A potential link between alternative splicing of the NBS1 gene and DNA damage/environmental stress.

Abstract

NBS1 forms a multimetric complex with MRE11/RAD50, which acts as the sensor of DNA double-strand breaks (DSBs). The mechanisms controlling the expression of NBS1 remain largely unknown. Here we show that NBS1 is transcribed as both a wild-type and an alternatively spliced form exhibiting a premature stop codon in an alternative 50-bp exon in intron 2. Although the wild-type transcript predominates in most tissues, the spliced transcript is abundant in resting peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). Levels of the spliced form of NBS1 decreased rapidly after irradiation as levels of the wild-type NBS1 transcript increased, resulting in increased levels of NBS1 protein. Both mitogenic stimulation and methyl methanesulfonate treatment also altered the splicing pattern of NBS1. Resting PBMCs, which predominantly express spliced NBS1, were more susceptible to radiation than mitogen-stimulated cells, which showed predominant expression of the wild-type transcript. Since the alternatively spliced NBS1 gene likely did not produce protein, this alternative splicing seems to be associated with the control of NBS1 protein. Thus alternative splicing of the NBS1 gene may be associated with the regulation of NBS1 in response to DSBs, DNA alkylation damage, and mitogenic response.

Full text

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Title
A Potential Link between Alternative Splicing of the NBS1
Gene and the DNA Damage/Environmental Stress( Abstract )
Author(s) Takai, Ken
Citation Kyoto University (京都大学), 2008-05-23
Issue Date 2008-05-23
URLhttp://hdl.handle.net/2433/124221
Right
TypeThesis or Dissertation
Textversionnone
KURENAI : Kyoto University Research Information Repository
Kyoto University

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京都大学 博士（医学）
A Potential Link between Alternative Splicing of the NBS1 Gene and the
DNA Damage/Environmental Stress (NBS1遺伝子の選択的スプライシング
とDNA損傷／環境ストレスとの関連性)
（論文内容の要旨）
Nijmegen breakage syndrome（NBS）は、放射線高感受性、免疫低下、高発がん性等を特徴とする常染
氏 名 高井 健
論文題目
色体劣性遺伝病で、NBS1 遺伝子の突然変異によって引き起こされる。NBS1 は、MRE11、RAD50 と複
合体を形成し、DNA二重鎖切断の相同組換え修復に関わる。しかし、NBS1の発現を制御するメカニズ
ムはわかっていない。
NBS1のクローニングの過程で、以前に報告されたwild-type formに加えて選択的スプライシングを受
けたvariant formが転写されていることを見出した。このsplice variantはwild typeのエクソン2、3の間
のイントロン2に存在する50 bpの配列 （putative exon） を含んでおり終止コドンが存在していた。 RT-PCR
で解析したところ、殆どの組織では wild-type form の発現が優位なのに対して末梢血単核球では splice
variant が優位であった。しかし、末梢血単核球におけるsplice variant 転写産物の割合には個人差があり
wild type優位の者も存在した。
Splice variantが蛋白を産生するか確認するため、NBS患者由来線維芽細胞にsplice variant NBS1発現ベ
クターを導入して免疫ブロットを行ったが、 タンパク質は確認できなかった。 splice variantは相同組換え
能を認めなかったことからタンパク質を産生しないと考えられた。
休止期リンパ球に X 線を照射し、NBS1 遺伝子の発現の変化を解析した。ノーザンブロット法では、
照射から3〜6 時間後にNBS1の転写レベルが最大となり、その後低下を認めた。RT-PCR産物を用いて
wild type、 splice variantの比率を解析したところ、 NBS1のsplice variantが急速に減少する一方で、 wild type
の転写は増加し、6時間後にはwild typeのみ発現されていた。X線照射後NBS1蛋白レベルも増加し、3
〜6時間後に最大となった。マイトージェンやアルキル化剤で処理を行った時も同様にwild type優位へ
と変化した。 Splice variant優位の休止期リンパ球に比べて、 wild type優位の増殖刺激6時間後のリンパ球
では、放射線に対する感受性が低下していたが、刺激72時間後にはsplice variantが再び優位となり放射
線感受性が上昇した。この結果から放射線や増殖刺激によって誘導されるスプランシングの変化が
NBS1蛋白量の変化と放射線感受性に関連していることが示唆された。
ヒト、チンパンジー、アカゲザル、マウス、ラットでputative exon及びその周辺の塩基配列を比較す
ると前三者で類似しておりアカゲザルではsplice variant の存在が報告されていた。マウス、ラットでは
putative exonの下流イントロンの5’スプライス部位にコンセンサス配列を認めず脾細胞を使ったRT-PCR
でマウスにはsplice variant転写産物が存在しないことを確認した。 従ってNBS1のスプライシング機構は
哺乳類の進化の過程で獲得された可能性がある。
以上の結果は、DNA 損傷や増殖刺激により NBS1 がスプライシングパターンの変化を起こし、NBS1
蛋白の発現を調節しており、放射線感受性にも関連していることを示している。休止期リンパ球は例外
的に放射線感受性が高いことが知られており、 NBS1のスプライシングが関連している可能性があると考
えられた。

（論文審査の結果の要旨）
NBS1はMRE11、RAD50と複合体を形成しDNA二重鎖切断の相同組換え修復に関わる。本論文では
NBS1の発現制御メカニズムを解析した。
NBS1のクローニングの過程でsplice variant fbrm を見出した。このsplice variantはwild
typeのエクソン2、3の間に50bpの putative exonを含んでおり終止コドンが存在していた。発現を解
析したところ殆どの組織ではwild-type formの発現が優位なのに対して休止期リンパ球ではsplice
variantが優位であった。Splice variantはタンパク質を産生しなかった。
休止期リンパ球にX線照射したところ3～6時間後にNBS1の転写レベルが最大となりsplice variant
が減少しwild type優位へと変化した。NBS1蛋白量も3～6時間後に最大となった。マイトージェンや
アルキル化剤で処理した時も同様に wild type優位へと変化した。 リンパ球の放射線感受性は、 splice
variant優位の休止期に比べて増殖刺激後6時間のwild type優位な状態で低下していたが、 splice variant
優位の刺激72時間後には再び上昇した。スプランシングによるNBS1発現量変化と放射線感受性との相
関が認められた。
以上の研究は、休止期リンパ球の放射線高感受性メカニズムの解明に寄与する可能性がある。
したがって、本論文は博士(医学)の学位論文として価値あるものと認める。
なお、本学位授与申請者は、平成20年4月18日実施の論文内容とそれに関連した試問を受け、合格と
認められたものである。
要旨公開可能日： 年 月 日 以降