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Highly Efficient Chemoenzymatic Synthesis of Novel Branched Thiooligosaccharides by Substrate Direction with Glucansucrases

Technical Chemistry, Department for Carbohydrate Technology, Technical University Braunschweig, Hans-Sommer Strasse 10, 38106 Braunschweig, Germany.
ChemBioChem (Impact Factor: 3.06). 02/2007; 8(3):273-6. DOI: 10.1002/cbic.200600444
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Available from: Lubbert Dijkhuizen, Aug 28, 2015
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    • "Compound Reference Alditols (Demuth et al., 2002) 1,5-Anhydro-d-fructose a (Richard et al., 2005) 3,4-Hydroxyphenyl-l-alanine (l-DOPA) b (Yoon et al., 2010) ␣-& ␤-methyl hexopyranosides c (Côté and Dunlap, 2003) ␣-Butyl-and octyl-d-glucopyranoside a (Richard et al., 2003) Acarbose b (Yoon and Robyt, 2002) Aliphatic alcohols d (Seibel et al., 2006) Alkyl glucosides e (Kim et al., 2009) Arbutin e (Moon et al., 2007) Astragalin b (Kim et al., 2012) Catechol l (Meulenbeld and Hartmans, 2000) Cellobiose f (Arguello Morales et al., 2001) d-Tagatose c (Côté et al., 2005a) Epigallocatechin gallate e (Moon et al., 2006) Gentiobiose c (Côté, 2009a) Hydroquinone g (Seo et al., 2009) l-Ascorbic acid h (Kim et al., 2010) l-Glucose c (Côté et al., 2005a) l-Rhamnose and methyl-␣-l-rhamnose k (Champion et al., 2009) Luteolin and myricetin (flavonoids) a (Bertrand et al., 2006) Luteolin and quercetin (flavonoids) f (Bertrand et al., 2006) Methyl-& allyl 6-O-tosyl-␣-d-glucopyranoside a , d , m (Hellmuth et al., 2007) Methyl ␣-d-glucopyranoside i (de Segura et al., 2006) N-acetyl-d-glucosamine a (Champion et al., 2009) Raffinose c (Côté et al., 2009b) Salicin and salicyl alcohol j (Seo et al., 2005) Salicin, salicyl alchol and phenol g (Seo et al., 2005) a L. mesenteroides NRRL B-512F dextransucrase. b L. mesenteroides NRRL B-512FMCM dextransucrase. "
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    ABSTRACT: Glucansucrases are extracellular enzymes that synthesize a wide variety of α-glucan polymers and oligosaccharides, such as dextran. These carbohydrates have found numerous applications in food and health industries, and can be used as pure compounds or even be produced in situ by generally regarded as safe (GRAS) lactic acid bacteria in food applications. Research in the recent years has resulted in big steps forward in the understanding and exploitation of the biocatalytic potential of glucansucrases. This paper provides an overview of glucansucrase enzymes, their recently elucidated crystal structures, their reaction and product specificity, and the structural analysis and applications of α-glucan polymers. Furthermore, we discuss key developments in the understanding of α-glucan polymer formation based on the recently elucidated three-dimensional structures of glucansucrase proteins. Finally we discuss the (potential) applications of α-glucans produced by lactic acid bacteria in food and health related industries.
    Journal of Biotechnology 07/2012; 163(2). DOI:10.1016/j.jbiotec.2012.06.037 · 2.88 Impact Factor
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    ABSTRACT: La synthèse d’oligosides complexes et glycoconjugués reste difficilement réalisable par voie chimique, freinant ainsi l’exploitation de ces molécules à grande échelle. Le recours aux catalyseurs enzymatiques apparaît comme une alternative prometteuse mais les enzymes naturelles ne présentent pas toujours les propriétés adéquates, en particulier sur le plan de leurs spécificités, pour être intégrées dans des voies de synthèse chimio-enzymatiques. Le défi de cette thèse a consisté à mettre à profit les techniques d’ingénierie enzymatique pour concevoir des glyco-enzymes déployant de nouvelles spécificités, produire à façon des intermédiaires de synthèse chimique et ouvrir la voie à de nouveaux procédés d’obtention d’oligosides d’intérêt thérapeutique. Il s’agissait de développer de nouvelles transglucosidases capables de glucosyler des dérivés de la N-acétyl-D-glucosamine et du L-rhamnose pour produire des disaccharides n’existant pas dans la nature mais pouvant entrer dans une voie de synthèse chimique destinées à synthétiser des haptènes oligosaccharidiques mimant les motifs antigéniques des lipopolysaccharides des sérotypes 1b et 3a de Shigella flexneri. A terme, l’objectif est de développer un vaccin multivalent de troisième génération contre ces pathogènes, responsables du décès de milliers de personnes chaque année dans le monde. Pour relever ce défi, nous avons tout d’abord évalué le potentiel de quatre glucane-saccharases sauvages, spécifiques de la synthèse de liaisons osidiques distinctes, à glucosyler les accepteurs cibles. Les résultats obtenus ont montré qu’aucune des enzymes testées ne catalysait efficacement la réaction attendue. Cette étude préliminaire a cependant permis de sélectionner l’amylosaccharase de Neisseria polysaccharea, comme enzyme candidate au développement de biocatalyseurs à stéréo- et régio-spécificités contrôlées. Le remodelage du catalyseur a été guidé par l’analyse des modèles des complexes enzyme:accepteur. Sept acides