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!" 卷#期
!$$# 年%月生物工程学报
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国家自然科学基金（*’) G$HG$#G$）和国家重点基础研究发展规划项目（%RG）（*’) K!$$$"L"$M）资助。
应用乙二醇冷冻小鼠胚胎：优化和简化程序的探索
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罗明久，刘 娜，苗德强，兰国成，马所峰，常仲乐，谭景和
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山东农业大学动物科技学院，泰安 !R"$"M
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摘 要 提高解冻胚胎的发育能力和简化冷冻N解冻程序是胚胎冷冻研究的两大永恒的主题。尽管乙二醇（OK）广泛用于家
畜胚胎冷冻，但很少用于冷冻小鼠和人胚胎。为数很少的以 OK 慢冻小鼠或人胚胎的研究均采用较为复杂的人胚冷冻程序，
未见简化程序和用 OK 冷冻小鼠桑椹胚的报道。采用简单的牛胚胎冷冻程序研究了发育时期、
OK 浓度、平衡方法、添加蔗糖
以及解冻后脱除 OK 等对小鼠胚胎冻后发育能力的影响。结果显示：（"）致密晚期桑椹胚冻后体外培养囊胚发育率（M"[%!\ ]
![ !H\ ）和孵出率（LM[#L\ ] ![ HG\）显著（:^ $ [$#）高于 HN细胞、
MN细胞胚胎和致密早期桑椹胚胎；（!）
"[ M/’(_S OK 冷冻小鼠致
密晚期桑椹胚的囊胚发育和孵出率显著高于其它浓度；（G）在 OK 中平衡 "$/4C 的冻后囊胚发育显著好于平衡 #、
!$ 或G$/4C；
（H）两步平衡冷冻胚胎的囊胚发育率和孵出率显著高于一步平衡；（#）用 OK 冷冻小鼠胚胎无需添加蔗糖；（L）解冻后可不脱除
OK；（R）冻后发育的早期囊胚和囊胚细胞数明显少于体内发育胚胎。因此，用 OK 冷冻小鼠胚胎的最佳方案为：致密晚期桑椹
胚用 "[M/’(_S OK 不添加蔗糖、两步平衡 "#/4C、以简单的牛胚胎冷冻程序冷冻N解冻、解冻后不脱除 OK 直接培养或移植。
关键词 胚胎，冷冻，乙二醇，小鼠
中图分类号 2G%![ "" 文献标识码 :文章编号 "$$$NG$L"
（!$$#）
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在用体外受精及相关技术治疗人类不孕症时，
每次移植的胚胎数已由 K枚减少到 C枚
［9］
。而且，
更趋于每次移植一枚囊胚
［C］
。因此，剩余胚胎的保
存迫切需要高效胚胎冷冻技术。由于用人胚胎进行
实验涉及伦理道德问题，故胚胎冷冻研究多用小鼠
进行。过去，人和小鼠胚胎冷冻多采用丙二醇（9，
CE
?0.?)/&8-.(，
M"）
［AEG］
。目前，乙二醇（!+%5(&/& 2(54.(，
!"）广泛应用于家兔
［O］
、牛
［P］和绵羊
［;］
的胚胎冷冻。
!" 对于动物胚胎的低毒性
［P，
Q，
9>，
99］和冷冻胚胎出生
正常后代
［99E9A］都说明，它可以用于人的胚胎冷冻。
尽管近年来已开始探索用 !" 冷冻小鼠胚胎，但这
些研究均是采用较为复杂的人胚胎冷冻E解冻程序
进行的，尚未见进行 !" 冷冻小鼠胚胎程序简化研
究的报道。
以往对人和小鼠胚胎冷冻的研究多冷冻 CE R ;E
细胞胚胎，并取得了满意的效果
［9KS 9O］
。然而，由于
胚胎基因组一般在 KE R ;E细胞以后才激活
［9P］
，故受
精卵和早期卵裂胚胎发育到囊胚的能力很差，于是
人们对囊胚冷冻也进行了大量研究
［9;ECG］
。然而，囊
胚的冷冻效果并不好
［9Q，
C>，
CC，
CA］
。尽管就胚胎质量判
定而言，桑椹胚不如囊胚，但还是比原核和早期卵裂
胚胎好。
本实验采用比人胚冷冻程序更为简单的 !" 冷
冻牛胚胎的冷冻程序研究了胚胎发育时期、
!" 浓
度、平衡方法及冷冻液中添加蔗糖对小鼠冷冻胚胎
发育到囊胚和孵出囊胚的影响。同时，还比较了 !"
