Publications (5)10.14 Total impact
-
Article: A facile, click chemistry-based approach to assembling fluorescent chemosensors for protein tyrosine kinases.
[show abstract] [hide abstract]
ABSTRACT: A group of fluorophore-labeled peptide substrates of Src kinases have been synthesized with the aid of click chemistry. Some of the generated peptides exhibit an increase in fluorescence upon phosphorylation and are capable of detecting Src kinases with high sensitivity and specificity. Their availability permits real-time activity measurement of aberrantly activated oncogenic Src kinases in the crude lysate of chronic myelogenous leukemia cells. These new chemosensor peptides are highly useful tools that can be used for high-throughput screening to search for small molecule inhibitors of Src kinases as potential therapeutics for cancer treatment.Bioorganic & medicinal chemistry letters 01/2011; 21(1):329-31. · 2.65 Impact Factor -
Article: Development of the procedures for high-yield expression and rapid purification of active recombinant Csk-homologous kinase (CHK): comparison of the catalytic activities of CHK and CSK.
[show abstract] [hide abstract]
ABSTRACT: Csk-homologous kinase (CHK) is an important endogenous inhibitor constraining the oncogenic actions of Src-family kinases (SFKs) in cells. It suppresses SFK activity by specifically phosphorylating the conserved regulatory tyrosine near the C-terminus of SFKs. In addition to phosphorylation, CHK employs a novel non-catalytic inhibitory mechanism to suppress SFK activity. This mechanism involves direct binding of CHK to the active forms of SFKs to form stable protein complexes. Since aberrant activation of SFKs contributes to cancer formation and progression, small-molecule inhibitors mimicking the non-catalytic inhibitory mechanism of CHK are potential anti-cancer therapeutics. Elucidation of the catalytic and regulatory properties and the structural basis of the CHK non-catalytic inhibitory mechanism would facilitate the development of these small-molecule inhibitors. To this end, we developed procedures for higher level expression in insect cells of active recombinant CHK with a hexa-histidine tag attached to its C-terminus (referred to as CHK-His(6)) and its rapid purification by a two-step method. Analyses by size-exclusion column chromatography and analytical ultracentrifugation revealed that the purified CHK-His(6) exists as a monomeric species in solution. Biochemical analyses demonstrated that CHK-His(6) exhibits efficiencies comparable to those of CSK in phosphorylating artificial protein and peptide substrates as well as an intact SFK protein. Our results indicate that the recombinant CHK-His(6) can be used for future studies to decipher the three-dimensional structure, and regulatory and catalytic properties of CHK.Protein Expression and Purification 12/2010; 74(2):139-47. · 1.59 Impact Factor -
Article: Structural elements and allosteric mechanisms governing regulation and catalysis of CSK-family kinases and their inhibition of Src-family kinases.
[show abstract] [hide abstract]
