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Article: Desarrollo de metodología analítica para la determinación de plaguicidas organofosforados y organoclorados en muestras biológicas humanas
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ABSTRACT: El amplio uso de plaguicidas en el área Mediterránea, hace que la exposición a los mismos suponga un evidente riesgo para la salud pública, debido a su demostrada toxicidad. La actividad donde el uso de plaguicidas es mayor es la agricultura, ya que las cosechas se ven afectadas por una gran diversidad de plagas, así como por la competencia de las malas hierbas. Pero no solamente el sector agrícola se encuentra expuesto a plaguicidas, la población en general también están expuestos a ellos, aunque en distinto grado. Uno de los riesgos para la población general es la exposición a largo plazo provocada por la presencia de residuos de plaguicidas en los alimentos como consecuencia de los tratamientos fitosanitarios, así como por los contaminantes ambientales. Atendiendo a la necesidad de controlar y evaluar esta exposición humana, el objetivo principal de la presente Tesis Doctoral ha consistido en el estudio y puesta a punto de procedimientos analíticos eficaces basados en cromatografía de gases (GC) capilar para la determinación de plaguicidas organofosforados (OPs) y organoclorados (OCs) en muestras biológicas de origen humano. En una primera etapa del presente trabajo, se han desarrollado dos procedimientos multiresiduales sencillos para el análisis de plaguicidas en muestras humanas de suero y orina. Se han basado en técnicas tradicionales como son la microextracción líquido-líquido (LLME) y la extracción en fase sólida (SPE). El procedimiento basado en SPE ha resultado más rápido, ha evitado la formación de emulsiones, frecuentes en la técnica de extracción con disolventes orgánicos, y ha permitido la obtención de extractos más limpios. Sin embargo, los límites de detección obtenidos han sido, en muchos casos, insuficientes para el control biológico de la población en general, aunque sí resulten adecuados para la determinación de altos niveles de contaminantes en población expuesta. En una segunda etapa de la investigación, se ha incorporado el uso de una técnica más novedosa, como es la microextracción en fase sólida (SPME) para la determinación de residuos de plaguicidas OPs y OCs en muestras de fluidos biológicos. Esta técnica permite simplificar notablemente el tratamiento de muestra en comparación con las técnicas tradicionales, lo cual supone una reducción del tiempo de análisis, así como una menor manipulación de la muestra. Además y debido a la complejidad de las muestras estudiadas, el uso del modo de trabajo de espacio de cabeza ha permitido la obtención de precisiones satisfactoria y bajos niveles de detección, muy adecuados para el control, tanto de población expuesta como no expuesta Finalmente, y coincidiendo con la tercera etapa del proceso de investigación, también se han analizado muestras de tejido adiposo humano, las cuales presentan una elevada complejidad por su alto contenido lipídico (aproximadamente un 84%). La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en fase normal con columnas de Silicagel ha sido la técnica seleccionada para la etapa de purificación en la determinación de compuestos OCs, tanto plaguicidas OCs como PCBs, en este tipo de matrices. Los procedimientos de purificación desarrollados han permitido obtener los plaguicidas y sus metabolitos en fracciones libres de grasa, o con un contenido menor a la máxima cantidad de carga de grasa recomendada para columnas de gases capilares. Esto ha hecho posible la inyección directa de las fracciones HPLC en GC. La sensibilidad y selectividad de los procedimientos de extracción y purificación desarrollados se ha conseguido aumentar con el empleo de técnicas cromatográficas de análisis mediante espectrometría de masas (GC-MS), permitiendo la confirmación inequívoca de los compuestos detectados. También se ha utilizado para la detección una técnica más novedosa como la espectrometría en tándem masas (MS/MS), la cual se revela como una herramienta poderosa para el análisis de matrices complejas, ya que aporta un factor adicional por la realización del espectro de los iones secundarios formados a partir de un precursor seleccionado. La adecuada selección de los iones precursores y de los iones secundarios permite disponer de una de las técnicas más sensible y selectivas para trabajar con muestras complejas. Y por último, todos los métodos analíticos desarrollados se han aplicado al análisis de muestras de fluidos y tejidos humanos, tanto de agricultores como de población supuestamente no expuesta a plaguicidas, detectándose con frecuencia algunos de los analitos objetos del presente estudio.http://www.tesisenxarxa.net. -
