundo.
Entre las asociaciones más exitosas, se describen aquellas establecidas entre gramíneas o no-legu-
minosas y bacterias rizosféricas de los géneros Pseudomonas, Bacillus, Azotobacter y Azospirillum. La
bibliografía en general, considera a Azospirillum como uno de los géneros bacterianos más importan-
tes en mejorar el crecimiento y en incrementar el rendimiento de un gran número de especies cultiva-
bles en todo el mundo. Inicialmente, esta bacteria captó la atención de los investigadores debido a su
capacidad de colonizar de manera endofítica ciertas gramíneas forrajeras e incrementar su productivi-
dad desde la perspectiva de la fijación biológica de nitrógeno. En la actualidad, se han publicado
numerosos reportes sobre la capacidad de Azospirillum para colonizar otras especies vegetales ante-
riormente no descriptas y promover su crecimiento o incrementar su productividad, por la existencia
de otros mecanismos de promoción del crecimiento, tal como la producción de fitohormonas, que de
manera individual o integrada a la fijación biológica de nitrógeno, determinan un efecto global. Esta
visión contemporánea ha permitido en la actualidad, materializar la aplicación tecnológica dentro de un
modelo de agricultura sustentable, basado en la utilización de este género bacteriano, como una
estrategia de menor impacto ambiental para incrementar la productividad de ciertos cultivos de interés
económico o ecológico nacional. A su vez, esta nueva concepción tecnológica, ha conducido a los
investigadores de nuestro país abocados a la temática, a concentrar esfuerzos para dilucidar las
bases bioquímicas y moleculares que determinan la capacidad bacteriana de promover el crecimien-
to vegetal, con el fin de generar metodologías más eficientes para la selección de cepas destinadas
a la formulación de inoculantes, así como en la generación de nuevas herramientas para su posterior
control de calidad. Si bien, la capacidad de este microorganismo para inducir el crecimiento vegetal,
ha sido comprobada en decenas de experimentos en condiciones sumamente contrastantes, el me-
canismo predominante por el que Azospirillum sp. modificaría el desarrollo o la productividad agrícola,
aún es motivo de debate dentro de la comunidad científica especializada. Entre los más estudiados
se consideran aquellos en los que el efecto dependería exclusivamente del aporte bacteriano de
nutrientes o compuestos reguladores del crecimiento, tal como la fijación biológica de nitrógeno o la
producción de fitohormonas y aquellos en los que el efecto dependería de la capacidad de la bacteria
para impedir el crecimiento de ciertos organismos fitopatogénicos, tal como la antibiosis o la produc-
ción de sideróforos. La integración de este modelo, supone la participación de todos y cada uno de
los mecanismos propuestos de forma individual o integrada, en diferentes momentos de la interacción
y en diferente magnitud de acuerdo a las condiciones rizosféricas o tisulares predominantes. Este
modelo se conoce como hipótesis aditiva de la promoción del crecimiento vegetal y fue propuesto
por Bashan and Levanony en el año 1990. Sobre la base de estos antecedentes y bajo la necesidad
imperiosa de generar un estado de situación actual sobre las diferentes líneas de investigación y el
impacto agronómico del uso de Azospirillum sp. en nuestro país, se desarrolló en la ciudad de Córdo-
Prólogo
16
ba (RA) en el mes de octubre de 2007 el «I Workshop on Azospirillum: cell physiology, plant response
and agronomic research in Argentine», organizado por la Subcomisión de Microbiología Agrícola y
Ambiental de la Asociación Argentina de Microbiología y cuyos objetivos fundamentales fueron: (a)
avanzar sobre la comprensión de las bases bioquímicas y fisiológicas de la promoción del crecimien-
to vegetal por Azospirillum sp.; (b) discutir estrategias y modelos de aplicación agrícola tendientes a
incrementar la productividad de ciertos cultivos de interés económico regional y (c) conocer aspectos
científico-tecnológicos de la producción industrial y del control de calidad de inoculantes. Sobre estos
objetivos, se funda la primera edición de esta obra, que resulta de la participación directa de los
principales actores del primer workshop en Azospirillum sp. desarrollado en Argentina y que no solo
incluye a excelentes investigadores o grupos de trabajo de nuestro país, sino que adicionalmente
contiene el aporte de reconocidos investigadores extranjeros con una amplia trayectoria en la temáti-
ca. En tal sentido, queremos destacar la participación de los doctores Yoav Bashan y Jesús Caballe-
ro-Mellado de México; Jacobo Okon de Israel; Fabio Pedroza, Katia Texeira y Vera Baldani de Brasil;
Dulce Nombre Rodríguez-Navarro y Manuel Megias-Guijo de España, así como así como Carlos
Labandera y Esteban Hoffman de Uruguay, que sumaron de manera desinteresada y entusiasta su
basta experiencia y reconocimiento, a los fines de esta obra.
