Evaluierung der biologischen Sicherheit von Xenotransplantaten : Untersuchungen zur Übertragung von porzinen endogenen Retroviren in-vitro und in-vivo /

Abstract

Erscheinungsjahr auf der Haupttitels.: 2004 Berlin, Humboldt-Univ., Diss., 2005.

Full text

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Evaluierung der biologischen Sicherheit von Xenotransplantaten:
Untersuchungen zur Übertragung von porzinen endogenen
Retroviren in vitro und in vivo

DISSERTATION
zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)

im Fach Biologie

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I der Humboldt-Universität
zu Berlin

von
Diplom-Biochemiker, Markus Irgang
(24.8.1970, Berlin)

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. J. Mlynek

Dekan der Mathematischen-Naturwisenschaftlichen Fakultät I
Prof. T. Buckhout, Ph.D.

Gutachter:
Prof. Dr. R. Kurth
Prof. Dr. D. Krüger
PD Dr. T. Wolff

Tag der Einreichung: Dienstag, den 28.09.2004
Tag der mündlichen Prüfung: Mittwoch, den 23.03.2005
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Abstrakt:
Einleitung: Die im Genom der Schweine integrierten porzinen endogenen Retroviren
(PERV) gehören zu den potentiellen humanpathogenen Erregern, die eines der Risiken bei der
Xenotransplantation darstellen. Für die Abschätzung des Infektionsrisikos von PERV sind
drei Verfahrensweisen von Bedeutung: Erstens die Evaluierung der PERV-Freisetzung aus
porzinen Zellen und Geweben; Zweitens die Etablierung eines In vivo-Infektionsmodells und
Drittens ein retrospektives Screenen von Patienten. Methoden: Die PERV-Expression in
Inselzellen von Schweinen der Deutschen Landrasse wurde in vitro und in vivo evaluiert.
Anschließend wurde PERV auf nicht-humanen Primatenzellen passagiert. In einem zweiten
Modellversuch wurde murinen Zellen in vitro und SCID-Mäusen in vivo zellfreies PERV
appliziert. Schließlich wurden Seren von Patienten analysiert. Ergebnisse: Die untersuchten
Inselzellen setzten keine Viruspartikel frei und konnten somit weder humane Zellen noch
BALB/c-Mäuse infizieren. Die verwendeten Affenzellen produzierten infektiöses PERV mit
geringer Replikation. Weder in den murinen Modellversuchen noch in den untersuchten
Patienten wurde eine Übertragung von PERV beobachtet. Schlussfolgerung: Schweine der
Deutschen Landrasse könnten als Ausgangsbasis für die Zucht sicherer Schweine für die
Xenotransplantation dienen. Da keine Infektion verschiedener muriner Zellen mit PERV
beobachtet wurde, muss angenommen werden, dass Publikationen anderer Arbeitsgruppen,
die eine PERV-Infektion in SCID-Mäusen diagnostizierten, ein falsch-positives Ergebnis
aufgrund von Mikrochimärismus oder aufgrund von Pseudotypisierungen mit murinen
endogenen Retroviren wiedergeben. Unsere Befunde werden dadurch erhärtet, dass der
Rezeptor für PERV-A auf murinen Zellen nicht exprimiert wird und diese auch in vitro nicht
infiziert werden konnten. In Übereinstimmung mit den weltweit etwa 200 behandelten
Patienten konnte auch in den beiden neuen Studien keine Übertragung von PERV festgestellt
werden.

Schlagwörter: Porzine endogene Retroviren, Xenotransplantation, Transmission, Tiermodell






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Abstract:
Objective: Porcine endogenous retroviruses (PERVs) are integrated in the porcine genome
and are able to infect human cells in vitro. Therefore, PERVs are one of the possible
pathogens which poses a risk for xenotransplantations. In this study three significant methods
were used to evaluate the infectious risk of PERV: The release of PERV particles from
porcine cells and tissues, the formation of an in vivo infection model and a retrospective
screening of patients. Methods: Islet cells from german landrace pigs were co-cultivated with
human cells in vitro and were transplanted in BALB/c mice in vivo. Serial passaging
experiments were performed with nonhuman primate cells. Murine cells were incubated in
vitro and SCID mice in vivo with PERV. Sera of patients who were treated ex vivo with
porcine liver cells and who had received islet cells were investigated for antibodies against
PERV. Results: No virus release were observed in german landrace islet cells, thus they were
neither able to infect human cells nor BALB/c mice. The used nonhuman primate cells
released low replicating PERVs. None of the murine cells could be infected by PERV and no
provirus integration was observed in different SCID mice organs. PERV-specific antibodies
were found in none of the investigated patients. Conclusion: German landrace pigs could be
used as a source for breeding safe genetically modified pigs suitable for xenotransplantation.
Since there were no detectable PERV infection of different murine cells and SCID mice, it
have to be supposed, that previously reported PERV transmissions to SCID mice might be
due to microchimerism or to pseudotyping of murine endogenous retroviruses. Our results
were confirmed by the fact, that the receptor for PERV-A is not expressed on murine cells
and that these cells could not be infected in vitro. The absence of a PERV transmission in the
investigated patients, correspond to the results obtained from approximately twohundred
treated patients worldwide.