和M" 对小鼠胚胎的冷冻保护能力以及解冻后脱出
冷冻保护剂对冻胚发育的影响。为寻找更好的胚胎
冷冻保护剂和进一步简化胚胎冷冻E解冻保存技术
提供了必要的依据。
)材料与方法
)*) 小鼠胚胎的获取
O R 9> 周龄昆明白雌鼠控光（9K% 光照，
9>% 黑
暗）饲养 9 R C 周后，腹腔注射 9> LT<只MUV"
（宁波
激素制品厂）和 %W"
（宁波激素制品厂）进行超排。
注射 %W" 后与雄鼠合笼，次日早晨检查阴道栓。
见栓雌鼠分别于注射 %W" 后GC R GK%、
OG R
OO%、
PP R P;%、
;> R ;C%、
;G R ;O% 和Q> R Q9% 处死，采
集KE细胞、
;E细胞、致密早期和晚期桑椹胚以及早期
囊胚和囊胚。在实体显微镜下，
;E细胞期胚胎细胞
边缘清晰，未发生致密化（图 9W）；致密早期桑椹胚
的细胞开始相互紧靠，细胞边缘不十分清晰，但能区
分每一个细胞（图 9!）；致密晚期桑椹胚的细胞紧靠
在一起，很难区分单个细胞（图 9"）
［G］
。
)*+ 胚胎冷冻
冷冻液为含 A62<6= DVH 的UC 添加不同浓度
的!"
（天津产）或 M"
（天津产）。先将胚胎移入
>:Q6.(<= !" 中室温下平衡 G6-/，再移入 9 :;6.(<=
!" 中平衡 9>6-/，同时装入 >: CG6= 塑料细管，每管
C枚胚胎。将装有胚胎的塑料细管放入冷冻仪（日
本富士平 XYZ !$E9[）中，在 S P\下平衡 C6-/ 后植
冰并平衡 ;6-/。然后，以 S > :A\ <6-/ 的速率降至
S A>\。在 S A>\下平衡 G6-/ 后，将塑料细管投入
液氮中保存。
)*, 胚胎解冻
胚胎冷冻保存 9周后解冻。自液氮罐中取出塑
料细管，室温下于空气中停留 9> *，再置入盛有AC\
POP
罗明久等：应用乙二醇冷冻小鼠胚胎：优化和简化程序的探索
图!小鼠发育不同时期胚胎冷冻前后显微照片（ " #$$）
%&’( ! )&*+,’+-./0 ,1 2,304 425+6,0 541,+4 -78 -194+ *+6,.+404+:-9&,7 -9 8&114+479 09-’40 ,1 84:4;,.2479
（" #$$）
< -78 =：>?*4;; 425+6,0 541,+4 -78 -194+ 1+44@&7’；A -78 B：C?*4;; 425+6,0 541,+4 -78 -194+ 1+44@&7’；D -78 %：4-+;6 2,+3;-4 541,+4 -78 -194+
1+44@&7’；E -78 F：;-94 2,+3;-4 541,+4 -78 -194+ 1+44@&7’(
水浴的解冻杯中，停留 !$0。取出细管，将解冻后的
胚胎推入平皿中，再移入含 $G H2,;IJ 蔗糖的 )# 中
H2&7，最后用 )# 洗K次，以便脱除 DE。
! " # 胚胎培养
培养液为 AL=。于胚胎解冻前 # / 在培养皿中
制作 H$
!
J培养滴，覆盖石蜡油，放入 AM#培养箱中
平衡。将解冻胚胎移入培养滴中，每滴 # N K 枚胚
胎，放入 KOGHP、
HQ AM#、饱和湿度的培养箱内培养
并于不同时间观察记录囊胚发育率和孵出率。
! " $ 胚胎细胞计数
将胚胎移入含 !$
!
