Effects of immune serum on macrophage cell cultures infected with Mycoplasma mycoides subsp. mycoides small colony: morphological analysis by scanning electron microscopy.

Abstract

Macrophages are pivotal cells of the immune system and play a key role in the host defence mechanism against pathogens. To date, the importance of macrophages and the role of humoral response in eliciting macrophage activity against Mycoplasma mycoides subsp. mycoides small colony (Mmm-SC), the causative agent of contagious bovine pleuropneumonia (CBPP), have only been marginally elucidated or are almost unknown. The present study was undertaken to investigate the changes in surface morphology of macrophages after in vitro infection with Mmm-SC in the presence of bovine immune serum. Morphological analysis was performed on macrophage cultures at 6 h post infection using the three-dimensional vision of scanning electron microscopy. Non-infected macrophages in the presence of negative or immune serum and macro phages infected with Mmm-SC in the absence of serum showed only minor cell surface changes. In contrast, clear surface modifications, broad veils, fine philopodia highlighting cell activation and small aggregates of mycoplasma closely attached to the macrophage membrane, were observed in infected macrophage cultures in the presence of immune serum. Our results suggest that specific humoral response to Mmm-SC may contribute and support phagocytic activity of macrophages.

Full text

Page 1

Veterinaria Italiana, 46 (4), 397‐404 
© Istituto G. Caporale 2010 www.izs.it/vet_italiana Vol. 46 (4), Vet Ital 
397 
Effects of immune serum on macrophage cell cultures 
infected with Mycoplasma mycoides subsp. mycoides 
small colony: morphological analysis by scanning 
electron microscopy 
Anna Rita D’Angelo, Flavio Sacchini, Tiziana Di Febo, Vincenzo Langella,  
Andrea Di Provvido, Gabriella Di Francesco, Rossella Lelli & Attilio Pini 
Summary 
Macrophages are pivotal cells of the immune 
system and play a key role in the host defence 
mechanism  against  pathogens.  To  date,  the 
importance  of  macrophages  and  the  role  of 
humoral  response  in  eliciting  macrophage 
activity  against  Mycoplasma  mycoides  subsp. 
mycoides small colony (Mmm‐SC), the causative 
agent of contagious bovine pleuropneumonia 
(CBPP), have only been marginally elucidated 
or are almost unknown. The present study was 
undertaken  to  investigate  the  changes  in 
surface  morphology  of  macrophages  after  in 
vitro infection with Mmm‐SC in the presence of 
bovine immune serum. Morphological analysis 
was performed on macrophage cultures at 6 h 
post  infection  using  the  three‐dimensional 
vision of scanning electron microscopy. Non‐
infected  macrophages  in  the  presence  of 
negative or immune serum and macrophages 
infected with Mmm‐SC in the absence of serum 
showed  only  minor  cell  surface  changes.  In 
contrast,  clear  surface  modifications,  broad 
veils, fine philopodia highlighting cell activation 
and  small  aggregates  of  mycoplasma  closely 
attached to the macrophage membrane, were 
observed  in  infected  macrophage  cultures  in 
the  presence  of  immune  serum.  Our  results 
suggest  that  specific  humoral  response  to 
Mmm‐SC may contribute 
phagocytic activity of macrophages. 
and support 
Keywords 
Contagious  bovine  pleuropneumonia,  IgG, 
IgM, Immunoblotting, Macrophage, Mycoplasma, 
Mycoplasma  mycoides  subsp.  mycoides  small 
colony, Scanning electron microscopy. 
Introduction 
Mycoplasma  mycoides  subsp.  mycoides  small 
colony  (Mmm‐SC),  the  causative  agent  of 
contagious  bovine  pleuropneumonia  (CBPP), 
is localised in the focal necrotic micro abscess 
of the lung, in the dense fibrotic pyogranulo‐
matous  area  and  in  the  infiltrations  of 
macrophages  around  the  bronchioles  and 
perivascular cellular cuffs (5, 6, 8). 
At  the  onset  of  mycoplasma  infection, 
macrophages, derived from blood monocytes, 
are the major cellular component involved in 
the  defence  of  the  respiratory  tract  and  they 
show a tendency to accumulate at the sites of 
mycoplasma  localisation  (5).  The  outcome  of 
mycoplasma‐macrophage 
determine  the  subsequent  progression  of 
disease  (10).  Macrophages  not  only  perform 
effector  functions,  such  as  receptor‐mediated 
phagocytosis,  but  they  are  also  important 
accessory cells of the immune system and are 
involved in antigen presentation and cytokine 
production (1). 
interaction may 

Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell'Abruzzo e del Molise ‘G. C aporale’, Via C ampo Boario, 64100 Teramo, Italy
a.dangelo@izs.it

Page 2

Effects of immune serum on macrophage cell cultures 
infected with Mycoplasma mycoides subsp. mycoides small colony: 
morphological analysis by scanning electron microscopy 
Anna Rita D’Angelo, Flavio Sacchini, Tiziana Di Febo, 
Vincenzo Langella, Andrea Di Provvido, 
Gabriella Di Francesco, Rossella Lelli & Attilio Pini 
398
Vol. 46 (4), Vet Ital www.izs.it/vet_italiana © Istituto G. Caporale 2010 
To date, pathogenic studies on Mmm‐SC have 
marginally explained the role of macrophages 
and  their phagocytic 
mycoplasma. Moreover, the function of bovine 
humoral response 
infections and the possible role of antibodies, 
as opsonins, able to elicit macrophage activity, 
have been partially investigated. Some studies 
on  Mycoplasma  bovis  have  demonstrated  the 
importance of IgG in promoting mycoplasma 
phagocytosis  and  killing  by  bovine  alveolar 
macrophages  and  neutrophils  (9).  In  studies 
conducted  on  Mmm‐SC,  no  correlation  has 
been observed between IgM and IgG antibody 
levels and the clinical/pathological progression 
of the disease (2, 11). The current in vitro study 
was  designed  to  observe  the  interaction 
between Mmm‐SC and macrophage cultures in 
the  presence  or  absence  of  specific  immune 
serum.  Our  hypothesis  is  that  antibodies  to 
Mmm‐SC may function as opsonins promoting 
macrophage  activation, 
morphological changes. 
activity against 
during mycoplasma 
expressed  as 
The  research  was  based  on  the  ability  of 
Mmm‐SC and macrophages to adhere to glass 
surfaces;  the  use  of  the  scanning  electron 
microscopy  (SEM)  technique  led  to  a  better 
understanding  of  the  morphological  changes 
that  occur  with  macrophage  cells.  With  a 
relatively wide range of magnification, the use 
of  SEM  means  that  the  area  of  interest  of  a 
specimen that had initially been scanned at a 
lower magnification can be focussed on with 
ease (13). 
Materials and methods 
Mycoplasma strains and growth 
condition 
A Mmm‐SC field strain isolated in the Caprivi 
region  of  Namibia  in  2003  was  cultured  in 
contagious  caprine  pleuropneumonia  (CCPP) 
medium (15) and incubated for 48 h at 37°C in 
an  atmosphere  of  5%  CO2,  had  a  titre  of 
108 colony‐forming units (cfu)/ml. The culture 
was centrifuged at 4 000 g for 15 min and the 
pellet washed and re‐suspended in RPMI‐1640 
(Sigma, Munich) with 10% foetal bovine serum 
(Sigma)  (R‐10).  Mmm‐SC  survival  in  R‐10 
medium was successfully assessed at intervals 
by  titration  on  CCPP  agar  (15)  as  described 
previously (3). 
Sera 
The  complement  fixation  test  was  performed 
in accordance with the Manual of diagnostic tests 
and vaccines for terrestrial animals of the World 
Organisation for Animal 
International  des  Épizooties:  OIE)  (14).  The 
Mmm‐SC bovine immune serum had a titre of 
1:1 280 (12). The negative serum that had a titre 
<1:10 was obtained from a healthy calf from a 
CBPP‐free population. To evaluate the possible 
opsonising effects of immunoglobulins, all sera 
were heat inactivated at 56°C for 30 min before 
use. 
Health (Office 
In  order  to  identify  the  dominant  immuno‐
genic antigens of Mmm‐SC recognised by IgM 
and  IgG  antibody  isotypes,  the  immuno‐
blotting test was performed according to OIE 
procedures  (14).  To  reduce  background 
staining,  negative  control  serum  was  diluted 
1:3;  whereas  for  IgG  and  IgM  analysis,  the 
immune  serum  was diluted at 1:80 and 1:10, 
respectively.  An  anti‐bovine  IgG  horseradish 
peroxidase (HRP) conjugated (Sigma, A8917), 
diluted at 1:4 000 and an anti‐bovine IgM HRP 
conjugated (Bethyl Laboratories, Montgomery, 
Texas),  diluted  at  1:2 000,  were  used  as 
secondary antibodies. 
Monocyte cell separation 
Bovine monocytes were isolated from venous 
blood taken in ethylenediaminetetraacetic acid 
(EDTA)  from  a  naive  healthy  calf  from  a 
CBPP‐free population. Erythrocytes were lysed 
by  adding  16 ml  of  whole  blood  lysis  buffer 
into 4 ml of blood and the cell suspension was 
left standing at room temperature for 30 min 
(7). Cells were centrifuged at 400 g for 15 min, 
at 18°C and then washed twice with phosphate 
buffered saline (PBS). 
re‐suspended in R‐10 medium. Cell count and 
cell  viability  were  performed  by  trypan  blue 
staining.  Flow  cytometric  acquisition  and 
analysis was performed using a Coulter Epics 
XL‐MCL  flow  cytometer  (Beckman  Coulter, 
Brea,  California)  with  EXPO™ 32  software. 
The  cell  suspension  was  displayed  by  using 
forward  and  side‐angle  scatter  properties, 
following which the percentage of monocytes 
The pellet was 