aminés situés dans le site de fixation de l’accepteur (sous-site +1) ont été identifiés et individuellement remplacés par les 19 acides aminés possibles par mutagénèse dirigée. Une banque de 133 mutants a été créée qui renfermait 43 mutants d’intérêt pour les réactions de glucosylation considérées. Notamment, le mutant I228Y a révélé une toute nouvelle régio-spécificité vis-à-vis de l’α-methyl L-rhamnopyranose. Il s’agit du premier exemple de création de nouvelle spécificité pour les enzymes de cette famille et plus largement pour des α-transglycosidases. Le mutant F290K, également isolé dans cette première librairie, s’est montré capable de glucosyler l’α-allyl N-acétyl-D-glucoamine avec une efficacité catalytique 130 fois plus élevée que celle observée avec l’enzyme sauvage. Ces deux nouvelles enzymes ont été employées pour la synthèse des disaccharides ciblés et la validation de la voie chimio-enzymatique proposée pour la synthèse des haptènes saccharidiques. Cette stratégie a été poursuivie par la construction de banques de double-mutants permettant de générer une diversité plus importante, focalisée sur ces positions, et rechercher des effets synergiques entre les différentes mutations pour améliorer la réaction de glucosylation des accepteurs cibles. Vingt double-mutants ont pu être ainsi identifiés.------------------------------------------------------------------------------------------------------- The difficult access to complex carbohydrates and glycoconjugates by chemical synthesis impairs their development on a large scale. Therefore, the use of biocatalysts appears as an appealing alternative, yet poorly exploited in spite of the fast-growing development of engineering technologies allowing the search and the construction of better performing enzymes, displaying novel specificities. The objective of this thesis aimed to apply enzyme engineering techniques to conceive novel glyco-enzymes well-adapted for the glucosylation of naturally non- or poorly recognized molecules (N-acetyl-D-glucosamine and L-rhamnose derivatives fulfilling the subsequent chemical step requisites). The glucosylated motives obtained via the enzymatic route, and corresponding to the serotype-specific branched α-D-glucopyranosyl linkages of Shigella flexneri 2a, 1b and 3a, are subsequently elongated through a chemical synthetic pathway to synthesize the antigenic oligosaccharides. This chemo-enzymatic road could open the way to oligosaccharide haptens at low cost, that could in the future be used in the development of a third-generation vaccine against S. flexneri 1b and 3a. In a first study, we have evaluated the potential of four wild-type glucansucrases, specific for the synthesis of distinct osidic linkages, to glucosylate both types of targeted acceptors. Our preliminary results demonstrated that none of the tested glucansucrases allowed an efficient glucosylation of the target acceptors with the desired linkage specificity. On the basis of these results, amylosucrase from Neisseria polysaccharea was chosen as a candidate enzyme for the development of biocatalysts with controlled stereo- and regio-specificities that could enable the glucosylation of both types of acceptors of interest. A semi-rational approach based on the engineering of the acceptor binding site (subsite +1) was undertaken to evolve this enzyme. By individually exploring 7 positions of the active site using site-directed mutagenesis, the strategy led to the isolation of 47 mutants of interest for the considered glucosylation reactions (over the 133 generated mono-mutants) and to the identification of 2 key positions (228 and 290). Noteworthy, I228Y mutant displayed an entirely novel regio-specificity towards the α-methyl L-rhamnopyranose and in the presence of allyl N-acetyl-D-glucosamine, F290K mutant permitted a 130 fold enhancement of catalityc efficiency compared to wild-type amylosucrase. This strategy was further pursued with the construction of double-mutant libraries enabling the generation of an enlarged diversity, focused on the identified positions, to investigate the synergistic effects between the different mutations in order to improve the glucosylation reactions of the target acceptors. Twenty double-mutants were thus identified
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    ABSTRACT: C-6 opening of 5,6-cyclic sulfate derivatives of mannofuranose with a thiolate anion followed by acidic hydrolysis of the acyclic sulfate gave 6-S-alkyl derivatives in good yields (70-95%) and short reaction times (10-15min). This methodology was applied to the synthesis of methyl 2,3-O-isopropylidene-6-S-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-beta-d-glucopyranosyl)-6-thio-alpha-d-mannofuranoside (70%), 2,3-O-isopropylidene-6-S-(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-beta-d-glucopyranosyl)-6-thio-alpha-d-mannofuranose (87%) and 2,3-O-isopropylidene-6-S-(1,2:3,4-di-O-isopropylidene-alpha-d-galactopyranos-6-yl)-6-thio-alpha-d-mannofuranose (87%).
    Carbohydrate Research 09/2007; 342(11):1490-5. DOI:10.1016/j.carres.2007.05.016 · 1.92 Impact Factor
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