Article: Determinacion de residuos de herbicidas polares mediante cromatografia líquida de alta resolución. Aplicación de técnicas acopladas
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ABSTRACT: Las técnicas cromatográficas acopladas se encuentran entre las más sensibles y selectivas disponibles para la determinación de residuos de pesticidas en muestras medioambientales. El principal objetivo de esta Tesis es estudiar el potencial de la cromatografía líquida acoplada a cromatografía líquida (CL-CL) para el análisis de residuos de herbicidas polares seleccionados (fenoxiácidos, glufosinato, glifosato y el principal metabolito de éste último, AMPA). La aplicación de un procedimiento con acoplamiento CL-CL para la determinación de los residuos de estos herbicidas presenta numerosas ventajas, como son: menor tiempo de análisis, menor manipulación de la muestra, menor uso de disolventes orgánicos, mayor selectividad y sensibilidad y automatización de la etapa de purificación. La combinación de dos procedimientos de EFS y el acoplamiento CL-CL proporcionan un procedimiento global capaz de determinar ocho herbicidas fenoxiácidos a nivel de 0.1 g.l-1 en diferentes muestras de agua con una elevada capacidad de análisis. El procedimiento está basado en la extracción en fase sólida mediante cartucho C18 de 50 ml de muestra de agua previamente acidificada. Posteriormente, se purifica el extracto mediante un cartucho relleno de silicagel. Una alícuota de 400 µl se inyecta en el cromatógrafo líquido con columnas acopladas y detección UV a 228 nm. Se realiza una purificación sobre una pequeña columna de 10 mm rellena de la fase ISRP y se transfiere la fracción que contiene los analitos a la segunda columna de 100 mm rellena de Microspher C18, 3 µm. La aplicación de derivatización con FMOC antes de CL con columnas acopladas y detección fluorescente utilizando una columna de fase reversa acoplada a una de intercambio iónico es útil para la determinación de pesticidas muy polares como glufosinato, glifosato y AMPA en muestras de aguas a nivel de sub-ppb. La derivatización de la muestra de agua con FMOC se efectúa en medio tamponado borato; tras 30 min de reacción, se diluye con tampón borato y se inyectan 2 ml en el cromatógrafo líquido con columnas acopladas y detección fluorescente con ex = 263 nm y em = 317 nm. Se realiza una purificación sobre una columna de 30 mm rellena de fase reversa C18 y se transfiere la fracción que contiene los analitos a la segunda columna de 250 mm rellena de Adsorbosphere NH2 de 5 µm. La rapidez del procedimiento de prederivatización y el corto tiempo de análisis posterior proporciona una elevada capacidad de análisis, de al menos 50 muestras por día. El método parece ser muy robusto ya que, durante el tiempo que duraron las experiencias, la columna C18 (C-1) mantuvo su resolución y el reajuste de las condiciones de purificación y transferencia no fue necesario. La columna amino (C-2) sufrió una pérdida gradual de eficiencia, sólo advertible tras dos meses de uso continuado.http://www.tesisenxarxa.net. -
Article: Simplificación del tratamiento de muestra en el análisis de residuos de herbicidas en aguas mediante aplicación de las técnicas cromatográficas acopladas LC-LC y SPE-LC
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ABSTRACT: El objetivo fundamental de la presente Tesis Doctoral ha sido comparar dos técnicas cromatográficas acopladas utilizadas en Cromatografía Líquida (acoplamiento LC-LC y acoplamiento SPE-LC), mediante su aplicación al análisis de residuos de diferentes familias de herbicidas en muestras de agua. El acoplamiento LC-LC con detección UV se ha utilizado para la determinación de residuos de bromacilo y diuron, de cuatro herbicidas triazínicos, y de atrazina junto a sus principales productos de transformación. Para ello, se han desarrollado tres procedimientos analíticos rápidos y selectivos basados en la inyección directa de 2 ml de muestra acuosa en el sistema LC-LC, con límites de detección entre 0.1 y 0.5 µgl-1. La incorporación de una sencilla etapa previa de SPE off-line (en la determinación de triazinas y productos de transformación) permite disminuir los límites de detección hasta niveles inferiores a 0.1 