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Trace analysis of fumagillin in honey by liquid chromatography-diode array-electrospray ionization mass spectrometry.

IU CINQUIMA, Analytical Chemistry, Faculty of Sciences, University of Valladolid, 47005 Valladolid, Spain. <>
Journal of Chromatography A (Impact Factor: 4.61). 06/2008; 1190(1-2):224-31. DOI: 10.1016/j.chroma.2008.03.019
Source: PubMed

ABSTRACT In this work a new liquid chromatography with diode array detection and electrospray ionization mass spectrometry (LC-DAD-ESI-MS) method has been developed for the determination of fumagillin residues in honey. This procedure involves a solid-phase extraction on polymeric cartridges for the isolation of fumagillin from diluted honey. Chromatographic separation of fumagillin was performed in isocratic mode, on a C(18) column (150 mm x 4.60mm i.d., 5 microm), the mobile phase consisted of a mixture of ammonium formate 20mM in water and acetonitrile (61/39, v/v), at 35 degrees C and the flow rate was set at 1.0 mL/min. Average analyte recoveries, influenced by the botanical origin were from 88 to 96% in replica sets of fortified honey samples. The detection limits of the LC-DAD-ESI-MS method were between 24 and 1 microg/kg for clear honeys (rosemary) and between 45 and 4 microg/kg for dark honeys (heather). The developed method has been applied to the analysis of fumagillin residues in honey samples collected from veterinary treated beehives, infected by Nosema ceranae and fed with the technical product at different doses.

