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PTP-1B is an essential positive regulator of platelet integrin signaling

Department of Medicine, University of California, San Diego, La Jolla, CA 92093, USA.
The Journal of Cell Biology (Impact Factor: 9.69). 09/2005; 170(5):837-45. DOI: 10.1083/jcb.200503125
Source: PubMed

ABSTRACT Outside-in integrin alphaIIbbeta3 signaling is required for normal platelet thrombus formation and is triggered by c-Src activation through an unknown mechanism. In this study, we demonstrate an essential role for protein-tyrosine phosphatase (PTP)-1B in this process. In resting platelets, c-Src forms a complex with alphaIIbbeta3 and Csk, which phosphorylates c-Src tyrosine 529 to maintain c-Src autoinhibition. Fibrinogen binding to alphaIIbbeta3 triggers PTP-1B recruitment to the alphaIIbbeta3-c-Src-Csk complex in a manner that is dependent on c-Src and specific tyrosine (tyrosine 152 and 153) and proline (proline 309 and 310) residues in PTP-1B. Studies of PTP-1B-deficient mouse platelets indicate that PTP-1B is required for fibrinogen-dependent Csk dissociation from alphaIIbbeta3, dephosphorylation of c-Src tyrosine 529, and c-Src activation. Furthermore, PTP-1B-deficient platelets are defective in outside-in alphaIIbbeta3 signaling in vitro as manifested by poor spreading on fibrinogen and decreased clot retraction, and they exhibit ineffective Ca2+ signaling and thrombus formation in vivo. Thus, PTP-1B is an essential positive regulator of the initiation of outside-in alphaIIbbeta3 signaling in platelets.