µgl-1, pudiendo aplicarse los métodos desarrollados a muestras de aguas potables. El acoplamiento on-line SPE-LC-DAD se ha llevado a cabo mediante modificación de un equipo instrumental originalmente diseñado para llevar a cabo SPE off-line (el ASPEC XL), habiéndose desarrollado procedimientos para la determinación de carbaril y su principal producto de transformación (1-naftol), bromacilo con cinco herbicidas ureicos, triazinas y TP´s, y finalmente, seis herbicidas fenilcarbamatos. Cabe destacar la completa automatización de los procedimientos desarrollados así como las altas sensibilidades obtenidas mediante preconcentración de volúmenes de muestra del orden de 50-100 ml. Complementariamente al desarrollo de metodología analítica, se han llevado a cabo estudios de degradación de carbaril a 1-naftol, así como de desmedifam y fenmedifam. En el caso de los fenilcarbamatos se detectaron varios TP´s, quedando pendiente una futura elucidación estructural de los mismos. Los procedimientos desarrollados se han utilizado para realizar control de plaguicidas en aguas superficiales de la Comunidad Valenciana, habiéndose detectado diferentes herbicidas como bromacilo, diuron y algunas triazinas (simazina, terbutilazina, terbutrina y terbumeton). Finalmente, se ha llevado a cabo un estudio comparativo de las dos modalidades de acoplamiento utilizadas en esta Tesis Doctoral, LC-LC y SPE-LC, destacándose las características más relevantes de cada una de ellas (rapidez, sensibilidad, selectividad y mayor o menor carácter multiresidual), mediante el apoyo de los datos experimentales obtenidos a partir de los métodos desarrollados para los distintos herbicidas analizados tanto por LC-LC como por SPE-LC.http://www.tesisenxarxa.net. -
Article: Determinación de residuos de fungicidas en productos vegetales mediante técnicas cromatográficas avanzadas
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ABSTRACT: Atendiendo al creciente interés de Ecuador en el establecimiento de políticas para el control de residuos de plaguicidas debido al elevado uso de productos fitosanitarios en el tratamiento de enfermedades de diversos cultivos, particularmente, en el caso de fungicidas utilizados en el control de la Sigatoka Negra, enfermedad que afecta al banano. Considerando, además, la repercusión que han tenido estos fungicidas en el medio ambiente, tal y como se manifestó con la aparición del denominado Síndrome de Taura, causante de la mortandad masiva de camarón en piscinas de cultivo próximas a las plantaciones bananeras, lo que causó una fuerte polémica entre estos dos importante sectores de la economía ecuatoriana. Teniendo en cuenta, también, que el nivel de exportación de cítricos en España, así como de bananas en Ecuador, demanda la aplicación de fungicidas post-cosecha, requiriéndose el control de residuos a efectos de comercialización de las frutas. Y considerando que uno de los temas que más preocupa a la opinión pública, en general, es la presencia de residuos de estas sustancias en alimentos tratados, sobretodo frutas y hortalizas, puesto que incide directamente en la seguridad alimentaria. La presente Tesis Doctoral se centra, por tanto, en el desarrollo de una metodología analítica moderna acorde con el estado tecnológico actual y con las exigencias que demanda la legislación en materia de residuos de plaguicidas y, también, de metodología más convencional factible de aplicación en medios de investigación menos desarrollados. De esta manera se han desarrollado varios métodos analíticos mediante técnicas cromatográficas avanzadas (LC-FD, GC-MS, LC-LC-FD, LC-MS/MS) para la determinación de residuos de funguicidas seleccionados en muestras de banana y naranjas. Se ha demostrado la aplicabilidad de los métodos desarrollados en muestras de naranjas y bananas, confirmándose la idoneidad de los métodos multiresiduos para fines de control (monitoring). Para la determinación selectiva de o-fenilfenol se recomienda la aplicación del método LC-LC/FD, más rápido, sensible y selectivo que los multiresiduos. Finalmente, la poderosa técnica LC-MS/MS ha permitido determinar tridemorf y otros fungicidas y, así como confirmar los resultados obtenidos con los métodos más convencionales descartándo la existencia de falsos positivos. Adicionalmente, se ha desarrollado metodología analítica basada en LC-MS para la determinación de residuos de paclobutrazol, regulador de crecimiento ampliamente utilizado en frutas de hueso, por la necesidad de disponer de datos de residuos de este compuesto, cuyo LMR ha sido recientemente rebajado hasta 0.05 mgKg-1, lo cual ha originado graves problemas en la exportación de peras españolas. Este compuesto también presenta propiedades fungicidas, pudiendo incluirse en el grupo de los azoles según su estructura química.http://www.tesisenxarxa.net. -
