2-Tecnologias de sequenciamento de DNA ao longo dos anos e as principais contribuições de metodologias moleculares para o desenvolvimento dos sequenciadores de DNA. 

Contexts in source publication

Context 1

... toda vez que um nucleotídeo é incorporado na molécula de DNA há a emissão de luz, que é registrada pelo sistema de um computador associado (Figura 2.4). A intensidade do sinal luminoso é proporcional ao número de bases que foram incorporadas naquela etapa do sequenciamento, podendo ser um único nucleotídeo (A), ou mais de um (AAAAA). Desta forma, ao final do processo, a sequência de DNA pode ser obtida pelos dados de luminosidade armazenados no programa de análises. Esta metodologia ficou conhecida como Pirosequenciamento ( Ronaghi et al., 1996). Através dela, é possível aumentar em até 100x a escala de rendimento do sequenciamento comparando com a metodologia de Sanger e isto é obtido principalmente pela utilização do PCR em emulsão (Box 2.4), otimizado em um suporte sólido e com volumes em escalas de picolitros. Assim, o pirosequenciamento desenvolveu-se, reduziu tempo e custos, proporcionando um sequenciamento de DNA altamente escalável, com um maior volume de dados obtidos em um tempo relativamente menor ao do sequenciamento por capilaridade de Sanger ( Margulies et al., ...

Context 2

... outro lado, a metodologia baseada no enriquecimento foca no sequenciamento somente do DNA plastidial. Nessa abordagem, quatro principais métodos para enriquecimento do DNA plastidial têm sido descritos: (1) baseados no isolamento do plastídio a partir de folhas frescas; (2) baseados no princípio de que genomas de organelas de eucariotos têm muito menos metilação CpG do que genoma nuclear; (3) baseados na utilização de sondas curtas de oligonucleotídeos para isolar sequências complementares de DNA plastidial a partir de um DNA genômico extraído; 4) via PCR. O isolamento do plastídio a partir de folhas frescas poderá ser realizado via gradiente de sacarose utilizando métodos caseiros ou kits comerciais (por exemplo, Miflin e Beevers, 1974; e Sigma Chloroplast Isolation Kit), por precipitação com altas concentrações de sal, ou então proceder a extração de DNA genômico seguido do tratamento com DNaseI. Entretanto, os dois últimos métodos podem apresentar baixo rendimento e contaminação com DNA mitocondrial ( Shi et al., 2012). Devido ao baixo rendimento no isolamento dos plastídios, uma etapa adicional de amplificação pode ser requerida antes do sequenciamento. Apesar da vantagem de conseguir uma completa montagem mesmo com um pequeno número de reads (Shi et al., 2012), a principal limitação deste método é a necessidade de grandes quantidades de tecido vegetal e a otimização do protocolo de isolamento do plastídio, específico para cada espécie, dificultando estudos comparativos em larga escala. Como o genoma das organelas apresenta muito menos metilação CpG do que o genoma nuclear, o DNA genômico pode ser particionado numa porção altamente metilada (CpG), e uma fração com baixa metilação, a qual é enriquecida com DNA plastidial (3,2 -11,2 vezes; Yigit et al., 2014). Este segundo método de enriquecimento, entretanto, pode não ser viável para amostras de DNA degradado, como de herbário (Twyford, 2016). Um método promissor para o enriquecimento de bibliotecas de DNA plastidial é a utilização de sondas curtas de oligonucleotídeos para isolar sequências complementares de DNA plastidial a partir de um DNA genômico extraído. A biblioteca de sequências capturadas é sequenciada por NGS. Este método é adequado para uma vasta gama de material vegetal, incluindo amostras de herbário (ver, por exemplo, Stull et al., 2013e Comer et al., 2015 que usaram microarranjos para captura de sequências plastidiais). Outra forma de enriquecimento com sequência plastidial é via PCR. Este método consiste do uso de um conjunto de primers universais para amplificação de sequências curtas, seguido de sequenciamento Sanger, mais adequado para aplicações que requerem a sequência parcial do plastídio, como por exemplo, estudos de genética de populações ( Whittall et al., ...