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Available from: Barry Moran, Aug 14, 2015
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    ABSTRACT: Group IVA cytosolic phospholipase A2 (cPLA2) catalyzes release of arachi- donic acid from glycerophospholipids, leading to thromboxaneA2 (TxA2) produc- tion. Some platelet agonists stimulate cPLA2, but others require fibrinogen binding to IIb3 to elicit TxA2. Therefore, relationships between cPLA2 and IIb3 were examined. cPLA2 and a cPLA2 binding partner, vimentin, coimmunopre- cipitated with IIb3 from platelets, inde- pendent of fibrinogen binding. Studies with purified proteins and with recombi- nant proteins expressed in CHO cells determined that the interaction between cPLA2 and IIb3 was indirect and was dependent on the IIb and 3 cytoplasmic tails. Fibrinogen binding to IIb3 caused an increase in integrin-associated cPLA2 activity in normal platelets, but not in cPLA2-deficient mouse platelets or in hu- man platelets treated with pyrrophenone, a cPLA2 inhibitor. cPLA2 activation down- stream of IIb3 had functional conse- quences for platelets in that it was required for fibrinogen-dependent recruitment of ac- tivated protein kinase Cto the IIb3 com- plex and for platelet spreading. Thus, cPLA2andIIb3interacttoreinforceeach other's functions during IIb3 signaling. Thisprovidesaplausibleexplanationforthe role of IIb 3i n TxA2 formation and in the defective hemostatic function of mouse or humanplateletsdeficientincPLA2.(Blood. 2009;113:447-457)
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    ABSTRACT: The interaction of cancer with the immune system has long been established. Modernapproaches to cancer immunotherapy concentrate on boosting host resistance by vaccines, killer cells or cytokines, such as interleukin-2 or interferons. Little attention has been paid to the possibility of sensitizing tumor cells to immune mediated attack.The non-steroidal antiestrogenic agents, tamoxifen (TX) and toremifene (TO) are widely used for the treatment of estrogen receptor positive mammary carcinomas and other sex hormone dependent tumors. We discovered that TX and TO sensitize tumor cells for killing by natural killer (NK), lymphokine activated killer (LAK) and cytotoxic T lymphocytes (CTL). We also demonstrated that TX and TO potentiated the immunotherapy of lethal cancer in syngeneic murine tumor-host system. DBA/2 and C3H mice were injected with lethal doses of tumor cells subcutaneously. Combination therapy with NK, LAK or CTL effector cells and antiestrogens could cure lethal cancer in up to 75% of mice.Lymphocytes freshly isolated from the ascites of patients with ovarian cancer had no lytic effect on autologous tumor cells. Activation of tumor associated lymphocytes (TAL) or tumor infiltrating lymphocytes (TIL) with hrIL-2 in the presence of autologous tumor cells induced detectable cytotoxicity in most of the cell cultures. A highly significant increase of tumor cell lysis was found when both target and effector cells were treated with antiestrogens. Additional treatment with interferon-alpha resulted in the further enhancement of cytotoxicity in a significant number of cases.It is clear from our results that TX and TO are capable of increasing the susceptibility ofhuman ovarian and lung cancer cells to autologous killer cells in about 60% of the cases so examined. Sensitization requires the active metabolic participation of the target cells suggesting the amplification of programmed cell death as the underlying mechanism. Both the Fas/Fas-L and perforin/granzyme pathways, which can trigger apoptosis, are affected by antiestrogens. This was further supported by the observations that Fas receptor expression on ovarian carcinoma cells and the Fas-antibody mediated killing of ovarian carcinomas were upregulated by antiestrogen treatment. In contrast, TX and TO did not stimulate the Fas-L expression on killer cells. The lack of correlation between Fas receptor expresion and drug induced increase of kille cell mediated cytolysis suggest the participation of the perforin/granzyme pathway. K562 cells are Fas negative and are not susceptible to anti-Fas mediated cytolysis. However, antiestrogen treatment significantly inceased the NK cell mediated cytotoxicity of K562 cells. The total abrogation of cell death by chelation of extracellular Ca++ indicates that NK cell mediated cytolysis of K562 cells was dependent on perforin/grenzyme pathway. Similar results were obtained with the Fas receptor positive ovarian carcinomas.It is clear from our results that antiestrogens reder the cancer cells more susceptible forkiller cell mediated destruction, and thereby potentiate immune defence against cancer. On the basis of our combination immunotherapy experiments in tumor bearing mice we now conduct feasibility trials for the development of treatment protocols for the combination immunotherapy of cancer in man.
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    ABSTRACT: Die Regulation zellulärer Signalwege erfolgt unter anderem über die kontrollierte Aktivität von Proteintyrosinkinasen und Proteintyrosinphosphatasen (PTP). Letztere sind in der Lage, phosphorylierte Tyrosinreste zu dephosphorylieren und damit die Signaleigenschaften und gegebenenfalls die Aktivität der Substrate zu verändern. Die Kontrolle der PTP-Aktivität wiederum erfolgt auf vielen Ebenen. Hierzu gehören, je nach PTP, Expression und Protein- stabilität, kovalente Modifikationen, wie Phosphorylierung oder SUMOylierung, zelluläre Lokalisation und Interaktion mit regulatorischen Proteinen, sowie die Dimerisierung. Ein weiterer Faktor ist die Oxidation des in klassischen PTP deprotoniert vorliegenden Cysteins, das für die Katalyse der Dephosphorylierungsreaktion notwendig ist. Die Oxidation dieses Cysteins durch erhöhte zelluläre Spiegel an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) geht mit einer (zumeist reversiblen) Inaktivierung der PTP einher. Sie ist zum Beispiel im Falle der Stimulation von Zellen mit mitogenen Faktoren, zum Beispiel Insulin, für die vollständige Rezeptoraktivierung notwendig. Zu den weiteren Stimuli, die eine PTP-Oxidation in der Zelle auslösen können, gehört die Bestrahlung mit UV-A- und UV-B-Licht. Infolge einer UV- Behandlung von Zellen erfolgt neben der oxidativen Hemmung zudem auch ein Calpain- abhängiger Abbau von verschiedenen PTP, der mit einer Liganden-unabhängigen EGFR-Aktivierung einhergeht. Die Integration der Calpain-Aktivierung und PTP-Oxidation führt zu einem weiteren regulatorischen Eingriff in die PTP-Aktivität. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit erfolgte eine genauere Charakterisierung dieses neuen Regulationsmechanismus. Es gelang, die Abbaubedingungen von PTP-Oxidation und gleichzeitiger Calpain-Aktivierung in vitro mit aufgereinigten Proteinen zu rekonstruieren. Hierfür wurde PTP1B als Modell gewählt, da diese PTP bereits sehr gut charakterisiert ist und bereits Kristallstrukturen der verschiedenen Oxidationszustände aufgeklärt sind. Es konnte gezeigt werden, dass die reversible Oxidation des katalytischen Cysteins Voraussetzung für die Spaltung durch Calpain ist. Eine Hauptspaltstelle innerhalb der katalytischen Domäne wurde identifiziert, deren Spaltung zu einer dauerhaften Inaktivierung der Phosphatase führt. Darüber hinaus wurde eine erhöhte Bindung der oxidierten PTP1B an Calpain, unabhängig von dessen Aktivierungszustand, detektiert. Darauf basierend und mit Hilfe verschiedener Mutanten konnte folgendes Modell der oxidationsspezifischen Spaltung entwickelt werden: 1.) Die Konformationsänderungen infolge der Oxidation führen zu einer verstärkten Bindung der PTP an Calpain, an einer Domäne jenseits des katalytischen Zentrums. 2.) Aktives Calpain spaltet dadurch die oxidierte PTP deutlich effizienter, wobei die Spaltung an der dem katalytischen Zentrum abgewandten Seite der PTP erfolgt. 3.) Eine Mutationsanalyse ergab, dass die Primärsequenz in der Umgebung der Spaltstelle von untergeordneter Bedeutung für die Effizienz der Spaltung ist. Eine weitere Untersuchung des identifizierten Regulationsprinzips in UV-bestrahlten Zellen war aufgrund der instabilen Resultate nicht möglich. Es ist denkbar, dass noch unbekannte Gegenregulations-Mechanismen in das System eingreifen und diese dringend näher untersucht werden müssen. Mit Hilfe von Calpain-negativen Zellen gelang es jedoch, eine aktivierende Funktion des Calpains im Insulin-Signalweg zu zeigen. Die Insulinstimulierte Aktivierung der Signalmoleküle AKT und S6-Kinase war in Abwesenheit von Calpain-4 stark reduziert. Obwohl eine Rolle in diesem System noch nicht nachgewiesen werden konnte, wäre der oxidationsspezifische PTP-Abbau durch Calpain ein möglicher Mechanismus, mittels dessen Calpain die Signalweiterleitung moduliert. Eine weiterführende Untersuchung dieses Phänomens kann möglicherweise Zusammenhänge zwischen Calpain und der Deregulation der Insulin-Signalübertragung beim Diabetes mellitus aufdecken.
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