Page 3

Anna Rita D’Angelo, Flavio Sacchini, Tiziana Di Febo, 
Vincenzo Langella, Andrea Di Provvido, 
Gabriella Di Francesco, Rossella Lelli & Attilio Pini 
Effects of immune serum on macrophage cell cultures 
infected with Mycoplasma mycoides subsp. mycoides small colony: 
morphological analysis by scanning electron microscopy 
© Istituto G. Caporale 2010 www.izs.it/vet_italiana Vol. 46 (4), Vet Ital 
399 
was calculated. The density of monocytes was 
adjusted  to  3 × 106  monocytes/ml.  One  ml  of 
cells suspension was cultured in tissue culture 
chamber  slides  (Nunc)  with  0.5 ml  of  R‐10 
medium  and  incubated  at  37°C  in  an 
atmosphere  of  5%  CO2  for  2 h  to  allow  the 
monocytes to attach to the glass surface. The 
supernatants  were  then  discarded,  cultures 
rinsed twice with fresh medium and incubated 
overnight at 37°C in an atmosphere of 5% CO2. 
After discarding supernatants, 
cultures showing morphological characteristics 
of  macrophages  as  observed  with  an  optical 
microscope, were 
Subsequently  0.5 ml  of  the  mycoplasma 
culture  (Table I:  test 1)  and  0.5 ml  of  the 
mycoplasma  culture,  to  which  an  equal 
volume of immune or negative sera was added 
(Table I:  tests 2  and  3),  were  dispensed  into 
each of three chamber slides with macrophage 
monolayers and incubated for 6 h at 37°C in an 
atmosphere of 5% CO2. 
monocyte 
rinsed with PBS. 
Table I
Tests for scanning electron microscopy analysis
Tests C ells Mycoplasma Serum
C ontrol 1 Macrophages
C ontrol 2 Mmm-SC
C ontrol 3 Macrophages Negative
C ontrol 4 Macrophages Positive
Test 1 Macrophages Mmm-SC
Test 2 Macrophages Mmm-SC Negative
Test 3 Macrophages Mmm-SC Positive
Mmm-SC Mycoplasma mycoides subsp. mycoides small
colony
 
