Membrane microdomains and glycosylation of activating receptors influence natural killer cell regulation

Abstract

Natural killer (NK) cells represent the first lymphoid subpopulation in the defense against tumors and viral infection. The activity of NK cells is regulated by the interplay of activating and inhibitory surface receptors. The mechanisms by which these receptors transduce their signals and the integration of positive and negative signals are not completely understood. 2B4 (CD244) is an important activating NK cell receptor. Ligand engagement results in the recruitment of 2B4 to membrane microdomains, which is essential for the function of this receptor. Here we successfully established a new approach to investigate membrane microdomains without destroying the membrane’s natural composition, as it has often been criticized for the classical cold non-ionic detergent lysis followed by sucrose density gradient centrifugation. NK cell receptors were stimulated by antibodies coupled to magnetic beads. NK cells were then physically disrupted in a nitrogen-cavitation bomb and membrane fragments surrounding the engaged receptor including the associated signaling machinery were immunoisolated by separation of the magnetic beads. By comparing bead contents of activating (2B4) with inhibitory (NKG2A) NK cell receptors using 2D-DIGE, several proteins with significant difference emerged, which were subsequently identified by mass spectrometry. Important candidates for cytoskeletal remodeling and signal transduction were identified to be specifically associated with 2B4, which gave us a first hint for the formation of multimolecular complexes and their role in the early steps of NK cell activation. In a second project we analyzed the glycosylation of 2B4. We demonstrated that 2B4 is heavily and differentially glycosylated in primary human NK cells and NK cell lines. The differential glycosylation of 2B4 could be attributed to sialic acid residues on N- and O-linked carbohydrates. Glycosylation plays an important role in receptor-ligand recognition and interaction but may also lead to repulsion between molecules. Using a recombinant fusion protein of the extracellular domain of 2B4 we demonstrated that N-linked glycosylation of 2B4 is essential for binding to its ligand CD48. In contrast, sialylation of 2B4 had a negative impact on ligand binding as the interaction between 2B4 and CD48 was increased after the removal of sialic acids. This was confirmed in a functional assay system, where the desialylation of NK cells or the inhibition of O-linked glycosylation resulted in increased 2B4-mediated lysis of CD48 expressing tumor target cells. These data demonstrate that glycosylation has an important impact on 2B4-mediated NK cell function and suggest that regulated changes in glycosylation during NK cell development and activation might be involved in the regulation of NK cell responses. Natürliche Killer (NK) Zellen repräsentieren die erste lymphoide Subpopulation in der Immunabwehr gegen Tumore und virale Infektionen. Die Aktivität der NK Zellen wird durch eine Vielzahl von aktivierenden und inhibierenden Oberflächenrezeptoren reguliert. Die Signaltransduktion dieser Rezeptoren als auch das Zusammenpiel zwischen beiden Rezeptortypen ist bis heute noch nicht vollständig verstanden. 2B4 (CD244) ist ein aktivierender Rezeptor, der für die Regulation von NK Zellen von großer Bedeutung ist. Seine Aktivierung führt zur Rekrutierung in spezialisierte Membranbereiche, so genannte „lipid rafts“ oder Membran Mikrodomänen. Die klassische Methode zur Untersuchung dieser „lipid rafts“ beruht auf der Verwendung von kaltem, nicht-ionischen Detergenz mit anschließender Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation. In dieser Arbeit wurde eine neue Technik zur Untersuchung von Membran Mikrodomänen etabliert, bei der es nicht zu einer Zerstörung der natürlichen Membran-zusammensetzung kommt, was ein oft genannter Kritikpunkt für die Verwendung von Detergenzien ist. NK Zell Rezeptoren wurden durch Antikörper gebundene, magnetische Kügelchen stimuliert. Anschließend erfolgte die Zerstörung der Zelle mit Hilfe einer Stickstoff-Bombe sowie die Immunisolierung der Rezeptor umgebenden Membranfragmente inklusive angrenzenden Signalmoleküle durch magnetische Separierung der Kügelchen. Ein Vergleich der immunisolierten Proteine von aktivierenden (2B4) mit inhibierenden (NKG2A) NK Zell Rezeptoren mittels 2D-DIGE führte zur Entdeckung mehrerer Proteine, die spezifisch mit 2B4 assoziiert waren, und die anschließend durch Massenspektrometrie identifiziert wurden. Hierbei handelte es sich unter anderem um Proteine, die eine wichtige Aufgabe bei der Signaltransduktion oder bei der Umorganisation des Zytoskeletts erfüllen und somit einen ersten Einblick in den Aufbau multimolekularer Komplexe und deren Rolle zur NK Zell Regulierung geben. In einem zweiten Projekt untersuchten wir die Glykosylierung von 2B4 und konnten zeigen, dass 2B4 sowohl in NK Zelllinien als auch in primären NK Zellen differenziell glykosyliert ist. Die unterschiedliche Glykosylierung von 2B4 konnte auf an N- und O-gebundene Sialinsäuren zurückgeführt werden. Glykosylierung spielt eine wichtige Rolle bei Rezeptor-Liganden Erkennung und deren Interaktion, kann aber auch zur Abstoßung von Molekülen führen. Durch die Verwendung eines rekombinanten Fusionsproteins konnten wir zeigen, dass N-verknüpfte Kohlenhydrate essentiell für die Bindung von 2B4 an seinen Liganden CD48 sind. Im Gegensatz dazu übt die Sialylierung von 2B4 einen negativen Einfluss auf die Ligandenbindung aus, da die Interaktion zwischen 2B4 und CD48 nach Entfernung von Sialinsäuren erhöht wurde. Dieser Effekt konnte durch funktionelle Tests bestätigt werden, da eine Desialylierung von NK Zellen oder die Inhibierung der O-Glykosylierung zur Verstärkung der 2B4-vermittelten Lyse von CD48 exprimierenden Zielzellen führte. Diese Daten zeigen, dass die Glykosylierung von 2B4 einen wichtigen Einfluss auf die NK Zell Funktion besitzt. Veränderungen der Glykosylierung während NK Zell Entwicklung und Aktivierung könnten daher an der Regulation von NK Zell Antworten beteiligt sein.