Keywords: Porcine endogenous retroviruses, Xenotransplantation, Transmission, Animal
model







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Inhaltsverzeichnis

1. EINLEITUNG............................................................................................................7
1.1 Xenotransplantation......................................................................................................7
1.2 Tiere als Organquelle für die Xenotransplantation.......................................................7
1.3 Retroviren ...................................................................................................................15
1.3.1 Aufbau retroviraler Viruspartikel ...............................................................................17
1.3.2 Genomaufbau der Retroviren......................................................................................18
1.3.3 Retrovirale Proteine....................................................................................................19
1.4 Porzine endogene Retroviren......................................................................................22
1.5 Zielsetzung..................................................................................................................26
2. MATERIAL UND METHODEN...........................................................................28
2.1 Zellbiologische Methoden ..........................................................................................28
2.1.1 Primäre Zellen und Zelllinien.....................................................................................28
2.2 Molekularbiologische Methoden................................................................................31
2.2.1 Proteinisolierung.........................................................................................................31
2.2.2 Rekombinante virale Proteine und Peptide.................................................................31
2.2.3 Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE)........................................................32
2.2.4 DNA Isolierung aus Zellen und Geweben..................................................................33
2.2.5 RNA Isolierung aus Zellen und Geweben..................................................................34
2.2.6 Polymerase Kettenreaktion (PCR)..............................................................................34
2.2.7 Sensitivität der verwendeten Primer...........................................................................35
2.2.8 RT-PCR.......................................................................................................................36
2.3 Immunologische Methoden ........................................................................................36
2.3.1 PERV-spezifische Antiseren.......................................................................................36
2.3.2 Spezies-spezifische Antikörper...................................................................................37
2.3.3 Western Blot ...............................................................................................................37
2.3.4 Enzymgekoppelter Immunadsorptionstest (ELISA)...................................................38
2.3.5 Durchflusszytometrie..................................................................................................39
2.4 Virologische Methoden...............................................................................................39
2.4.1 Virusisolate.................................................................................................................39
2.4.2 Isolierung von Viruspartikeln aus Zellkulturüberständen...........................................40
2.4.3 Bestimmung der Reversen Transkriptase Aktivität....................................................40
2.4.4 Infektionsstudien in vitro............................................................................................40
2.4.5 Infektionsstudien in vivo.............................................................................................41
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Inhaltsverzeichnis

2.4.6 Klinische Studien........................................................................................................42
3. ERGEBNISSE..........................................................................................................45
3.1 Keine Übertragung von PERV auf humane Zellen nach Kokultivierung mit porzinen
Inselzellen der Deutschen Landrasse.........................................................................45
3.2 Keine Infektion von BALB/c-Mäusen mit PERV nach Transplantation verkapselter
Inselzellen der Deutschen Landrasse.........................................................................47
3.3 Analyse der Expression PERV-spezifischer mRNA und Proteine in Inselzellen der
Deutschen Landrasse..................................................................................................48
3.4 Untersuchung der Infektion von Zelllinien nicht-humaner Primaten mit PERV .......50
3.5 Etablierung einer Methode zur Detektion von gespleißter und ungespleißter PERV-
spezifischer mRNA....................................................................................................53
3.6 Analyse der Expression ungespleißter und gespleißter mRNA von PERV in
infizierten Zelllinien nicht-humaner Primaten...........................................................55
3.7 Analyse der Replikationsfähigkeit des an Affenzellen adaptierten PERV-A/C.........57
3.8 Keine Übertragung von PERV auf murine Zellen in vitro.........................................59
3.9 Keine Infektion von SCID-Mäusen mit PERV-A/C in vivo.......................................61
3.10 Höhere Sensitivität neuer Nachweismethoden durch Verwendung rekombinanter
viraler Proteine...........................................................................................................62
3.11 Keine Übertragung von PERV auf Patienten nach extrakorporealer
Leberunterstützung.....................................................................................................64
3.12 Antikörper gegen porzine Leberproteine in Patienten, die mit einem extrakorporealen
Leberunterstützungssystem behandelt wurden ..........................................................68
3.13 Keine Übertragung von PERV auf Patienten nach Transplantation porziner
Inselzellen ..................................................................................................................70
4. DISKUSSION...........................................................................................................72
4.1 Evaluierung der PERV-Freisetzung aus porzinen Inselzellen der Deutschen Landrasse
in vitro und in vivo.....................................................................................................72
4.2 Versuche der Etablierung eines In vivo-Infektionsmodells mit nicht-humanen
Primaten.....................................................................................................................74
4.3 Versuche zur Etablierung eines In vivo-Infektionsmodells mit Kleintieren...............80
4.4 Retrospektive Untersuchung von Patienten, die mit porzinen Zellen und Geweben
behandelt wurden.......................................................................................................82
5. ZUSAMMENFASSUNG.........................................................................................88
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