Context 3

... métodos de redução do genoma foram desenvolvidos como abordagens rápidas e robustas que combinam a descoberta de marcadores moleculares e a genotipagem dos mesmos simultaneamente. Além disso, estas técnicas permitem o sequenciamento simultâneo de vários indivíduos devido a combinação de adaptadores de código de barras de DNA em cada amostra. Isto permite posteiormente identificar e agrupar as sequências de acordo com o indivíduo. O método de redução genômica foi descrito pela primeira vez em humanos usando sequenciamento capilar para gerar um mapa de SNPs (Altshuler et al. 2000). Posteriormente, van Tassel et al., (2007) adaptaram a técnica para o NGS: sequenciamento de bibliotecas de representação reduzida (RRLs, do inglês reduced-representation libraries). Outras técnicas que utilizam abordagem de redução genômica já foram descritos na literatura associadas ao NGS. Dentre esses métodos, podemos destacar o sequenciamento de fragmentos de DNA associados a sítios de restrição (RAD-seq, do inglês restriction site-associated DNA sequencing) Baired et al., 2008) e a genotipagem por sequenciamento (GBS, do inglês Genotyping by sequencing) (Davey et al., 2011b), além de outras. Atualmente, estas técnicas estão sendo empregadas para uma gama de estudos genéticos e genômicos em diversas espécies, tais como em estudo de estrutura de populações em uma espécie arbustiva da Amazônia da família Violacea ( Nazareno et al., 2017); descoberta de SNPs para construção de mapas genéticos em oliva (Ipek et al., 2016), em estudo de hibridação em espécies de peixe do gênero Potamotrygon do rio Paraná ( Cruz et al., 2017) e para estudar a diversidade genética do mosquito Anopheles moucheti, vetor da malária ( Fouet et al., 2017), além de diversos outros estudos que podem ser encontrados na ...

Context 4

... é superior na geração de fragmentos polimórficos quando comparado à AFLP. Embora esta última também utilize enzimas de restrição e amplificação de fragmentos através de primers com sequências complementares aos adaptadores adicionados às extremidades geradas, a cobertura de um genoma com um único ensaio de AFLP é cerca de duas vezes menor que o ensaio com DArT (Kilian et al., ...

Context 5

... os locos de microssatélites eram identificados a partir da construção de uma biblioteca genômica para a espécie alvo ( Zane et al., 2002), podendo esta biblioteca ser enriquecida com sequências contendo microssatélites (Figura 6.2), uma etapa crucial para espécies com grandes genomas. Para a construção de tais bibliotecas, o DNA genômico de alta qualidade precisa ser fragmentado usando enzimas de restrição, que clivam o DNA em regiões específicas, ou, menos comumente, por sonicação, um método físico de fragmentação do DNA via ultrassom ( Karagyozov et al., 1993). A escolha das enzimas a serem usadas depende do comprimento médio desejado dos fragmentos de DNA, da repetição de microssatélites que podem ser encontrados e do tipo de extremidades (extremidade coesiva ou cega) dos fragmentos de restrição. O DNA clivado é então selecionado pelo tamanho dos fragmentos, para preferencialmente obterem-se fragmentos pequenos de 300 a 700 pares de base (pb). Uma grande parte dos protocolos de enriquecimento envolve a ligação de sondas marcadas com biotina a esferas magnéticas recobertas por estreptavidina. A ligação estável formada por biotina e estreptavidina permite a utilização de sondas ligadas a esferas magnéticas para selecionar fragmentos de interesse através da utilização de um ímã. Dependendo do método de clivagem, os fragmentos de DNA podem ser ligados a um vetor de clonagem (plasmídeo), seja diretamente ou após a ligação de adaptadores específicos. Esta etapa é mais crítica, devido ao risco de obtenção de um número reduzido de recombinantes e a formação de concatâmeros entre fragmentos genômicos. A transformação de células bacterianas com produto de ligação geralmente produz milhares de clones recombinantes, que podem ser subsequentemente pesquisados quanto à presença de sequências de microssatélites. Após a identificação de clones contendo as repetições, estes são sequenciados e são projetados primers específicos para a amplificação de cada loco de SSR (Figura 6.2). As condições da PCR são otimizadas para permitir a amplificação dos locos em diferentes indivíduos de uma população ( Zane et al., ...