ABSTRACT: C-terminal Src kinase (CSK) and CSK-homologous kinase (CHK) are endogenous inhibitors constraining the activity of the oncogenic Src-family kinases (SFKs) in cells. Both kinases suppress SFKs by selectively phosphorylating their consensus C-terminal regulatory tyrosine. In addition to phosphorylation, CHK can suppress SFKs by a unique non-catalytic inhibitory mechanism that involves tight binding of CHK to SFKs to form stable complexes. In this review, we discuss how allosteric regulators, phosphorylation, and inter-domain interactions interplay to govern the activity of CSK and CHK and their ability to inhibit SFKs. In particular, based upon the published results of structural and biochemical analysis of CSK and CHK, we attempt to chart the allosteric networks in CSK and CHK that govern their catalysis and ability to inhibit SFKs. We also discuss how the published three-dimensional structure of CSK complexed with an SFK member sheds light on the structural basis of substrate recognition by protein kinases.Growth factors (Chur, Switzerland) 10/2010; 28(5):329-50. · 2.47 Impact Factor -
Article: Expression and characterization of serine proteinase inhibitor of the black tiger shrimp Penaeus monodon
[show abstract] [hide abstract]
ABSTRACT: Thesis (M.Sc.)--Chulalongkorn University, 2003 Expressed Sequence Tags (ESTs) analysis of the normal and Vibrio harveyi infected haemocyte cDNA libraries of Penaeus monodon identified 6 putative serine proteinase inhibitors that are homologous to a Kazal-type serine proteinase inhibitor (SPI) from crayfish. Four full-length cDNA clones of SPI were obtained. They have the difference in either number of Kazal domain or domain completeness. In this study, we selected a five Kazal-domain clone, sh415, which have 801 bp of open reading frame coding for 266 amino acids. This clone was expressed by using E. coli expression system. NH2-terminal truncated SPI gene, mature protein, was cloned into pTrcHis 2C. A 35 kDa protein band observed in recombinant pTrcHis 2C/SPI clone has higher intensity than that of parental pTrcHis 2C clone. The crude proteins of the recombinant clone were tested for serine proteinase inhibitory activity. In SPI activity gelatin/SDS-PAGE assay, the nondegraded-gelatin band with size of 35 kDa was observed in recombinant clone but not parental clone in trypsin, chymotrypsin, and subtilisin incubation. In inhibitory spectrum assay, trypsin, chymotrypsin, and subtilisin were inhibited their activities to 89 %, 70 %, and 8 %, respectively. The decrease in activity was not observed in elastase.Moreover, we also determined the change in SPI transcripts in haemocytes of V. harveyi challenged P. monodon by using in situ hybridization. We found that Kazal inhibitor expressed in the haemocytes. We discovered that average total haemocyte number was decreased at 6 h after V. harveyi injection. Weak hybridization signal was observed in haemocytes at 6 h after injection indicates the decrease in SPI expression at this time point comparing to others. The number of haemocytes expressing SPI significantly increased at 24 h after injection. Whereas the SPI expressed haemocyte numbers of the others were not significantly different. These results provide preliminary data for further studying SPI. จากห้องสมุด cDNA จากเม็ดเลือดกุ้งกุลาดำปกติและติดเชื้อวิบริโอได้แยกหายีนที่เกี่ยวข้องกับภูมิคุ้มกันของกุ้งกุลาดำ โดยเทคนิค Expressed Sequence Tags (ESTs) พบโคลนของตัวยับยั้งเซรีนโปรติเนส จำนวน 6 โคลน ในจำนวนนี้เป็นยีนที่สมบูรณ์จำนวน 4 โคลน ซึ่งมีความคล้ายคลึงกับตัวยับยั้งเซรีนโปรติเนส (serine proteinase inhibitor หรือ SPI) ชนิด Kazal ที่มีรายงานใน crayfish โดยทั้ง 4 โคลนอาจมีความแตกต่างกันที่จำนวนหรือความสมบูรณ์ของ Kazal domain การศึกษานี้เลือกศึกษายีนจากโคลนที่มีจำนวนโดเมน 