Fabricio Darío Cassán e Inés García Salamone
Editores
Fabricio Darío Cassán e Inés García Salamone
17
REGULATION OF NITROGEN FIXATION IN AZOSPIRILLUM
BRASILENSE
Huergo, Luciano F.; Monteiro, Rose A.; Bonatto, Ana C.; Rigo, Liu U.; Steffens, M. B. R.; Cruz,
Leonardo M.; Chubatsu, Leda S.; Souza, E. M. & Pedrosa, Fabio O.
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal do Paraná, Curitiba, PR, Brazil.
E-mail: fpedrosa@ufpr.br
INTRODUCTION
Biological nitrogen fixation is the process of reduction of dinitrogen (N2) to ammonia by the enzyme
complex nitrogenase. The minimal stoichiometry of the reaction for the reduction of one mol of N2
requires a minimum of 16 mols of ATP and 4 electron pairs to produce one mol of ammonium. This is
equivalent to 28 mols of ATP per mol of ammonium produced by aerobic diazotrophs. In practical
terms, to produce 100kg of ammonium, aerobic nitrogen-fixing bacteria require the energy equivalent
of 750 kg of sugar. Due to this high energy demand for nitrogenase activity and synthesis, nitrogen
fixation is strictly regulated and controlled. The two primary environmental effectors or modulators of
nitrogenase synthesis and activity in Azospirillum brasilense, as in other free-living (associative or
endophytic) diazotrophs, are ammonium ions (NH4+) and oxygen (O2).
Transcription of the nitrogen fixation genes (nif genes) in Proteobacteria is activated by the NifA
protein, whose nifA gene expression is under different, complex and species-specific regulatory
mechanisms. In Klebsiella pneumoniae, Azotobacter vinelandii and Herbaspirillum seropedicae, the
nifA promoter is under control of the general nitrogen regulation system, the Ntr system, through the
direct action of the transcriptional activator, NtrC (for a review see Pedrosa, Elmerich 2007). In A.
brasilense, on the other hand, NtrC is not involved in the activation of the nifA gene promoter, thus
escaping from fixed nitrogen (NH4+) repression. The activity of the NifA protein of A. brasilense and H.
seropedicae is controlled by a signal transduction protein of the PII family in response to fluctuations
in the NH4+ levels. The NifA proteins from these organisms are also affected by molecular oxygen,
which inactivate them apparently through direct interaction with a putative FeS cluster present in the
Central-C-terminal region. Once synthesised, nitrogenase activity of A. brasilense, as those of other
Rhodospirillales, is reversibly inactivated in vivo by NH4+ or anaerobiosis. This inactivation involves
ADP-ribosylation of the Fe-protein (dinitrogenase reductase) catalysed by dinitrogenase reductase
ADP-ribosyltransferase (DraT) and is reversed, upon NH4+ exhaustion, by dinitrogenase reductase
activating glycohydrolase (DraG). The involvement of the GnB, GlnZ and AmtB proteins in this process
in A. brasilense has been recently revealed. An additional mechanism of transient inhibition of
Capítulo 1
18
nitrogenase by NH4+, probably involving membrane depolarization and/or diversion of electron, is
also operational in A. brasilense, H. seropedicae (which lacks the ADP-ribosylation system) and other
diazotrophs. The metal clusters of the nitrogenase are highly sensitive to oxygen and readily inactivated
by air, thus aerobic diazotrophs have developed strategies to avoid irreversible inactivation of the
nitrogenase proteins dinitrogenase reductase and dinitrogenase (MoFe protein) by molecular oxygen.