Context 6

... toda vez que um nucleotídeo é incorporado na molécula de DNA há a emissão de luz, que é registrada pelo sistema de um computador associado (Figura 2.4). A intensidade do sinal luminoso é proporcional ao número de bases que foram incorporadas naquela etapa do sequenciamento, podendo ser um único nucleotídeo (A), ou mais de um (AAAAA). Desta forma, ao final do processo, a sequência de DNA pode ser obtida pelos dados de luminosidade armazenados no programa de análises. Esta metodologia ficou conhecida como Pirosequenciamento ( Ronaghi et al., 1996). Através dela, é possível aumentar em até 100x a escala de rendimento do sequenciamento comparando com a metodologia de Sanger e isto é obtido principalmente pela utilização do PCR em emulsão (Box 2.4), otimizado em um suporte sólido e com volumes em escalas de picolitros. Assim, o pirosequenciamento desenvolveu-se, reduziu tempo e custos, proporcionando um sequenciamento de DNA altamente escalável, com um maior volume de dados obtidos em um tempo relativamente menor ao do sequenciamento por capilaridade de Sanger ( Margulies et al., ...

Context 7

... outro lado, a metodologia baseada no enriquecimento foca no sequenciamento somente do DNA plastidial. Nessa abordagem, quatro principais métodos para enriquecimento do DNA plastidial têm sido descritos: (1) baseados no isolamento do plastídio a partir de folhas frescas; (2) baseados no princípio de que genomas de organelas de eucariotos têm muito menos metilação CpG do que genoma nuclear; (3) baseados na utilização de sondas curtas de oligonucleotídeos para isolar sequências complementares de DNA plastidial a partir de um DNA genômico extraído; 4) via PCR. O isolamento do plastídio a partir de folhas frescas poderá ser realizado via gradiente de sacarose utilizando métodos caseiros ou kits comerciais (por exemplo, Miflin e Beevers, 1974; e Sigma Chloroplast Isolation Kit), por precipitação com altas concentrações de sal, ou então proceder a extração de DNA genômico seguido do tratamento com DNaseI. Entretanto, os dois últimos métodos podem apresentar baixo rendimento e contaminação com DNA mitocondrial ( Shi et al., 2012). Devido ao baixo rendimento no isolamento dos plastídios, uma etapa adicional de amplificação pode ser requerida antes do sequenciamento. Apesar da vantagem de conseguir uma completa montagem mesmo com um pequeno número de reads (Shi et al., 2012), a principal limitação deste método é a necessidade de grandes quantidades de tecido vegetal e a otimização do protocolo de isolamento do plastídio, específico para cada espécie, dificultando estudos comparativos em larga escala. Como o genoma das organelas apresenta muito menos metilação CpG do que o genoma nuclear, o DNA genômico pode ser particionado numa porção altamente metilada (CpG), e uma fração com baixa metilação, a qual é enriquecida com DNA plastidial (3,2 -11,2 vezes; Yigit et al., 2014). Este segundo método de enriquecimento, entretanto, pode não ser viável para amostras de DNA degradado, como de herbário (Twyford, 2016). Um método promissor para o enriquecimento de bibliotecas de DNA plastidial é a utilização de sondas curtas de oligonucleotídeos para isolar sequências complementares de DNA plastidial a partir de um DNA genômico extraído. A biblioteca de sequências capturadas é sequenciada por NGS. Este método é adequado para uma vasta gama de material vegetal, incluindo amostras de herbário (ver, por exemplo, Stull et al., 2013e Comer et al., 2015 que usaram microarranjos para captura de sequências plastidiais). Outra forma de enriquecimento com sequência plastidial é via PCR. Este método consiste do uso de um conjunto de primers universais para amplificação de sequências curtas, seguido de sequenciamento Sanger, mais adequado para aplicações que requerem a sequência parcial do plastídio, como por exemplo, estudos de genética de populações ( Whittall et al., ...