’I2J F,4*/09KKK># 的)# 中
处理 H2&7，装片后在荧光显微镜下观察，记录胚胎
细胞数。
! " % 统计分析
所有实验至少重复 K次以上。实验数据利用
RSRR 统计软件（RSRR T7* ( ）的 <UMV< 模块分析。数
据先 经 JRB 转换后，再进 行单因 素方差 分 析，
!W $G$H为差异显著。
&结果
& " ! 不同发育阶段小鼠胚胎 ’( 冷冻后的发育
将>?细胞、
C?细胞、致密早期和晚期桑椹胚在
$GX2,;IJ DE 中平衡 H2&7，再移入 ! GC2,;IJ DE 中平
衡!$2&7，装入 $G#H2J 塑料细管中冷冻。>?细胞和
C?细胞胚胎放入冷冻液后卵裂球因脱水而收缩，细
胞间距离和卵周隙增大（图 != 和B）。致密早期桑
椹胚放入冷冻液后，细胞间界限更清晰（图 !%）。致
密晚期桑椹胚在冷冻液中体积变小，但细胞不分离
（图 !F）。解冻脱除冷冻液后，大部分胚胎能恢复到
冷冻前的状态，但细胞质内常出现小颗粒。
冻后胚胎体外培养结果（表 !）显示，致密晚期
桑椹胚的囊胚发育率（C!G X#Q Y #G#>Q）和孵出率
（ZCG HZQ Y # G>KQ）均显著（!W $ G$H）高于其他时期
胚胎。>?细胞、
C?细胞和致密早期桑椹胚的囊胚率
差异不显著，但 C?细胞胚胎的囊胚孵出率显著高于
>?细胞和致密早期桑椹胚。
& " & ’( 浓度对冷冻)解冻胚胎发育的影响
致密晚期桑椹胚在 $GX2,;IJ DE 中平衡 H2&7
后，移入 $G X、
!GC、
#GO 和K G Z2,;IJ DE 中平衡 !$ 2&7
后冷冻。解冻后体外培养的囊胚发育率和囊胚孵出
率以 !G C2,;IJ 的最高（C$ GCKQ Y #G#$ Q 和OHG$$Q
Y #G$>Q），极显著（!W $ G$!）高于其它组（表 #）。
& " * 平衡时间对冷冻小鼠胚胎发育的影响
致密晚期桑椹胚在 $GX2,;IJ DE 中平衡 H2&7，
移入 !GC2,;IJ DE 中平衡不同时间后冷冻。在
!GC2,;IJ DE 中平衡!$2&7 的囊胚发育率（C$G XOQ Y
>G!>Q）显著（!W $G$H）高于平衡 K$2&7 的（ZZ GKHQ
Y !G>HQ），囊胚孵出率（OZ GOOQ Y !GC>Q）显著高
于平衡 #$ 和K$2&7
（O$G !HQ Y ! GKOQ 和Z$G OHQ Y
KGOOQ）（表 K）。说明平衡时间可以在 H N !$2&7，但
不宜过长。
CZO "#$%&’& ()*+%,- ). /$)0&1#%)-)23 生物工程学报 #$$H，
V,;G#!，
U,G H
表!不同发育阶段小鼠胚胎 "# 冷冻后的发育
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/-012’& )%*%+’,4.$ "’56
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（@AB ?@ C =B;;）
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（ADB A@ C >BE;）
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（DGB GA C =B;F）
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表;不同浓度 "# 冷冻小鼠致密晚期桑椹胚的发育
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GB E DF ;F
（A@B ED C >BA>）
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（AGB =; C =BGE）
#
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（?GB ?F C >B>G）
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（DAB GG C >BG;）
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（@;B =D C >BAG）
#=E
（;>B AG C >BAG）
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（AAB =; C FBA;）
#=F
（>GB ED C >B;F）
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表=平衡不同时间 !> ?-+’@A "# 冷冻小鼠致密晚期桑椹胚的发育
$%&’( = )(*(’+,-(./ +0 -+12( ’%/( <+-,%</ -+31’%( (B17’7&3%/(9 7. !>? -+’@A "# 0+3 9700(3(./ /7-(2 %.9 03+5(. 7. ’7B179 .7/3+:(.
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（D?B FG C >B=>）
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（DFB D> C =BF;）
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#0 ;A
（D@B DD C =B?;）
#
>G @D ;?
