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    ABSTRACT: Neph proteins are evolutionarily conserved membrane proteins of the immunoglobulin superfamily that control the formation of specific intercellular contacts. Cell recognition through these proteins is essential in diverse cellular contexts such as patterning of the compound eye in Drosophila melanogaster, neuronal connectivity in Caenorhabditis elegans, and the formation of the kidney filtration barrier in mammals. Here we identify the PDZ and BAR domain protein PICK1 (protein interacting with C-kinase 1) as a Neph-interacting protein. Binding required dimerization of PICK1, was dependent on PDZ domain protein interactions, and mediated stabilization of Neph1 at the plasma membrane. Moreover, protein kinase C (PKCα) activity facilitated the interaction through releasing Neph proteins from their binding to the multidomain scaffolding protein zonula occludens 1 (ZO-1), another PDZ domain protein. In Drosophila, the Neph homologue Roughest is essential for sorting of interommatidial precursor cells and patterning of the compound eye. RNA interference-mediated knockdown of PICK1 in the Drosophila eye imaginal disc caused a Roughest destabilization at the plasma membrane and a phenotype that resembled rst mutation. These data indicate that Neph proteins and PICK1 synergistically regulate cell recognition and contact formation.
    Molecular and Cellular Biology 06/2011; 31(16):3241-51. · 5.04 Impact Factor
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    Johannes Lorscheider
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    ABSTRACT: Ein zentraler Bestandteil des glomerulären Filters der Niere sind die Fußfortsätze von Podozyten, die durch die Schlitzmembran miteinander verbunden sind. Schädigungen der Schlitzmembran der Niere führen zur Proteinurie und progredienter Nierenerkrankung. Dabei sind die zur Immunglobulin-Superfamilie gehörenden Neph-Proteine ein entscheidender Bestandteil des Proteinkomplexes am Podozytenfußfortsatz. Mitglieder der Neph-Protein-Familie interagieren mit dem PDZ-und-BAR-Domänen-Protein PICK1. Über die genaue Funktion dieser Proteine und ihrer Interaktoren in der Niere ist bislang wenig bekannt. Die vorliegende Arbeit konnte durch Immunfluoreszenz-Experimente nachweisen, dass das PDZ-und-BAR-Domänen-Protein PICK1 und Neph1-3 in zytosolischen Clustern sowie an bestimmten Abschnitten der Plasmamembran kolokalisieren. Diese Kolokalisation wird über die PDZ-Domäne von PICK1 vermittelt. Des Weiteren wurde das Protein ICA69 in Koimmunpräzipitations-(Co-IP)-Experimenten als Interaktionspartner von PICK1 identifiziert. Bei der Klonierung von ICA69 fand sich eine bisher noch nicht beschriebene, um 28 Aminosäurereste längere Spleißvariante des Proteins, für die jedoch keine funktionellen Unterschiede gezeigt werden konnten. In weiteren Co-IP-Experimenten ließ sich nachweisen, dass PICK1 entweder an ICA69 oder an Neph-Proteine gebunden im Podozyten vorliegt, nicht aber als Adaptermolekül mit ICA69 und Neph-Proteinen einen gemeinsamen Komplex bildet. Darüber hinaus zeigte sich, dass Koexpression von PICK1 einen stabilisierenden Einfluss auf ICA69 hat, was sich darauf zurückführen ließ, dass PICK1 den Abbau von ICA69 durch das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) verhindert. Die gewonnenen Ergebnisse sprechen dafür, dass das Zusammenspiel von PICK1 und ICA69 das Clustering und die Oberflächenexpression von Neph-Proteinen beeinflusst, und weisen auf eine mögliche Regulation dieser Prozesse durch das UPS hin. Damit kann für die Proteine PICK1 und ICA69 eine Beteiligung an der Organisation des Proteinkomplexes an der Schlitzmembran der Niere angenommen werden. Diseases of the glomerular filter of the kidney result in proteinuria and are a leading cause of end-stage renal failure. Recent studies have emphasized the critical role of the slit diaphragm of podocytes for the size-selective filtration barrier of the kidney. Among the key players in the protein complex at the podocytes’ foot processes are Neph-Proteins, transmembrane proteins of the Ig superfamily. Members of the Neph protein family interact with the PDZ and BAR domain protein PICK1. The distinct function of these proteins and their interactors, however, remains unclear. In this study it is shown by immunofluorescence that PICK1 and Neph1, 2 and 3 co-localise in cytosolic clusters and distinct parts of the plasma membrane. This co-localisation is mediated by the PDZ domain of PICK1. Furthermore, ICA69 was confirmed to be an interactor of PICK1 by co-immunoprecipitation. Additionally, we identified a previously unknown splice variant of ICA69 containing 28 additional amino acid residues. Yet, no changes in functional aspects could be shown for this new variant. Further co-immunoprecipitation experiments revealed that PICK1 is associated either with ICA69 or with Neph proteins and thus does not act as an adaptor between these proteins in a complex. We demonstrated that co-expression of PICK1 stabilised ICA69, which can be explained by our finding that PICK1 inhibits the degradation of ICA69 by the ubiquitin-proteasome system. These data suggest that PICK1 and ICA69 control clustering and surface expression of Neph proteins, implicating a possible regulation of this process by the ubiqitin-proteasome system. Therefore it can be assumed that PICK1 and ICA69 are involved in regulating the transmembrane protein composition at the slit diaphragm of the kidney.
    01/2009;