Finally the chamber slides were washed twice 
in PBS to remove the non‐adherent cells and 
mycoplasmas.  A  macrophage  monolayer,  a 
smear of Mmm‐SC culture and a macrophage 
monolayer  in  the  presence  of  immune  and 
negative sera  were  used as  controls  (Table  I: 
controls 1‐4). 
Scanning electron microscopy 
The  chamber  slides  and  the  Mmm‐SC  smear 
slide  were  placed  in  modified  Karnovsky’s 
fixative (Electron 
Hatfield,  Pennsylvania)  in  0.1 M  cacodylate 
buffer, pH 7.2 at 4°C for 1 h and then washed 
Microscopy Science, 
twice with cold 0.1 M cacodylate buffer, pH 7.2 
at 4°C for 1 h. Dehydration of fixed cells was 
performed in 25%, 50%, 75%, 95% and twice in 
100%  graded  acetone  solutions,  at  room 
temperature for 10 min each and were then air‐
dried immediately (3). Small sections (1 × 1 cm) 
of  slides  were  then  cut  and  glued  onto 
polished aluminium 
uniformly  in  vacuum  with  a  layer  of 
approximately 20 nm thickness of gold. Coated 
samples  were  examined  using  a  Zeiss  DSM 
940A  SEM.  Micrographs  were  recorded  as 
electronic  images  and  archived  on  an 
AxioVision system. 
stubs  and coated 
Results 
Sera characterisation 
Immunoblotting  analysis,  performed  using 
whole Mmm‐SC cells as antigen, revealed that 
the  IgG  contained  in  the  immune  serum 
identified a protein panel of 110, 98, 95, 85, 80, 
72, 60‐62, 48 and 39 kDa. No protein band was 
detected using negative serum (Fig. 1). 
Repeated  analysis  investigating  the  Mmm‐SC 
antigen profile identified by IgM showed that 
positive  serum  recognised  the  same  protein 
antigens  of  IgG  except  for  the  fraction  of 
95 kDa.  Results  also  demonstrated  that  IgM 
contained in the negative serum were able to 
identify  proteins  of  80,  60‐62  and  48 kDa 
(Fig. 1). 
Scanning electron microscopy 
For  SEM  analysis,  control  tests  1  to  4  were 
observed  before  tests  1  to  3.  In  control  tests, 
most  of  the  monocytes  observed  under  the 
SEM had developed into typical macrophages 
that  adhered  to  the  culture  slides,  showing 
distinct changes comparable 
activated  macrophages.  The  cells  showed 
generally  rounded  shapes  (Fig. 2)  and  had 
undergone  certain  morphological  changes, 
such as the light spreading of cytoplasm and 
development  of  membrane  ruffling  and 
microprojections required for glass attachment 
(Fig. 3).  The  Mmm‐SC  culture  smear  showed 
rounded or pleomorphic micro‐organisms on a 
non‐specific  background  (Fig. 4).  Most  of  the 
macrophages,  after  6 h  of  incubation  in  the  
 
to natural 

Page 4

Effects of immune serum on macrophage cell cultures 
infected with Mycoplasma mycoides subsp. mycoides small colony: 
morphological analysis by scanning electron microscopy 
Anna Rita D’Angelo, Flavio Sacchini, Tiziana Di Febo, 
Vincenzo Langella, Andrea Di Provvido, 
Gabriella Di Francesco, Rossella Lelli & Attilio Pini 
400
Vol. 46 (4), Vet Ital www.izs.it/vet_italiana © Istituto G. Caporale 2010 

Figure 1
Immunoblots illustrate Mycoplasma mycoides
subsp. mycoides small colony antigens
identified by IgG (rows 1 and 2) and IgM (rows
3 and 4) of immune (S+) and negative (S–) sera
The molecular masses of the immunogenic protein
fraction identified by IgG and IgM are indicated for
each row

Figure 2
C ontrol 1: a rounded shaped macrophage
adheres to the culture slides
(Scanning electron microscope 5 000×)

Figure 3
C ontrol 1: a rounded shaped macrophage
adheres to the culture slide
Note the light spreading of cytoplasm and
development of microprojections (arrows)
(Scanning electron microscope 10 000×)