（D=B ?= C GB??）
08 ;D
（DGB =A C =BFD）
08
FG @E ;@
（@@B FA C =B;A）
);>
（@GB DA C FBDD）
8)
;>C 两步和一步平衡冷冻小鼠胚胎的发育
致密晚期桑椹胚在 GBE-’+5I /O 中平衡 A-4.，
移入 = B?-’+5I /O 中平衡 =G-4.，或者直接在 =B?
-’+5I /O 中平衡 =G-4. 后冷冻。结果表明，两步平
衡冷冻胚胎的囊胚发育率（?GB ?F6 C > B>G6）显著
（!R GBGA）高于一步平衡（D>B@;6 C = B GA6 ）；前者
的囊胚孵出率（DABGG6 C >BG;6）极显著（!R G BG=）
高于后者（@GB=; 6 C >BF@6）。
;>D "# 冷冻液中添加不同浓度蔗糖对解冻胚胎发
育的影响
致密晚期桑椹胚在 GBE-’+5I /O 中平衡 A-4.，
移入 添加 G、
GBGA、
GB=、
GB> 和G B ; -’+5I 蔗糖的
=B?-’+5I /O 中平衡 =G-4. 后冷冻。添加 G、
GBGA 和
GB= -’+5I 蔗糖冷冻胚胎的囊胚发育率（?GB ?F6 C
>B>G 6、
D?B GG6 C > BGG 6 和?GB;=6 C = B E>6 ）和囊
胚孵 出率（DABGG6 C > B G;6 、
DGB @D6 C FB>F6 和
D;B F>6 C >BG@6）差异不显著（!L GBGA）。但添加
GB> 和G B ;-’+5I 蔗糖的囊胚发育率（DFB FF6 C > B ==
和ADB G?6 C > B=E6 ）和孵出率（@> B@D 6 C ; BGG 6 和
;FB @=6 C > BDA6）显著（!R G BGA）下降（表 ;）。
表C在!> ?-+’@A "# 中添加不同浓度蔗糖冷冻小鼠致密晚期桑椹胚的发育
$%&’( C )(*(’+,-(./ +0 -+12( ’%/( <+-,%</ -+31’%( %0/(3 <34+,3(2(3*%/7+. 7. !> ? -+’@A "# 21,,’(-(./(9
67/8 9700(3(./ <+.<(./3%/7.2 +0 21<3+2(
!H81’&% 8’.8%."1#"4’.5
（-’+5I）/-012’& (1’3%.
/-012’& )%*%+’,4.$ "’56
7+#&"’82&"& 9#"8:%) 0+#&"’82&"&
G D> A?
（?GB ?F C >B>G）
#A;
（DAB GG C >BG;）
#
GB GA AA ;F
（D?B GG C >BGG）
#0 FE
（DGB @D C FB>F）
#0
GB = A? ;D
（?GB ;= C =BE>）
#;F
（D;B F> C >BG@）
#
GB > DA AA
（DFB FF C >B==）
0;D
（@>B @D C ;BGG）
0
GB ; A@ F>
（ADB G? C >B=E）
8>;
（;FB @= C >BDA）
8
E@D
罗明久等：应用乙二醇冷冻小鼠胚胎：优化和简化程序的探索
!"# 解冻后脱除 $% 培养对胚胎发育的影响
致密晚期桑椹胚在 !"#$%&’( )* 中平衡 +$,-，
移入 ."/$%&’( )* 中平衡 .!$,- 后冷冻。胚胎解冻
后移入含 !"+$%&’( 蔗糖的 01 中停留 +$,-，再用 01
洗2次，脱除 )*。结果表明，脱除 )* 与不脱除 )*
的囊 胚 发 育 率（ /!"/23 4 1"1!3 比/." 563 4
2".# 3）和囊胚孵出率（6+ "!! 3 4 1 "!7 3 比62"223
