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[ON DATA ON SWEET ALMOND EMULSIN].

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    ABSTRACT: The association of some natural and synthetic polyphenols with beta-glucosidase was examined and some observations on the chemical nature of the complex were made.
    Biochemical Journal 05/1974; 139(1):285-8. · 4.78 Impact Factor
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    ABSTRACT: Etwa eine halbe Millionen Menschen in Deutschland werden mit Antikoagulantien behandelt. Nach Schätzungen wird sich der Markt für antithrombotische Medikamente bis 2010 verdoppeln. Die derzeit verwendeten Antikoagulantien weisen Nachteile wie fehlende orale Verfügbarkeit oder schmale therapeutische Fenster auf. Naturstoffe sind traditionell eine reiche Quelle für neue Leitstrukturen. Auch innerhalb der Gruppe der Antikoagulantien leiten sich viele Wirkstoffe von Naturstoffen ab. Unter den verschiedenen Naturstoffklassen bieten Pflanzenextrakte die einfachste Möglichkeit die wirksame Substanz durch Upscaling zu isolieren. Daher bildeten sie den Ausgangspunkt für die Suche nache Thrombininhibitoren. Ziel dieser Arbeit war die Isolierung von Thrombininhibitoren aus Pflanzen. In einem ersten Schritt wurden dazu Methanol- und Dichlormethanextrakte von 78 verschiedenen Arzneidrogen hergestellt und mittels eines amidolytischen Testsystems auf ihre Thrombin hemmende Wirkung untersucht. Um eine ausschließlich durch bestimmte Substanzklassen verursachte Hemmung auszuschließen, wurde auf Gerbstoffe, Makromoleküle und "promiscuous inhibitors" getestet. Am Ende der Testserien wurde Adonidis herba für die weitere Bearbeitung ausgewählt. Durch die Bestimmung der Hemmung von Thrombin vor und nach der Entfernung von Gerbstoffen, kann die Aussage getroffen werden, ob die Hemmung ausschließlich von Gerbstoffen ausgeht. Aufgrund der großen Probenanzahl erschien die Verwendung einer Fällungsmethode vorteilhaft. Verbreitet als Gerbstofffällungsreagenzien sind Coffein, Polyvinylpyrrolidon, Gelatine und Bleiacetat. Diese vier Gerbstofffällungsreagenzien wurden untereinander in ihrer Beeinflussbarkeit durch den pH-Wert, verschiedene Lösungsmittel und die Konzentration des Gerbstofffällungsreagenzes verglichen. Desweiteren wurde ihr Einfluss auf die Fällung anderer Phenolklassen und Thrombin untersucht. Polyvinylpyrrolidon zeigte sich am besten geeignet, um unter den verwendeten Testbedingungen Gerbstoffe zu entfernen. Bleiacetat erwies sich als ungeeignet. Gerbstoffen werden im Allgemeinen eine hohe Reaktivität und damit eine unspezifische Hemmwirkung nachgesagt. Um diese Aussage zu überprüfen, wurde getestet, ob kondensierte Gerbstoffe selektiv mit unterschiedlichen Proteinen reagieren. Dazu wurden die kondensierten Gerbstoffe aus Cinnamomi cortex isoliert und mit unterschiedlichen Proteinen gefällt. Nach der Fällung wurden die kondensierten Gerbstoffe abgebaut und die Abbaumuster miteinander verglichen. Es zeigte sich, dass kondensierte Gerbstoffe durchaus spezifisch mit unterschiedlichen Proteinen reagieren. Das Thrombin hemmende Prinzip in Adonidis herba wurde gefunden. Es zeigte sich, daß die Fettsäuren Linol- und Linolensäure, die neben Palmitinsäure in Adonis vernalis enthalten sind, für die Wirkung verantwortlich sind. Zwei weitere aktive Drogen, Semen Erucae und Flores Sambuci wurden ebenfalls untersucht. Auch hier waren Fettsäuren die wirksamen Verbindungen. Zusätzlich zu Linol- und Linolensäure waren Öl- und Eicosensäure wirksam. Eine synergistische Hemmung von Thrombin durch die Mischung der Fettsäuren wurde nicht beobachtet. Eine erweiterte Untersuchung der Hemmung von Thrombin durch Fettsäuren brachte das Ergebniss, dass auch Vaccensäure, Eicosatriensäure, Ricinolsäure und Arachidonsäure Thrombin hemmen. Die Hemmung von Thrombin erfolgte zeitabhängig und abhängig von der Inkubationszeit. Letzeres jedoch nur, wenn die Reaktion durch die Zugabe von Substrat gestartet wurde. Aufgrund weiterer Experimente erscheint die Blockade der Bindetasche jedoch weniger wahrscheinlich. Ein Zusammenhang zwischen physikochemischen Parametern und der Hemmwirkung konnte nicht gefunden werden. Die übliche Vorgehensweise zur Isolierung von Inhibitoren aus einer Pflanze ist die wirkorientierte Fraktionierung. Seit mehreren Jahren wird das "Ligandenfischen" verwendet um die wirkorientierte Fraktionierung zu beschleunigen. Mittlerweile wurden ähnliche Methoden publiziert, die alle die Abtrennung eines Enzym-Ligand-Komplexes gemeinsam haben. Durch anschließende Analyse dieses Komplexes erhält man Informationen wie die Retentionszeit und das UV-Spektrum des Inhibitors. Diese Informationen erlauben eine gezieltere Isolierung. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde gezeigt, daß die Wechselwirkungen zwischen Thrombin und Gerbstoffen ebenfalls genutzt werden können, um einen Inhbitor als Enzym-Inhibitor-Komplex von einer Matrix abzutrennen. Die Methode gelang mit einfachen Mitteln, war kostengünstig, schnell und mittels analytischer HPLC durchzuführen. Approximate half a million people in Germany are treated with anticoagulants. It is expected that the market for antithrombotics will double until 2010. The currently used anticoagulants have disadvantages such as a lack of oral availability or narrow therapeutic windows. Natural products have been a rich source of lead structures. Among the group of anticoagulants there are many agents which derive from natural products. Within the different classes of natural products, plants offer the easiest way to isolate the active substance by upscaling. Therefore plants were the starting point for our search for thrombin inhibitors. The aim of this work was to isolate thrombin inhibitors from plants. In a first step methanol and dichlormethane extracts of 78 different drugs were prepared. They were tested for thrombin inhibition using an amidolytic assay. In order to avoid an inhibition due to the presence of certain substance classes we tested on tannins, macromolecules and promiscuous inhibitors. At the end of all tests, Adonis herb was chosen for futher examination. By testing the inhibition of thrombin before and after removing tannins, we can determine if the inhibition was only caused by tannins. Due to the great number of samples, the use of a precipitation method for the removal of tannins is to be prefered. Common as precipitation reagents are caffeine, polyvinylpyrrolidone, gelatine and lead acetate. The pH, different solvents and the concentration of the precipitation reagent were compared for their influence on these four tannin precipitation reagents. Futhermore the influence of the precipitation reagents on the activity of thrombin and the precipitation of other phenols was examined. Polyvinylpyrrolidone showed the best properties to remove tannins under the test conditions used. Lead acetate proved to be inappropriate. Tannins are usually said to have a high reactivity linked with an unspecific inhibition. With the aim of proving this thesis, it was tested if condensed tannins interact with different proteins selectively. Thereto the condensed tannins from Cinnamon bark were isolated. Then the condensed tannins were precipitated with different proteins. After the precipitation the condensed tannins were degradaded and the degradation pattern were compared. It was shown that condensed tannins interact with different proteins selectively. Moreover, the compound in Adonis herb which causes thrombin inhibition was found and it was shown that the fatty acids linoleic and linolenic acid inhibit thrombin. Additionally palmitic acid was found in Adonis herb. Two other drugs, Erucae semen and Sambuci flos, which also inhibit thrombin, were examined as well. It was shown that again fatty acids inhibit thrombin. Linoleic, linolenic, oleic and eicosenic acid show inhibition. A mixture of the fatty acids did not show a synergistic inhibition. A futher analysis of the inhibition of thrombin by fatty acids showed that vaccenic, eicosatrienic, ricinoleic and arachidonic acid inhibit thrombin as well. However, the inhibition is time-dependent and dependent from the incubation time. Dependency on the incubation time occurred only when the amidolytic assay was started by the addition of the substrate. Because of futher experiments a blockade of the active site by fatty acids seems unlikely. A connection between the inhibition of thrombin and the physicochemical parameters of the fatty acids could not be established. The common procedure for the isolation of inhibitors from plants is a bioassay-guided isolation. Since several years the method "Ligandenfischen" is used in our working group to accelerate the bioassay-guided isolation. Similar methods were published as well. All methods share the separation of an enzyme-ligand-complex from the matrix. By subsequent analysis of this complex, futher information like the retention time and the uv spectra can be obtained. These pieces of information could accelerate the process of the isolation of a compound. As another part of this work it was shown that the interaction between thrombin and tannins can be used to separate an inhibitor as enzyme-inhibitor-complex from a matrix. The method was simple, cheap, fast and practicable by means of analytical hplc.
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    ABSTRACT: Saccharomyces lactis strain Y-123, a constitutive high producer of beta-glucosidase (B(h)), was grown in an enriched medium. beta-Glucosidase, extracted most easily by cell autolysis, was purified by successive ammonium sulfate precipitation, ethyl alcohol precipitation, gel filtration, calcium phosphate gel adsorption-elution, and hydroxyapatite column chromatography. The specific activity of the enzyme increased 200-fold during the purification. The electrophoretic and catalytic properties of the enzyme did not change during the procedure. Polyacrylamide gel disc electrophoresis of the partially purified enzyme revealed one major and several minor protein-staining bands. beta-Glucosidase activity in the polyacrylamide gel columns was measured directly by assaying sections of columns frozen and sliced immediately after electrophoresis. Most of the activity coincided with the major protein-staining band. Prolonged assay produced minor activity coinciding with the less intense protein bands. Properties of the enzyme suggest that it is a single, unconjugated, intracellular, high molecular weight protein. The purification procedure is applicable to strains of S. lactis which possess alleles of the B locus for beta-glucosidase synthesis.
    Journal of Bacteriology 11/1968; 96(4):1181-6. · 2.69 Impact Factor