Figure 4
C ontrol 2: Mycoplasma mycoides subsp.
mycoides small colony culture smear
Note the variability in the shape of the organisms
(arrows) on the non-specific background
(Scanning electron microscope 10 000×)
presence of bovine immune or negative sera, 
showed a more marked 
cytoplasm,  large  flange‐like  processes  and 
development of philopodia, while maintaining 
a rounded shape (Figs 5 and 6). 
spreading of 
An  analysis  was  performed  after  6 h  of 
incubation  with  Mmm‐SC. 
macrophages showed rounded shapes, limited 
cell surface modifications and the presence of 
several plasmatic membrane microprojections;  
 
In test 1, 
S+






110
98
95
85
80

72
62-60

48

39

S+











110
98

85
80
72
62-60

48

39











S–









80


62-60

48



S–
IgG

IgM


1 2 3 4

Page 5

Anna Rita D’Angelo, Flavio Sacchini, Tiziana Di Febo, 
Vincenzo Langella, Andrea Di Provvido, 
Gabriella Di Francesco, Rossella Lelli & Attilio Pini 
Effects of immune serum on macrophage cell cultures 
infected with Mycoplasma mycoides subsp. mycoides small colony: 
morphological analysis by scanning electron microscopy 
© Istituto G. Caporale 2010  www.izs.it/vet_italiana Vol. 46 (4), Vet Ital 
401 

Figure 5
C ontrol 3: macrophage culture following
addition of negative serum
Note the marked spreading of the cytoplasm and
large flange-like processes (arrows) while a rounded
shape is maintained
(Scanning electron microscope 3 000×)

Figure 6
C ontrol 4: macrophage culture following
addition of immune serum
Note the marked spreading of the cytoplasm and
large flange-like processes and philopodia while a
rounded shape is maintained
(Scanning electron microscope 3 000×)
mycoplasmas  formed  aggregates  that  were 
separated  from  cells  (Fig. 7).  In  test 2, 
macrophage  cultures  infected  with  Mmm‐SC, 
in  the  presence  of  negative  serum,  showed 
similar  modifications  and  free  mycoplasma 
cells were observed around the cells (Fig. 8). 
In  test 3,  following  the  addition  of  bovine 
immune  serum,  Mmm‐SC‐infected  cultures 
showed  significant  morphological  changes. 
Although 
individuality,  a  vast  network  of  inter‐
connecting philopodia between cells, with the 
loss of their rounded shape, were seen (Fig. 9). 
They  revealed  the  presence  of  wide  veils, 
enveloping mycoplasma 
philopodia  (Fig. 10)  and  mycoplasmas  that  
 
they retained their structural 
aggregates, fine 

Figure 7
Test 1: macrophage culture infected with
Mycoplasma mycoides subsp. mycoides small
colony
Note the rounded shaped cell, limited surface
modification and mycoplasma aggregates (arrows)
separated from cell
(Scanning electron microscope 5 000×)

Figure 8
Test 2: macrophage culture infected with
Mycoplasma mycoides subsp. mycoides small
colony following addition of negative serum
Note the round shape of the macrophage and
isolated mycoplasma organisms (arrows) separated
from the cell
(Scanning electron microscope 8 000×)






Philopodia
Flange-like process

Page 6

Effects of immune serum on macrophage cell cultures 
infected with Mycoplasma mycoides subsp. mycoides small colony: 
morphological analysis by scanning electron microscopy 
Anna Rita D’Angelo, Flavio Sacchini, Tiziana Di Febo, 
Vincenzo Langella, Andrea Di Provvido, 
Gabriella Di Francesco, Rossella Lelli & Attilio Pini 
402
Vol. 46 (4), Vet Ital  www.izs.it/vet_italiana © Istituto G. Caporale 2010 

Figure 9
Test 3: macrophage culture infected with
Mycoplasma mycoides subsp. mycoides small
colony following addition of immune serum
Note the loss of the rounded shape of the cell and
the vast interlocking network of philopodia between
cells
(Scanning electron microscope 3 000×)

Figure 10
Test 3: macrophage culture infected with
Mycoplasma mycoides subsp. mycoides small
colony following addition of immune serum
Note the presence of a wide and transparent veil,
enveloping mycoplasma aggregates and fine
philopodia
(Scanning electron microscope 3 000×)
were  closely  attached  to  the  membrane 
(Fig. 11). 
Conclusions 
CBPP is a disease that is transmitted by contact 
and the pathogen generally remains restricted 
to  the  lungs  causing  bronchiolitis  and 
 