4 1"61 3）差异均不显著（!8 ! "!+）。
!"& $% 与’% 冷冻小鼠胚胎的发育效果比较
致密晚期桑椹胚在 ! " #$%&’( )* 或!" 6+$%&’(
9* 中平衡 +$,-，移入含有或不含有 ! ".$%&’( 蔗糖
的."/$%&’( )* 或."+$%&’( 9* 中平衡 .!$,- 后冷
冻。不添加蔗糖时，
)* 和9* 冷冻胚胎的囊胚发育
率（/! " /2 3 4 1 " 1!3 对/5"2#3 4 1"263）和孵出率
（6+" !!3 4 1 "!73对6# "/73 4 !" 623）差异不显著
（!8 !"!+），但添加蔗糖时，
9* 冷冻胚胎的囊胚发
育 率（/6"573 4 . " .13 ）和 孵 出 率（/2 "763 4
1".5 3）显著高于 )* 冷冻胚胎（/!" 7.3 4 . "#1 3 和
67" 213 4 1"!53）。用 9* 添加蔗糖冷冻致密晚期
桑椹胚效果好于 )*
（表 +）。
!"( $% 冷冻胚胎体外发育囊胚的细胞数
以最佳方案（." /$%&’( )* 不添加蔗糖、两步平
衡、解冻后脱除 )*）冷冻小鼠致密晚期桑椹胚发育
产生的早期囊胚（1# "!! 4 !" 5/）和囊胚（22 "#! 4
!"/+
）的细胞数明显少于体内胚胎（2!"#2 4 ! "+.、
2/" 6! 4 ! "65）。
表) $% 与’% 冷冻小鼠致密晚期桑椹胚的发育
*+,-. ) /.0.-123.45 16 3178. -+5. 9132+95 31:7-+. +65.: 9:;12:.8.:0+5<14 =<5> $% 1: ’%
:;<%=;%>?@>A->B )$C;<%B D;%E?-
)$C;<%B F?G?&%=,-H >%’3
I&AB>%@<B>B JA>@K?F C&AB>%@<B>B
)*LMN@;%B? 61 +/
（/!" /2 4 1"1!）
A+7
（6+" !! 4 1"!7）
A
)* O MN@;%B? +/ 76
（/!" 7. 4 ."#1）
A72
（67" 21 4 1"!5）
A
9*LMN@;%B? 6! 5!
（/5" 2# 4 1"26）
AC +5
（6#" /7 4 !"62）
AC
9* O MN@;%B? 57 +5
（/6" 57 4 .".1）
C+2
（/2" 76 4 1".5）
C
?讨论
过去，小鼠和人的冷冻胚胎常用 9* 作为保护
剂，但最近证明，
)* 毒性较小
［6，
#，
..，
.+］
，并且已广泛用
于动物胚胎的慢速
［6，
15］和玻璃化冷冻
［#，
.!，
.2］
。PA-
F?- QCC??& 等
［16］和M%$$?;D?&F 和R,?$A--
［#］报道，慢
速冷冻胚胎的效果要好于快速或超快速冷冻。然
而，目前用 9* 或)* 慢速冷冻小鼠胚胎的研究均采
用较为复杂的人胚胎冷冻L解冻程序进行
［+，
.+，
16］
，尚
未见到简化该程序的研究报道。本实验采用牛胚胎
的冷冻程序
［15］
，冷冻和解冻程序都大大简化。而
且，我们还证明，解冻后可以不脱除 )* 进行胚胎培
养。我们获得的小鼠致密晚期桑椹胚和 7L细胞胚
胎的冻后囊胚发育率与 SA% 等
［+］和)$,&,A-, 等
［.+］
用
人胚冷冻—解冻程序所获得的十分接近。说明可以
用简化的冷冻L解冻程序进行小鼠胚胎 )* 冷冻。有
人采用一步平衡冷冻牛胚胎成功
［15］
，但本实验未能
获得满意结果。另外，进行小鼠胚胎冷冻多在一个
细管内装 .+ T 1! 枚胚胎
［+，
.+］
。这对于进行研究是
方便的，但不实用，因为人和大动物每次一般移植 .