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    ABSTRACT: In this review, relevant data is presented on an emerging disease of the 21th century in European countries, caused by Nosema ceranae. Within a few years after it was detected in Spain in 2005, the rest of European countries that had technical capacity to differentiate Nosema apis from N. ceranae reported its presence. In a similar way as the initial detection of Varroa in Europe, active scientific work is raising many questions due to the absence of clinical symptoms in infected colonies and a long incubation period of the pathogen. N. ceranae presents a different epidemiological pattern and pathology compared to N. apis. The disease caused by N. ceranae is now named nosemosis type C (COLOSS workshop, 2009) and is characterized by the ability to detect the disease-causing agent throughout the year. The continuous death of highly infected bees, mostly foragers, has a clear effect on colony population and productivity. Although there has been a huge effort in the last years to increase knowledge about this disease, significant research is still needed on epidemiology, pathology, prophyllaxis and treatment. Im Jahr 2005 wurde sowohl aus Asien als auch aus Europa über Nachweise von Nosema ceranae in der Honigbiene berichtet. Bis dahin wurde angenommen, dass die Nosemose der Bienen durch eine Infektion der Ventrikelzellen von erwachsenen Bienen mit Nosema apis verursacht wird. Allerdings weicht die durch N. ceranae verursachte, neu auftretende Krankheit in ihrer Epidemiologie, sowie ihrer Symptomatik und Pathologie ab. Daher ist es erforderlich, zwei verschiedene klinische Verläufe zu differenzieren: Nosemose Typ A, verursacht durch N. apis, und Nosemose Typ C, verursacht durch N. ceranae. Die Infektion der Bienen geschieht durch das Aufnehmen von reifen Sporen. Der Lebenszyklus von N. ceranae wird in weniger als 3 Tagen komplett durchlaufen; die intrazelluläre Keimung der Sporen wurde beobachtet. N. ceranae kann während des ganzen Jahres in Bienen nachgewiesen werden, die Übertragungsmechanismen sind jedoch noch nicht vollständig aufgeklärt. Sowohl Königinnen als auch Arbeiterinnen können sich mit N. ceranae infizieren. Pollen aus Pollenhöschen, von Bienenfressern ausgewürgte Pellets, sowie Imkereigeräte wurden als Reservoir von infektiösen Sporen beschrieben. Experimentelle Infektionen von A. mellifera mit N. ceranae zeigten eine höhere Pathogenität in diesem Wirt, die im Vergleich zu N. apis eine höhere Sterblichkeit zur Folge hatte. Jedoch wurden von anderen Autoren Unterschiede in den Sterblichkeitsraten beschrieben, möglicherweise beeinflussen bisher noch unbekannte Faktoren die Ergebnisse. Infizierte Arbeiterinnen wiesen eine deutliche Degeneration der Epithelzellen des Ventrikulums auf, wobei in histologischen Schnitten aus anderen Geweben keine Anzeichen einer Infektion mit Sporen gefunden wurden. N. ceranae kann die humoralen und zellulären Abwehrmechanismen der Bienen teilweise unterdrücken, was bei Infektionen mit N. apis nicht der Fall ist. Es wurde nachgewisen, dass die Postulate von Koch sowohl für Völker als auch für Einzelbienen gelten. Die Parasitierung einzelner Bienen durch N. ceranae hat einen deutlichen Effekt auf der Volksebene, was zu einem kontinuierlichen Totenfall hochinfizierter Bienen führt. Die lange und symptomfreie Inkubationszeit auf der Volksebene kann die Abwesenheit von sichtbaren Symptomen vor dem Zusammenbruch des Volkes erklären. Der Erreger wurde auch als Schlüsselfaktor für die Völkerverluste in Berufsimkereien in Spanien diskutiert. Es gibt jedoch einander widersprechende Berichte über die Folgen einer Infektion von Völkern mit N. ceranae aus verschiedenen Teilen Europas. Der Nachweis von N. ceranae erfordert den Einsatz von molekularbiologischen Methoden. Das Antibiotikum Fumagillin wirkt gegen beide Arten von Nosema, obwohl sein Einsatz in der Europäischen Union verboten ist. Einige neue potenzielle Bekämpfungsmittel sind Thymol und Resveratrol, sowie ApiHerb oder Nonosz®. Eine gute imkerliche Praxis ist entscheidend für die Vermeidung und Kontrolle dieser Krankheit. Es fehlt noch an Wissen über die epidemiologischen Faktoren und klinischen Symptome in verschiedenen Regionen Europas und anderer Teile der Welt, wo unterschiedliche klimatische Bedingungen herrschen und verschiedene Formen der Imkerei ausgeübt werden. Zukünftige Studien über die Nosemose Typ C werden zweifellos ihre Rolle bei Völkerzusammenbrüchen aufklären und werden den Wissensstand über viele noch unbekannte Faktoren im Zusammenhang mit dieser neuen Krankheit verbessern. Nosema ceranae–Nosema apis–Apis mellifera–nosemosis–EuropeNosema ceranae–Nosema apis–Apis mellifera–nosémose–EuropeNosema ceranae–Nosema apis–Apis mellifera–Nosemose–Europa
    Apidologie 41(3):375-392. · 2.16 Impact Factor
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    ABSTRACT: In recent years, a worldwide decline in the Apis mellifera populations has been detected in many regions, including Spain. This decline is thought to be related to the effects of pathogens or pesticides, although to what extent these factors are implicated is still not clear. In this study, we estimated the prevalence of honey bee colony depopulation symptoms in a random selected sample (n = 61) and we explored the implication of different pathogens, pesticides and the flora visited in the area under study. The prevalence of colony depopulation symptoms in the professional apiaries studied was 67.2% [95% confidence interval (CI) = 54.6-79.8; P < 0.0001]. The most prevalent pathogen found in the worker honey bee samples was Nosema ceranae[65.6%; 95% CI = 52.8-78.3; P < 0.0001], followed by Varroa destructor[32.7%; 95% CI = 20.2-45.4; P < 0.0001] and 97.5% of the colonies infected by N. ceranae were unhealthy (depopulated). Co-infection by V. destructor and N. ceranae was evident in 22.9% (95% CI = 11.6-34.3; P < 0.0001) of the samples and only in unhealthy colonies. Of the 40 pesticides studied, only nine were detected in 49% of the stored pollen samples analysed. Fipronil was detected in only three of 61 stored pollen samples and imidacloprid was not detected in any. Acaricides like fluvalinate, and chlorfenvinphos used to control Varroa mite were the most predominant residues in the stored pollen, probably as a result of their application in homemade formulae. None of the pesticides identified were statistically associated to colony depopulated. This preliminary study of epidemiological factors suggests that N. ceranae is a key factor in the colony losses detected over recent years in Spain. However, more detailed studies that permit subgroup analyses will be necessary to contrast these findings.
    Environmental Microbiology Reports 04/2010; 2(2):243-50. · 3.26 Impact Factor
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    ABSTRACT: Fumagillin is the only antibiotic approved for control of nosema disease in honey bees and has been extensively used in United States apiculture for more than 50 years for control of Nosema apis. It is toxic to mammals and must be applied seasonally and with caution to avoid residues in honey. Fumagillin degrades or is diluted in hives over the foraging season, exposing bees and the microsporidia to declining concentrations of the drug. We showed that spore production by Nosema ceranae, an emerging microsporidian pathogen in honey bees, increased in response to declining fumagillin concentrations, up to 100% higher than that of infected bees that have not been exposed to fumagillin. N. apis spore production was also higher, although not significantly so. Fumagillin inhibits the enzyme methionine aminopeptidase2 (MetAP2) in eukaryotic cells and interferes with protein modifications necessary for normal cell function. We sequenced the MetAP2 gene for apid Nosema species and determined that, although susceptibility to fumagillin differs among species, there are no apparent differences in fumagillin binding sites. Protein assays of uninfected bees showed that fumagillin altered structural and metabolic proteins in honey bee midgut tissues at concentrations that do not suppress microsporidia reproduction. The microsporidia, particularly N. ceranae, are apparently released from the suppressive effects of fumagillin at concentrations that continue to impact honey bee physiology. The current application protocol for fumagillin may exacerbate N. ceranae infection rather than suppress it.
    PLoS Pathogens 03/2013; 9(3):e1003185. · 8.14 Impact Factor