Figure 11
Test 3: macrophage culture infected with
Mycoplasma mycoides subsp. mycoides small
colony following addition of immune serum
Note the individual mycoplasmas (arrow) closely
attached to the macrophage membrane
(Scanning electron microscope 8 000×)
pneumonia.  The  host  immune  mechanisms, 
following Mmm‐SC invasion of the respiratory 
tract, are only partially known. A microscopic 
analysis of lung lesions revealed infiltration of 
neutrophils  and  macrophages  in  the  alveoli 
during  the  early  stages  of  inflammation, 
followed  by  recruitment  of  monocytes  and 
plasmacells  (5,  6,  8).  Thus,  alveolar  macro‐
phages and neutrophils represent the primary 
cells in the host defence mechanism. The initial 
mycoplasma‐phagocyte  interaction  plays  an 
important role in determining the progression 
of infection and the severity of disease (9). 
Macrophages are important accessory cells of 
the  immune  system  and  are  involved  in 
antigen presentation and cytokine production. 
They  act  as  secretory  and  regulatory  cells, 
initiating  and  modulating  the  inflammatory 
processes.  Furthermore,  phagocytic  activity 
may  be  enhanced  by  opsonising  antibodies, 
produced  as  a  result  of  exposure  to  myco‐
plasma antigens (1, 10). 
Studies  on  the  interactions  of  Mycoplasma 
dispar  with  bovine  alveolar  macrophages 
indicate  that  their  ability  to  phagocyte 
mycoplasmas  is  strongly  correlated  with  the 
production  of  opsonising  antibodies  that  are 
mainly directed against capsular antigens (4). 
Mycoplasma



Veil



Philopodia
Mycoplasma

Philopodia

Page 7

Anna Rita D’Angelo, Flavio Sacchini, Tiziana Di Febo, 
Vincenzo Langella, Andrea Di Provvido, 
Gabriella Di Francesco, Rossella Lelli & Attilio Pini 
Effects of immune serum on macrophage cell cultures 
infected with Mycoplasma mycoides subsp. mycoides small colony: 
morphological analysis by scanning electron microscopy 
© Istituto G. Caporale 2010 www.izs.it/vet_italiana Vol. 46 (4), Vet Ital 
403 
The results of the in vitro study conducted here 
indicate  that  macrophage  activation  and 
morphological changes observed by SEM are 
induced by the presence of Mmm‐SC immune 
serum.  Macrophage  activation  results  in  the 
development of philopodia 
projections on the cell surface membrane and 
mycoplasma aggregation on the surface. 
and micro‐
The experimental model suggests that humoral 
response,  induced  in  cattle  infected  with 
Mmm‐SC, may support macrophage activation. 
Immunoblotting  results  demonstrated  that 
IgM  and  IgG  in  immune  serum  mostly 
recognised  the  same  protein  fractions.  The 
switching  from  a  primary  IgM  to  a  more 
specific IgG response, however, may represent 
an  important  step  of  the  immune  system 
aimed to control Mmm‐SC tissue spread; IgG 
may  act  as  opsonins  targeting  mycoplasmas 
and  favouring  phagocytosis  through  the 
fragment  crystallisable  (Fc) γ  receptor  of 
macrophages. 
The role of IgM in CBPP humoral response is 
not  clear  but immunoblotting 
revealed  that  serum  from  naive  cattle 
contained IgM that was able to detect certain 
Mmm‐SC antigens. Probably the 80, 60‐62 and 
48  kDa  fractions  identified  only  by  IgM 
contain  epitopes  similar  to  other  micro‐
organisms against which the animal had been 
sensitised.  IgM  are  characterised  by  a  high 
avidity  but  low  affinity  that  results  in  lesser 
specificity for the epitope and possible antigen 
cross‐reactivity (1). 
analysis 
Additional studies are required to clarify the 
role of B‐cell responses during CBPP infection 
and  the  mechanisms  involved  in  Mmm‐SC 
macrophage interaction. 
 
