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Estudio de la participación de los reguladores CatR en el metabolismo de 3-clorobenzoato en Cupriavidus necator JMP134 (pJP4)

Source: OAI

ABSTRACT Cupiavidus necator JMP134 (pJP4), antes denominada Ralstonia eutropha JMP134 (pJP4), es una bacteria ambiental capaz de utilizar los compuestos contaminantes 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D) y 3-clorobenzoato (3-CB) como única fuente de carbono y energía. Las vías metabólicas que permiten dichas capacidades se encuentran codificadas en los genes cromosomales benABC y benD, y en la vía de degradación de clorocatecoles, codificados por los genes tfd del plasmidio pJP4. Se ha descrito que el regulador TfdR/S (familia LysR) activa la expresión de los genes tfd. El regulador de la vía de degradación de catecol, CatR, tiene en común aspectos genéticos, funcionales y evolutivos con el regulador TfdR/S. Estos antecedentes hacen posible proponer que CatR podría estar influyendo en la expresión de los genes tfd. En esta memoria se estudió el papel de CatR en la degradación de 3-CB y 2,4-D. Para esto se identificaron los putativos genes catR en el genoma de C. necator, encontrándose dos, catR1 y catR2, cuyo contexto genómico sugiere que podrían participar diferencialmente en el metabolismo de cloroaromáticos. Estos genes fueron clonados e introducidos en C. necator. Adicionalmente, se obtuvo una cepa de C. necator mutante del gen catR1 mediante una estrategia de doble recombinación homóloga. Esta mutante fue complementada con los genes catR1 o catR2. Estas cepas fueron estudiadas mediante curvas de crecimiento en medios de cultivos con distintas concentraciones de 3-CB, 2,4-D o benzoato (BZ). En cada caso se determinó la densidad óptica en fase estacionaria y la velocidad de crecimiento. Además, se evaluó la degradación de 3-CB y BZ mediante la detección del compuesto por HPLC. Estos estudios permitieron determinar que tanto CatR1 como CatR2 aumentan la degradación de 3-CB, puesto que la sobreexpresión de sus genes aumentó la velocidad de crecimiento (m) en ±2 veces. Consistente con lo anterior, la ausencia de CatR1 disminuyó la velocidad de crecimiento en ±3 veces en 3-CB y la tasa de degradación de este sustrato disminuyó ±3 veces, lo cual también fue observado durante el crecimiento en BZ. Adicionalmente, los estudios de complementación realizados para corregir la ausencia de CatR1, con los genes catR1 y catR2 por separado, mostraron recuperar el fenotipo silvestre en ambos sustratos. Por otra parte, la degradación de 2,4-D fue mejorada por CatR2, puesto que la sobreexpresión del gen catR2 impidió la disminución en el rendimiento celular que se observa en la cepa silvestre al aumentar la concentración de 2,4-D. En cambio, la velocidad de crecimiento en 2,4-D a altas concentraciones de sustrato se vio desfavorecida por la sobreexpresión del gen catR1. Los resultados de este trabajo indican que los reguladores CatR1 y CatR2 modifican el crecimiento en estos compuestos, probablemente a través de la modulación de la expresión de los genes ben y tfd. Lo anterior se basa en que ambos reguladores poseen cercanía estructural con el regulador TfdR y compartirían la capacidad de interactuar con las respectivas regiones promotoras. En este contexto, se propone un modelo de la regulación ejercida por CatR1 y CatR2 en C. necator. Este modelo sugiere que estos reguladores modulan diferencialmente los genes tfd, de modo que CatR2 activa los módulos génicos tfd I-II y el gen tfdA, mientras que CatR1 activa sólo el módulo tfd I. En base a modelamiento molecular, se predijo que las diferencias observadas entre el regulador CatR1 y CatR2 podrían ser explicadas por la afinidad de unión a DNA y no por la unión del inductor.

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