T 1 枚胚胎。本实验中每只细管装 1枚胚胎冷冻也
取得了满意的效果。
MKAU 等
［.7］
发现，
)* 慢冻 7L细胞胚胎效果好于
9*。)$,&,A-, 等
［.+］
发现，
)* 慢冻 7L细胞胚胎效果最
好，
9* 冷冻原核胚效果最好，甘油冷冻囊胚效果最
好。IAD;A-, 等
［.5］
也发现，
)* 不如 9* 更适合于小鼠
合子冷冻。然而，这些实验并没有涉及 /L细胞和桑
椹胚胎。本实验首次发现，用 )* 冷冻致密晚期桑
椹胚的囊胚发育率和孵出率均显著高于其它时期胚
胎；
/L细胞胚胎的囊胚孵出率显著高于 7L细胞和致
密早期桑椹胚。综上所述，用 )* 慢冻小鼠胚胎的
效果具有明显的胚胎发育阶段依赖性：合子 V 7L细
胞、致密早期桑椹和囊胚 V /L细胞胚 V致密晚期
桑椹胚。SA% 等
［+］
用9* 冷冻小鼠胚胎发现，冷冻致
密晚期桑椹胚的囊胚发育率显著高于 1L细胞胚，而
后者的又显著高于合子和致密早期桑椹胚。这表
明，（.）对于不同发育阶段胚胎，必须采用不同的冷
冻程序和保护剂才能收到满意的冷冻效果；（1）致密
晚期桑椹胚最耐冻，而致密早期桑椹胚对现有冷冻
程序，特别是 9* 冷冻更敏感。关于致密早期桑椹
胚对冷冻敏感的原因可能有三。第一，这些胚胎发
育速度慢，为劣质胚胎。第二，由于致密早期桑椹胚
细胞间建立了部分连接，故在进入冷冻液后因细胞
皱缩而使膜受到牵拉而易受损。第三，不同发育时
期胚胎的细胞膜对不同保护剂的通透性不同，在
."/$%&’( )* 中致密早期桑椹胚卵裂球相互分离，致
!66 "#$%&’& ()*+%,- ). /$)0&1#%)-)23 生物工程学报 1!!+，
P%&"1.，
R%" +
密晚期桑椹胚卵裂球仍然紧密排列。由于本实验中
严格控制采胚时间，致密早期和晚期桑椹胚并非同
时获得，故可排除第一种可能性。本实验中，致密早
期桑椹胚的冷冻效果与!"和#"细胞胚胎相似也可排
除第二种可能性。而本实验和众多研究所证明的用
$% 慢冻小鼠胚胎的效果具有明显的胚胎发育阶段
依赖性却明显支持第三种可能性。
本实验应用 &’ (、
)’#、
*’+ 和, ’ - ./012 $% 冷冻
小鼠致密晚期桑椹胚，解冻后体外培养的囊胚发育
率和孵出率以 )’# ./012 的最高，极显著（!3 & ’&)）
高于其它组。本实验中，胚胎在 ) ’ #./012 $% 中平
衡4 5 )&.67 的囊胚发育率显著高于平衡 ,&.67，平
衡)&.67 的囊胚孵出率显著高于平衡 *& 5 ,&.67。
说明在 $% 中的平衡具有严格的时限，
)&.67 最好。
他人对其他冷冻保护剂的浓度
［*#］和平衡时间
［*!，
*(］
的研究也得到了相似的结论。
尽管目前在用 $% 冷冻牛胚胎时一般不添加蔗
糖，但 89:;67<= 等
［,&］研究证明，
$% 添加 &’)./012 蔗
糖冷冻牛胚胎的妊娠率显著高于不添加或添加
&’,./012 蔗糖。我们发现，在含 )’# ./012 $% 的冷
冻液中添加 &、
&’&4 和& ’) ./012 蔗糖冷冻小鼠胚胎
的囊胚发育率和孵出率差异不显著，但添加 & ’ * 或
&’!./012 蔗糖的囊胚发育率和孵出率显著下降。
>/?@6 等
［*-］
报道，用 ) ’ -./012 A% 冷冻牛囊胚和桑椹
胚的效果不如用 )’ #./012 $%。本实验比较 A% 和
$% 对小鼠致密晚期桑椹胚的冷冻效果发现，在不添
加蔗糖的情况下，
$% 和A% 冷冻的囊胚发育率和孵
出率差异不显著，但在添加 & ’) ./012 蔗糖时，
A% 冷
冻胚胎的囊胚发育率和孵出率显著高于 $% 冷冻胚
胎。这说明，用 $% 冷冻小鼠桑椹胚时无需添加蔗
糖，但用 A% 冷冻时最好添加蔗糖。A% 和$% 作为
冷冻保护剂对蔗糖的需求差别可能与所用的胚胎解
冻方 法有 关。B@9C 等
［)!］发现，只有 用 A% 添加
&’)./012 蔗糖冷冻小鼠原核和 !"细胞胚用多种解冻
方法都能取得好效果，而用 A% 不加蔗糖、
$% 加或
不加蔗糖冷冻时，只有用一种（与本实验完全相同
的）解冻方案，才获得好效果。
本实验发现，冻后发育的早期囊胚和囊胚的细
胞数明显少于体内发育的早期囊胚和囊胚。这说
明，经现有方法冷冻"解冻胚胎仍会损伤部分细胞，
影响胚胎发育能力。形态观察也发现，解冻后胚胎
虽然能恢复到冷冻前的大小，但细胞质出现微小的
颗粒。说明经过冷冻"解冻后，细胞已受到损伤。