References 
1. Abbas A.K., Lichtman A.H. & Pillai S. 2007. C ells and tissues of the adaptive immune system.
In C ellular and molecular immunology, 6th Ed. Saunders Elsevier, Philadelphia, 56 pp.
2. Abdo E.M., Nicolet J ., Miserez R., Gonçalves R., Regalla J ., Griot C ., Bensaide A., Krampe M. & Frey J .
1998. Humoral and bronchial immune responses in cattle experimentally infected with Mycoplasma
mycoides subsp. mycoides small colony type. Vet Microbiol, 59 (2-3), 109-122.
3. Al-Kaissi A. & Alley M.R. 1983. Electron microscopic studies of the interaction between ovine alveolar
macrophages and Mycoplasma ovipneumoniae in vitro. Vet Microbiol, 8, 571-584.
4. Almeida R.A., Wannemuehler M.J . & Rosenbusch R.F. 1992. Interaction of Mycoplasma dispar with
bovine alveolar macrophages. Infect Immun, 60 (7), 2914-2919.
5. Bashiruddin J .B., Santini F.G., De Santis P., Visaggio M.C ., Di Francesco G., D’Angelo A. &
Nicholas R.A.J . 1999. Detection of Mycoplasma mycoides subspecies mycoides in tissue from
outbreak of contagious bovine pleuropneumonia by culture, immunohistochemistry and
polymerase chain reaction. Vet Rec, 145, 271-274.
6. C oetzer J .A.W. & Tustin R.C . 2004. C ontagious bovine pleuropneumonia. In Infectious diseases of
livestock, 2nd Ed. Oxford University Press, C ape Town, Oxford and New York, Vol. 3, 2045-2059.
7. Faldyna M., Levá L., Knötigová P. & Toman M. 2001. Lymphocyte subsets in peripheral blood of dogs
– a flow cytometric study. Vet Immunol Immunopathol, 82, 23-37.
8. Food and Agriculture Organization (FAO) 2002. Preparation of contagious bovine pleuropneumonia
contingency plans. In FAO Animal Health Manual. FAO, Rome, 14.
9. Howard C .J . & Taylor G. 1983. Interaction of mycoplasmas and phagocytes. Yale J Biol Med, 56,
643-648.
10. Marshall A.J ., Miles R.J . & Richards L. 1995. The phagocytosis of mycoplasma. J Med Microbiol, 43,
239-250.
11. Niang M., Diallo M., C issé O., Kone M., Doucoure M., Roth J .A., Balcer-Rodrigues V. & Dedieu L. 2006.
Pulmonary and serum antibody responses elicited in zebu cattle experimentally infected with
Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC by contact exposure. Vet Res, 37, 733-744.
12. Pini A., De Santis P., Langella V., Ferri N., Scacchia M., Di Francesco G., Tittarelli M., Visaggio M. &
Lelli R. 1999. Experimental infection of cattle with a strain of Mycoplasma mycoides mycoides small
colony (Mmm SC ). In C OST Action 826 International Symposium: Mycoplasmas of ruminants,
2-4 J une, Toulouse. European C ommission, Brussels, 93.

Page 8

Effects of immune serum on macrophage cell cultures 
infected with Mycoplasma mycoides subsp. mycoides small colony: 
morphological analysis by scanning electron microscopy 
Anna Rita D’Angelo, Flavio Sacchini, Tiziana Di Febo, 
Vincenzo Langella, Andrea Di Provvido, 
Gabriella Di Francesco, Rossella Lelli & Attilio Pini 
404
Vol. 46 (4), Vet Ital www.izs.it/vet_italiana © Istituto G. Caporale 2010 
13. Stadtländer H. 2007. Scanning electron microscopy and transmission electron microscopy of
mollicutes: challenges and opportunities. In Modern research and educational topics in microscopy.
Series 2 (A. Méndez-Vilas & J . Díaz, eds). Formetex, Badajoz, 122-131.
14. World Organisation for Animal Health (Office International des Épizooties: OIE) 2008. C ontagious
bovine pleuropneumonia. In Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals, 6th Ed.
OIE, Paris, 712-724.
15. World Organisation for Animal Health (Office International des Épizooties: OIE) 2008. C ontagious
bovine pleuropneumonia. In Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals, 6th Ed.
OIE, Paris, 1000-1003.