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Structural Studies on Ferric Uptake Regulator Proteins from Mycobacterium tuberculosis

Source: OAI

ABSTRACT Iron is the most abundant trace element in the human body and zinc is the second one. Control of ion homeostasis is of vital importance for mammals and bacteria. Regulation of the ion flux into or out of the cell is a complex and articulated mechanism that still needs to be elucidated. The highly specialized pathogen Mycobacterium tuberculosis has to contend with iron sequestration in order to survive in the human body. Iron metabolism is regulated by controlling transcription of genes involved in iron uptake, transport and storage. Paucity of this metal triggers an extensive response to increase iron acquisition whereas an excess of it can be toxic for the cell. The control of intracellular iron concentration is also linked to other important processes including oxidative stress response and the regulation of virulence factors. Recent studies have shown that, in patients affected by TB/HIV exposed to high level of dietary iron, the risk of active pulmonary tuberculosis increases. In M. tuberculosis the ferric uptake regulator A (FurA) is activated by Fe2+ to bind specifically to its target DNA sequence thereby repressing the downstream genes. Zinc is also an important element for all living organisms and serves as a cofactor in all six classes of enzymes and also in several regulatory proteins. The intracellular concentration of this metal must be carefully regulated due its toxicity. Compared with eukaryotes, little is known about zinc homeostasis in bacteria. In the tuberculosis genome several genes coding for zinc proteins have been classified but curiously no zinc regulator has been yet defined. Surprisingly, instead, two Fur genes were identified: Mtb furA and Mtb furB, but no clear structural or functional distinction has been reported. In this thesis a careful and detailed structural and biological description of FurA and FurB proteins is presented. Using a variety of biochemical and biophysical methods - including electrophoretic mobility shift assay (EMSA), site directed mutations, isothermal calorimetry (ITC), microPIXE analysis, extended X-ray absorption fine spectroscopy (EXAFS) and X-ray crystallography - we investigated the metal binding sites together with the nature and the structure of these proteins. The combination of these results enable us to distinguish between structurally and functionally distinct metal binding sites, provide a meticulous description and qualitative and quantitative characterization of them, propose biological roles and present for the first time a 3D picture of a zinc uptake regulator. Eisen ist das häufigste Spurenelement im menschlichen Körper, Zink das zweithäufigste. Die Kontrolle der Ionenhomeostase ist von überlebenswichtiger Bedeutung für alle Organismen. Die Regulierung des Ionenflusses in oder aus der Zelle ist ein komplexer und und steng regulierter Mechanismus, der noch weitestgehend ungeklaert ist. Der hochspezialisierte Krankheitserreger Mycobacterium tuberculosis muss sich mit der Sequestration von Eisen begnügen, um im menschlichen Körper überleben zu können. Der Eisenstoffwechsel wird durch die transktriptionelle Regulation von Genen kontrolliert, die mit der Aufnahme, dem Transport und der Speicherung von Eisen zusammenhängen. Der Mangel dieses Metalls löst eine weitreichende Reaktion hin zur erhöhten Aufnahme von Eisen aus, während ein Überschuss für die Zelle toxisch sein kann. Die Kontrolle der intrazellulären Eisenkonzentration ist mit anderen wichtigen Prozessen wie der Reaktion auf oxidativen Stress und der Regulation von Virulenzfaktoren. Neuere Studien haben gezeigt, dass bei TB/HIV-Patienten die hohe Mengen diätisches Eisen zu sich nehmen das Risiko einer akuten offenen Tuberkulose ansteigt. In M. tuberculosis wird der Eisenaufnahmeregulator A (engl. ferric uptake regulator A: FurA) durch Fe2+ zur spezifischen Bindung an seine DNA-Zielsequenz aktiviert, wodurch nachgeordnete Gene reprimiert werden. Zink ist ein weiteres wichtiges Element für alle lebenden Organismen und dient als Kofaktor in allen sechs Enzymklassen sowie in verschiedenen Regulationsproteinen. Die intrazelluläre Konzentration dieses Metalls muss aufgrund seiner Toxizität sehr genau reguliert werden. Verglichen mit Eukaryonten ist nur sehr wenig über die Zinkhomeostase in Bakterien bekannt. Im Genom von M. tuberculosis wurden mehrere Gene fuer potentiell Zink bindende Proteine identifiziert, allerdings wurde bisher seltsamerweise kein Zinkregulator gefunden. Stattdessen wurden erstaunlicherweise zwei Fur-Gene identifiziert: Mtb furA und Mtb furB, allerdings wurde kein eindeutiger struktureller oder funktioneller Unterschied berichtet. In dieser Arbeit wird eine sorgfältige und detaillierte strukturelle und biologische Beschreibung der FurA- und FurB-Proteine dargestellt. Mit Hilfe einer Reihe von biochemischen und biophysikalischen Methoden, darunter Untersuchungen der elektrophoretischen Mobilitätsveränderungen (engl. electrophoretic mobility shift assay: EMSA), ortsspezifische Mutationen, isothermale Titrations Kalorimetrie (ITC), microPIXE, Röntgenabsorptionsspektroskopie (engl. extended X-ray absorption fine structure: EXAFS) und Röntgenkristallographie, haben wir die Metallbindungsstellen zusammen mit der Struktur und den Eigenschaften dieser Proteine charakterisiert. Die Kombination dieser Ergebnisse erlaubte es zwischen strukturell und funktionell unterschiedlichen Metallbindungsstellen zu unterscheiden, eine aeusserst genaue qualitative und quantitative Charakterisierung von ihnen zu erstellen. sowie eine Erklärung ihrer biologischen Aufgaben und zum ersten Mal eine dreidimensionale Darstellung eines Zinkaufnahmeregulators vorzustellen.

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