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Capillary array isoelectric focusing with laser-induced fluorescence detection: milli-pH unit resolution and yoctomole mass detection limits in a 32-channel system

Chemistry Department, University of Washington, Seattle, WA 98195-1700, USA.
Analytical and Bioanalytical Chemistry (Impact Factor: 3.58). 03/2010; 397(8):3305-10. DOI: 10.1007/s00216-010-3595-x
Source: PubMed

ABSTRACT We report a multiplexed capillary electrophoresis system employing an array of 32 capillaries with a micromachined sheath-flow cuvette as the detection chamber. The sample streams were simultaneously excited with a 473-nm laser beam, and the fluorescence emission was imaged on a CCD camera with a pair of doublet achromat lens. The instrument produced mass detection limits of 380 +/- 120 yoctomoles for fluorescein in zone electrophoresis. Capillary isoelectric focusing of fluorescent standards produced peaks with an average width of 0.0029 +/- 0.0008 pH. Capillary coating stability limits the reproducibility of the analysis.

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    ABSTRACT: cosa intendiamo quando si parla di bassa dose? Numerosi aspetti presenti in letteratura inducono a ritenere che lo stesso concetto di "bassa dose" deve as-sumersi nei termini di una comparazio-ne con una titolazione ritenuta biologi-camente efficace e dunque proprio l'ag-gettivo "bassa" costringe il ricercatore a disegnare i limiti entro cui definire con rigore che il composto in analisi è presente in bassa dose in un sistema chimico ed ha proprietà bio-funziona-li. Una prima definizione di "bassa do-se" deriverebbe perciò dall'applicazio-ne biologica o farmacologica di un composto in soluzione, ovvero dalla concentrazione minima efficace che la sostanza ha una volta posta in un siste-ma organico e non necessariamente da un ragionamento chimico-fisico. – Per avere un'idea inizialmente ap-prossimativa dell'azione biologica di una soluzione chimica, la massa di principio attivo che potrebbe essere pre-sente in una soluzione bioattiva spesso rientra nell'intervallo dei milligrammi o microgrammi, cioè 10 -3 o 10 -6 g, con-siderate concentrazioni ponderali usua-li in farmacologia. Tuttavia le cellule po-trebbero lavorare con dosi significati-vamente più basse di quelle fin qui in-dicate 1 . Considerando che il volume cellulare è di pochi picolitri, cioè qual-che milionesimo di mm 3 , un sale come NaCl potrebbe essere presente in quan-tità prossime agli attogrammi/litro o zeptogrammi/litro cioè mille miliardi o un milione di miliardi meno "concen-trato" delle dosi esemplificate come bioattive. Forse, per la cellula, il terre-Il concetto di bassa o bassissima dose (UHD) viene spesso riferito all'idea che si ha di un sistema chimico-fisico, dove il mo-dello stocastico gas-like e le cinetiche markoviane garantirebbero una spiegazio-ne teorica dell'interazione ligando-recet-tore in un sistema biologico. In realtà, non si dovrebbe sottostimare la partecipazio-ne dell'acqua liquida nelle proprietà bioat-tive di una UHD, soprattutto alla luce del-le nuove scoperte e teorie messe in cam-po: l'acqua è una materia condensata do-tata di elevata strutturalità ed informati-vità. Concetti come domini di coerenza, la coesistenza di una natura bifasica alla Lan-dau in condizioni ambiente, nano struttu-re e nanobolle, proprietà quantistiche del-l'acqua, stanno emergendo come caratte-ristiche esclusive di questo composto che, se in parte giustificano il significativo nu-mero di anomalie fisiche possedute da questo liquido, permettono di allargare il dibattito sul ruolo che l'acqua ha nei vi-venti. Anche la biofisica cellulare deve es-sere riveduta e corretta se si prende in considerazione la struttura dell'acqua. È chiaro perciò che l'attività di sostanze molto poco concentrate o estremamente diluite diventa un argomento scientifica-mente plausibile, sulla base dei nuovi con-cetti ed evidenze che stanno attualmen-te emergendo nella letteratura interna-zionale.
    ATTI DEL XXVI CONGRESSO DI MEDICINA BIOLOGICA – LOW DOSE MEDICINE – UPDATE RESEARCH – SAFE THERAPY Milano, 26 Maggio 2012;
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    ABSTRACT: CIEF and CZE are coupled with LIF detection to create an ultrasensitive 2-D separation method for proteins. In this method, two capillaries are joined through a buffer-filled interface. Separate power supplies control the potential at the injection end of the first capillary and at the interface; the detector is held at ground potential. Proteins are labeled with the fluorogenic reagent Chromeo P503, which preserves the isoelectric point of the labeled protein. The labeled proteins were mixed with ampholytes and injected into the first-dimension capillary. A focusing step was performed with the injection end of the capillary at high pH and the interface at low pH. To mobilize components, the interface was filled with a high pH buffer, which was compatible with the second-dimension separation. A fraction was transferred to the second-dimension capillary for separation. The process of fraction transfer and second dimension separation was repeated two dozen times. The separation produced a spot capacity of 125.
    Electrophoresis 08/2010; 31(15):2650-4. DOI:10.1002/elps.201000151 · 3.16 Impact Factor
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    ABSTRACT: Pressure-driven remobilization without an applied electric field is shown to be possible with capillary isoelectric focusing using packed capillaries. The capillary dimensions are 100 μm i.d. and 2 cm in length, and the packing is made of 0.9 μm nonporous silica particles that are chemically modified with a brush layer of polyacrylamide. Both reversible and irreversible adsorption are shown to be negligible. The packed capillaries eliminate the problem of unwanted hydrodynamic flow between reservoirs. Three proteins are focused: trypsin inhibitor, carbonic anhydrase II, and myoglobin. The time required for focusing in the packed capillaries is increased by only a factor of 2 compared to the open capillary, giving complete focusing in less than 15 min at 200 V/cm. The packed capillaries allow the use of higher electric fields, with resolution continually increasing up to at least 1500 V/cm. The packing obstructs diffusional broadening after the field is turned off: for trypsin inhibitor, D = 6.1(±0.3) × 10(-8) cm(2)/s for the packed capillary vs D = 28.8(±0.3) × 10(-8) cm(2)/s for the open capillary. The broadening contributed by the packing during remobilization is from eddy diffusion, and it is described by its plate height, H, which is the variance per unit length: H = σ(2)/L = 0.64 μm. This limits the resolution to 0.1 pH units for the 2 cm capillary having a pH range of 3-10, giving a theoretical peak capacity of 47.
    Analytical Chemistry 10/2010; 82(21). DOI:10.1021/ac101680z · 5.83 Impact Factor
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