Context 8

... métodos de redução do genoma foram desenvolvidos como abordagens rápidas e robustas que combinam a descoberta de marcadores moleculares e a genotipagem dos mesmos simultaneamente. Além disso, estas técnicas permitem o sequenciamento simultâneo de vários indivíduos devido a combinação de adaptadores de código de barras de DNA em cada amostra. Isto permite posteiormente identificar e agrupar as sequências de acordo com o indivíduo. O método de redução genômica foi descrito pela primeira vez em humanos usando sequenciamento capilar para gerar um mapa de SNPs (Altshuler et al. 2000). Posteriormente, van Tassel et al., (2007) adaptaram a técnica para o NGS: sequenciamento de bibliotecas de representação reduzida (RRLs, do inglês reduced-representation libraries). Outras técnicas que utilizam abordagem de redução genômica já foram descritos na literatura associadas ao NGS. Dentre esses métodos, podemos destacar o sequenciamento de fragmentos de DNA associados a sítios de restrição (RAD-seq, do inglês restriction site-associated DNA sequencing) Baired et al., 2008) e a genotipagem por sequenciamento (GBS, do inglês Genotyping by sequencing) (Davey et al., 2011b), além de outras. Atualmente, estas técnicas estão sendo empregadas para uma gama de estudos genéticos e genômicos em diversas espécies, tais como em estudo de estrutura de populações em uma espécie arbustiva da Amazônia da família Violacea ( Nazareno et al., 2017); descoberta de SNPs para construção de mapas genéticos em oliva (Ipek et al., 2016), em estudo de hibridação em espécies de peixe do gênero Potamotrygon do rio Paraná ( Cruz et al., 2017) e para estudar a diversidade genética do mosquito Anopheles moucheti, vetor da malária ( Fouet et al., 2017), além de diversos outros estudos que podem ser encontrados na ...

Context 9

... é superior na geração de fragmentos polimórficos quando comparado à AFLP. Embora esta última também utilize enzimas de restrição e amplificação de fragmentos através de primers com sequências complementares aos adaptadores adicionados às extremidades geradas, a cobertura de um genoma com um único ensaio de AFLP é cerca de duas vezes menor que o ensaio com DArT (Kilian et al., ...

Context 10

... os locos de microssatélites eram identificados a partir da construção de uma biblioteca genômica para a espécie alvo ( Zane et al., 2002), podendo esta biblioteca ser enriquecida com sequências contendo microssatélites (Figura 6.2), uma etapa crucial para espécies com grandes genomas. Para a construção de tais bibliotecas, o DNA genômico de alta qualidade precisa ser fragmentado usando enzimas de restrição, que clivam o DNA em regiões específicas, ou, menos comumente, por sonicação, um método físico de fragmentação do DNA via ultrassom ( Karagyozov et al., 1993). A escolha das enzimas a serem usadas depende do comprimento médio desejado dos fragmentos de DNA, da repetição de microssatélites que podem ser encontrados e do tipo de extremidades (extremidade coesiva ou cega) dos fragmentos de restrição. O DNA clivado é então selecionado pelo tamanho dos fragmentos, para preferencialmente obterem-se fragmentos pequenos de 300 a 700 pares de base (pb). Uma grande parte dos protocolos de enriquecimento envolve a ligação de sondas marcadas com biotina a esferas magnéticas recobertas por estreptavidina. A ligação estável formada por biotina e estreptavidina permite a utilização de sondas ligadas a esferas magnéticas para selecionar fragmentos de interesse através da utilização de um ímã. Dependendo do método de clivagem, os fragmentos de DNA podem ser ligados a um vetor de clonagem (plasmídeo), seja diretamente ou após a ligação de adaptadores específicos. Esta etapa é mais crítica, devido ao risco de obtenção de um número reduzido de recombinantes e a formação de concatâmeros entre fragmentos genômicos. A transformação de células bacterianas com produto de ligação geralmente produz milhares de clones recombinantes, que podem ser subsequentemente pesquisados quanto à presença de sequências de microssatélites. Após a identificação de clones contendo as repetições, estes são sequenciados e são projetados primers específicos para a amplificação de cada loco de SSR (Figura 6.2). As condições da PCR são otimizadas para permitir a amplificação dos locos em diferentes indivíduos de uma população ( Zane et al., ...