AZOSPIRILLUM BRASILENSE
Azospirillum brasilense are aerobic nitrogen-fixing bacteria or diazotrophs, α-Proteobacteria, Gram
negative, motile, spiral form, with polar flagellum in liquid and polar flagellum and lateral cilia in solid
media. They are capable of carrying on all pathways of the nitrogen cycle, except nitrification. These
bacteria are typical chemoorganotrophic bacteria, positive for uptake hydrogenase, produce
phytohormones such as auxins, giberellins and cytokinins, fix N2 under tropical conditions (30-40oC),
can colonize the tissues of maize, wheat, rice, sorghum and non-graminaceous plants as facultative
endophytes, and occur mostly as rhizospheric diazotrophs (Döbereiner, Pedrosa 1987).
Bacteria of the genus Azospirillum are found almost everywhere on Earth. Contrary to the symbiotic
bacteria such as the rhizobia that secretes practically all fixed nitrogen when in symbiosis, the free-
living, whether associative or endophytic, diazotrophs have a limited though significant capacity to
secrete or transfer fixed nitrogen to the associated plant, as revealed by 15N dilution techniques and
15N incorporation studies. The important role of A. brasilense and other Azospirillum species as plant
growth promoting bacteria is also due to phytohormones production and protection against
phytopathogens. The best studied species are A. brasilense strains Sp7 and derivatives. Plant
inoculation, mainly cereals and grasses, with A. brasilense lead to strong promotion of the development
of the root system with increases in density and length of root hairs and in the number and volume of
lateral roots; significant increases in nutrient absorption by the host plant (K+, Ca2+, PO43-, H2O, etc),
increase in plant resistance to water stress (draught resistance) and increase in root respiration
through the activation of enzymes of the glycolytic pathway and of the citric acid cycle, increase in
stem diameter and leaf width in maize, acceleration of N-mobilization of seed and plantlet growth
(increased precocity) and early flowering. In addition, increased protection against pathogens, induction
of ammonium transport gene in tomato, increases in legume nodulation upon co-inoculation with
rhizobia.
New insights in the Azospirillum physiology, biochemistry and ecology will be unveiled in the near
future following the genome sequencing of Azospirillum brasilense Sp245 by Igor Zhulin and
collaborators.
HISTORICAL PERSPECTIVE
Genetic studies in Azospirillum spp. began with the isolation of two glutamine synthetase mutant
strains of A. brasilense strain Sp7, which had contrasting a nitrogen fixation phenotype: both were glutamine
auxotrophs but strain 7028 was Nif- whereas strain 7029 was Nif constitutive (Gauthier, Elmerich 1977).
Glutamate synthase negative mutants of strain Sp6 had lower glutamine synthetase activity, were
phenotypically Nif- and unable to utilize several N sources (Bani et al. 1980). Later, the first mutants in the
regulatory genes ntrC and nifA were isolated after N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine treatment (Pedrosa,
Yates 1983, Pedrosa, Yates 1984). These ntrC- mutants of A. brasilense strain Sp7 (FP8 and FP9)
displayed a Nif- phenotype, were unable to grow on nitrate as the sole N source and showed decreased
levels of glutamine synthetase (Pedrosa, Yates 1983, Pedrosa, Yates 1984). In addition, transconjugants
Huergo, L. F., Monteiro, R. A., Bonatto, A. C., Rigo, L. U., Steffens, M. B. R., Cruz, L. M., Chubatsu, L. S., Souza, E. M. & Pedrosa, F. O.
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of FP8 and FP9 containing the nifA gene of Klebsiella pneumoniae constitutively expressed from plasmid
pCK3, showed nitrogenase activity only partially susceptible to NH4+ «switch-off» in vivo. Insertional
ntrC::Tn5 or ntrC::lacZ-Km mutants of A. brasilense had decreased nitrogenase activities ( 60%) and
were unable to grow on nitrate as the sole N source (Liang et al. 1993, Machado et al. 1995).