!"#"!"$%"&
（参考文献）
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//：4&* R 4&+
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D6;:6M6?9;6/7I 9+:,;.,%,<:，)(((，/,：(4 R )&4
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<.N:O/LI 3 )"*+,- 1"+#.%，)((,N，+,：!4( R !-4
［),］\@P B$，B9EP:96 U，$H9L@6Q< Z "# $% I J:O/K:<L<:D9;6/7 /M =/79"
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［)!］B@9C V8，Y9:H J，U:/P7L/7 S‘I $D90P9;6/7 /M K:/K97<H6/0，
<;@O0<7< Q0O?/0，LP?:/L< 97H 97;6M:<<=< K:/;<67L /7 ;@< LP:D6D90 /M
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［)4］$.606976 B，X97 H<7 T<:Q@ 8，X97767 SB "# $% I J/.K9:6L/7 /M
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罗明久等：应用乙二醇冷冻小鼠胚胎：优化和简化程序的探索
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+,%’-".%/"#".0，O@@O，#&：
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答读者问
近来，编辑部常常接到一些读者的电话、信件及 FG:-9%，询问有关投稿、审稿、订刊等事宜，为使更多的读者对这些问题有
所了解，现一一答复如下，希望对大家有所帮助。
!8 投稿时需要哪些手续？是否需要电子版？
答：投稿时需要提供论文第一作者署名单位的介绍信，介绍信主要应证明该文的作者署名无误，未一稿两投及不涉及保
密问题。所有稿件都需要提供电子版，请用 C’() 附加文件形式发来。此外，还需要邮寄打印稿件一份（打印图片效果不好的，
最好附一份原图），并在投稿的同时缴纳 !@@ 元审稿费。
我刊 FG:-9%：
3^;_ /508 9:8 -3 8 30
O8 审稿费需邮寄还是转帐？
答：都可以。只是邮寄汇款时，请在收件人栏填写“生物工程学报编辑部”收，不要写个人姓名；备注栏中注明“稿件编号 ‘第
一作者姓名”，以便确认汇款来源。编辑部在收到汇款之后，将以挂号形式寄回发票。如果付款单位与文章署名单位不一致，请
务必在汇款单上注明发票上所要开具的付款单位名称。如转帐付款，请按如下帐号、地址汇来，也请注明“稿件编号 ‘第一作者
姓名”。
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开户银行：中国工商银行北京分行海淀镇支行
帐 号：
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J8 贵刊的审稿程序是怎样的？一般多长时间可以知道稿件是否被录用？
答：收到来稿后，首先将由专家进行两审。若一二审均获通过，则送达主编处进行最后的总审，再次通过，您就可以收到
录用通知了。这个过程一般不会超过 J个月。当然，如果您的稿件在一二审时即被否定，那您可能一个月之内就会收到我们
的退稿通知了。
S8 如不用，是否退回原稿？是否告知退稿原因？对退稿有异议怎么办？
答：我们在今年的征稿简则中已经说明，今后凡印刷稿件一般不再寄回。特殊情况，如已无底片的照片等请作者在来稿
时说明，我们会挂号寄回。对每一篇退稿，我们都会详细写明退稿原因，为您进一步修改论文提供帮助。如您对退稿意见有
异议，可以给我们写信表明看法，我刊将请专家予以复审。
Z8 我可否指定审稿人，或言明请某审稿人回避？
答：您在投稿时可附上您推荐的审稿人名单，或请予回避的审稿人名单，供编辑部参考，但是否采纳将视具体情况而定。
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