5 โดเมน (โคลน SH415) ซึ่งมีบริเวณ open reading frame ที่มีขนาด 801 คู่เบส ซึ่งแปลรหัสให้โปรตีนที่มีกรดอะมิโนจำนวน 266 ตัว โดยทำการแสดงออกใน Escherichia coli และใช้ pTrcHis 2C เป็นเวคเตอร์ในการแสดงออก การทดลองนี้ทำการแสดงออกของตัวยับยั้งเซรีนโปรติเนสโดยตัดส่วนที่คาดว่าเป็น signal sequence ออก แล้วจึงโคลนเข้าสู่เวคเตอร์ ทำการคัดเลือกโคลนที่มีรีคอมบิแนนท์ pTrcHis 2C/SPI และวิเคราะห์โปรตีนที่ได้จากการแสดงออก เมื่อเปรียบเทียบระหว่างโคลนที่มี pTrcHis 2C และโคลนที่มีรีคอมบิแนนท์ pTrcHis 2C/SPI พบแถบโปรตีนขนาดประมาณ 35 กิโลดาลตันที่มีความแตกต่างในความเข้มของแถบโปรตีน โดยพบว่ามีความเข้มสูงกว่าในโคลนที่มี รีคอมบิแนนท์ pTrcHis 2C/SPI เมื่อนำโปรตีนหยาบที่ได้ไปทดสอบแอคติวิตีในการยับยั้งเซรีนโปรติเนสชนิด ต่าง ๆ โดยวิธี proteinase inhibitor activity gelatin/SDS-PAGE assay พบแถบของเจลาตินที่ไม่ถูกย่อยขนาดประมาณ 35 กิโลดาลตันในส่วนที่เป็นโปรตีนหยาบจากโคลนที่มีรีคอมบิแนนท์ pTrcHis 2C/SPI เมื่อทดสอบกับ trypsin, chymotrypsin และ subtilisin โดยไม่พบแถบโปรตีนในโคลนที่มี pTrcHis 2C เมื่อทดสอบแอคติวิตี ในการยับยั้งเซรีนโปรติเนสของโปรตีนหยาบโดยวิธี inhibitory spectrum assay พบว่าแอคติวิตีของเอนไซม์ลดลง 89 %, 70 % และ 8 % เมื่อทดสอบกับ trypsin, chymotrypsin และ subtilisin ตามลำดับ แต่ไม่พบการลดลง ของแอคติวิตีเมื่อทดสอบกับ elastase เมื่อศึกษาการเปลี่ยนแปลงในการแสดงออกของเอ็มอาร์เอ็นเอของตัวยับยั้งเซรีนโปรติเนสในเม็ดเลือดกุ้งกุลาดำที่ติดเชื้อวิบริโอ โดยใช้เทคนิค in situ hybridization พบว่ายีนนี้มีการแสดงออกในเซลล์เม็ดเลือดของ กุ้งกุลาดำ ค่าเฉลี่ยของจำนวนเม็ดเลือดทั้งหมดในกุ้งที่ติดเชื้อเป็นเวลา 6 ชั่วโมงมีค่าน้อยกว่ากุ้งในกลุ่มอื่น ๆ และพบว่าการแสดงออกตัวยับยั้งเซรีนโปรติเนสในเม็ดเลือดของกุ้งที่ติดเชื้อเป็นเวลา 6 ชั่วโมงลดลงเมื่อเทียบกับการแสดงออกในเม็ดเลือดกุ้งที่เวลาอื่น ๆ นอกจากนี้จำนวนเม็ดเลือดที่มีการแสดงออกของตัวยับยั้งเซรีนโปรติเนส เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในกุ้งที่ติดเชื้อเป็นเวลา 24 ชั่วโมง ในขณะที่จำนวนเม็ดเลือดที่มีการแสดงออกของตัวยับยั้งเซรีนโปรติเนสในกุ้งกลุ่มอื่น ๆ มีค่าใกล้เคียงกัน ข้อมูลที่ได้นี้จัดเป็นข้อมูลเบื้องต้นสำหรับการศึกษาตัวยับยั่งเซรีนโปรติเนสชนิดนี้ต่อไป -
Article: Recombinant expression and characterization of five-domain Kazal-type serine proteinase inhibitor of black tiger shrimp (Penaeus monodon).
[show abstract] [hide abstract]
ABSTRACT: Four full-length complementary DNAs of Kazal-Type serine proteinase inhibitors (SPIs) were identified from hemocyte cDNA libraries of the black tiger shrimp Penaeus monodon and recognized as having 4 (SPIPm1) and 5 (SPIPm2, SPIPm3, and SPIPm4) Kazal domains. SPIPm2 encoding a complete 5-Kazal-domain inhibitor was expressed in the Escherichia coli system. Inhibitory activity of crude proteins against various serine proteases was tested using SPI activity gelatin with sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis and inhibitory spectrum assays. A 32-kDa recombinant protein (rSPIPm2) showed inhibitory activity against trypsin, chymotrypsin, and subtilisin, but not elastase. Concordantly, inhibitory spectrum assays showed that crude rSPIPm2 strongly inhibited trypsin (89%) and chymotrypsin (70%), but less effectively inhibited subtilisin (8%), and did not inhibit elastase activity. Northern blot analysis of hemocyte total RNA showed 2 SPI transcripts of 1.6 and 1.7 kb in size. Tissue-specific expression using reverse transcriptase polymerase chain reaction suggests that SPIPm2 is exclusively expressed in hemocytes of P. monodon.Marine Biotechnology 7(1):46-52. · 3.43 Impact Factor