The nitrogen fixation (nif) gene cluster of A. brasilense was originally cloned (Quiviger et al. 1982,
Shrank et al. 1987) and sequenced (Fani et al. 1989, Passaglia et al. 1991, Frazzon, Schrank 1998).
Mutants in some structural genes of nitrogenase complex were also obtained (nifH-, nifD-, nifK-)
(Jara et al. 1983, Pedrosa, Yates 1983, Perroud et al. 1985).
Recent research on Azospirillum spp. has been reviewed (Steenhoudt, Vanderleyden 2000, Bashan
et al. 2004, Pedrosa, Elmerich 2007, Dobbelaere, Okon 2007).
REGULATION OF THE NITROGEN METABOLISM
The regulation of the nitrogen metabolism has been studied extensively in enteric bacteria in which
a regulatory cascade, namely the nitrogen regulation system (Ntr), regulates the expression of genes
involved in the utilization of a plethora of nitrogen sources, with the sole purpose of releasing or producing
ammonium ions. A similar cascade is operational in Proteobacteria, including A. brasilense.
The nitrogen regulation (Ntr) system of Enterobacteriaceae
The nitrogen regulation (Ntr) system of Enterobacteriaceae is a multi-tier regulatory cascade involving
several genes and their products. These are: glutamine synthetase, (GS coded by the glnA gene),
uridylyltransferase (GlnD coded by the glnD gene), adenylyltransferase (GlnE coded by the glnE
gene), the signal transduction proteins of the PII family GlnB and GlnK (coded by glnB and glnK
genes), the ammonia channel protein AmtB (coded by the amtB gene), and the two-component
regulatory system NtrB-NtrC (coded by ntrB and ntrC genes, respectively).
The signal transduction proteins GlnB and GlnK are key elements of the Ntr system, acting as sensor
and signaling molecules of the prevailing nitrogen level. The PII protein uridylylation-deuridylylation
cycle is controlled by the uridylyltransferase (GlnD) which senses directly the intracellular glutamine
concentration and indirectly 2-oxoglutarate and ATP levels through the PII proteins. The conversion of
the GlnB and GlnK proteins into their uridylylated forms (GlnB-UMP and GlnK-UMP) is catalyzed by the
GlnD under NH4+-limiting conditions (low glutamine/high 2-oxoglutarate). Conversely, under NH4+ excess
(high glutamine/low 2-oxoglutarate) GlnD removes the UMP group from GlnB and GlnK (Bueno et al.
1985, Atkinson, Ninfa 1998, Jiang et al. 1998a). Both GlnB and GlnK can interact with the receptor
proteins NtrB and GlnE. The uridylylation status of the PII proteins regulates the activity of NtrB/NtrC
sensor/regulator pair. Unmodified GlnB or GlnK interact with the NtrB, a histidine auto-kinase, stimulating
its phosphatase activity that inactivates the transcription activator NtrC-P by dephosphorylation. Under
NH4+-limiting conditions, the uridylylated form of GlnB or GlnK fail to interact with NtrB, which then activates
NtrC by phosphorylation. Phosphorylated NtrC (NtrC-P) binds to specific promoter sequences and
activates pleiotropically the transcription of several nitrogen-regulated operons through interaction with
the RNA polymerase-sigma-N holoenzima (Bueno et al. 1985, Atkinson et al. 1994, Jiang et al. 1998b,
Atkinson, Ninfa 1998, Atkinson, Ninfa 1999, Jiang, Ninfa 1999). Similarly, the state of adenylylation of
glutamine synthetase is determined by the adenylyltransferase (GlnE) and reflects the intracellular levels
of nitrogen (NH4+) and the state of uridylylation of the PII proteins. The deuridylylated forms of GlnB or
GlnK interact with GlnE which then inactivates glutamine synthetase adenylylation; the uridylylated forms,
in turn, interact with GlnE which activates GS by the removal of AMP-residues (Jaggi et al. 1997, Jiang
REGULATION OF NITROGEN FIXATION IN AZOSPIRILLUM BRASILENSE
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