Article: Determination of PBDEs in human breast adipose tissues by gas chromatography coupled to triple quadrupole mass spectrometry
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ABSTRACT: The potential of gas chromatography / tandem mass spectrometry with triple quadrupole analyzer for determination of 12 polybrominated diphenyl ethers in human breast tissues has been investigated. After extraction with hexane, two purification procedures -automated normal-phase HPLC and solid phase extraction – were assayed. Both electron impact ionization, in selected reaction monitoring mode, and negative chemical ionization, in selected ion recording mode, were tested for the optimum determination of analytes. Isotopically labelled standards were added before extraction as surrogates: [13C] BDE47, [13C] BDE99 and [13C] BDE153 for EI, and p,p’-DDE-D8 for NCI. The method was validated in terms of accuracy, precision, limits of detection and limits of quantification, using human breast tissue spiked at three levels in the range 1-50 ng/g (5-250 ng/g for BDE 209). The analytical approach using SPE clean-up followed by GC-MS (NCI) led to lower detection limits (0.006-2 ng/g) and allowed the determination of the most problematic congener, BDE 209, whose poor sensitivity made difficult its determination at low residue levels. Special attention was given to the confirmation of the compounds detected in samples in order to avoid reporting false positives. Two MS/MS transitions or three m/z ions were selected for each analyte when using EI or NCI modes, respectively. In both cases, the transition/ion intensity ratio was used as confirmation parameter. The developed methodology was applied to the analysis of real human samples. Several BDEs (BDEs congeners 47, 100, 99, 154, 153 183 and 209) were detected in the range of 0.08-0.23 ng/g -
Article: Pesticide residues and transformation products in groundwater from a Spanish agricultural region on the Mediterranean Coast
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ABSTRACT: An overview is given on the presence and changes over time of pesticide residues in groundwater from the Valencia region, one of the most important citrus cultivation sites of southern Europe. A multiresidue LC-MS/MS method was applied for the screening of around 50 pesticides in 75 water samples collected during 2000. The herbicides simazine, terbuthylazine, bromacil, terbumeton, and diuron were the most frequently detected compounds. On the basis of compounds detected in these samples, another method that focused on 30 herbicides and relevant transformation products (TPs) was developed and applied to around 80 water samples collected during 2003. Simazine was the most frequently found compound followed by several triazine metabolites. Data for this paper show the vulnerability of groundwater in this area to herbicide applications and illustrate the importance of including pesticide TPs in environmental monitoring programmes, as four out of the five compounds most frequently detected were pesticide TPs -
Article: Fast determination of toxic diethylene glycol in toothpaste by ultra-performance liquid chromatography–time of flight mass spectrometry
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ABSTRACT: A rapid method for determining diethylene glycol (DEG) in toothpaste based on the use of ultraperformance liquid chromatography (UPLC) coupled to time-of-flight mass spectrometry (TOF-MS) has been developed. The method has been validated in toothpaste samples spiked at different levels, 0.005, 0.1 and 5%, obtaining satisfactory recoveries (74–98%) and relative standard deviations (<4%). Quantification was carried out by using matrix-matched standards calibration. The developed method was applied to several types of toothpaste, making identification and quantification of DEG and other polyethylene glycols (PEG) feasible with very little sample manipulation, as only extraction with water is required. The excellent sensitivity of TOF-MS analysis performed in fullscan acquisition mode allowed the determination of DEG at concentration levels as low as 0.005% in samples and its reliable identification via the mass accuracy measurements provided by this instrument (<5 ppm)
