Optimized straight forward procedure for covalent surface immobilization of different biomolecules for single molecule applications.

Abstract

Covalent chemisorption of biomolecules to surfaces with high density and low unspecific background is prerequisite for most optical and mechanical single molecule experiments and accordingly, many recipes have been developed. However, new establishment of the surface functionalization process in the lab usually is still difficult and time consuming due to the complex procedures containing many pitfalls. Therefore, based on the known recipes, we developed and optimized a simple straight forward protocol. We demonstrated it resulting in a high density of the coupled biomolecules, homogeneous surfaces and a low unspecific background when binding nucleic acids, peptides and proteins. The protocol was optimized for borosilicate cover glasses and silicon nitride atomic force microscope cantilevers commonly used in single molecule experiments and takes advantage of commonly used chemicals. It consists of only four steps, silanol group generation, amination, grafting of poly(ethylene glycol) to the surface and biomolecule coupling. All individual steps were optimized comparing different variations partially described in the literature. Finally, a detailed description is provided which allows avoiding most sources of contamination, often being a main hurdle on the way to single molecule experiments.

Full text

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Untersuchung zu Struktur-Funktionsbeziehungen
von Membranproteinen mittels
Kraftspektroskopie








Inaugural-Dissertation



zur Erlangung des Doktorgrades
der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf


vorgelegt von

Leoni Oberbarnscheidt
aus Düsseldorf






Düsseldorf, Mai 2010

Page 2

aus dem Institut für physikalische Chemie II
der Heinrich-Heine Universität Düsseldorf
























Gedruckt mit der Genehmigung der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der
Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf




Referent: Dr. Filipp Oesterhelt
Koreferent: Prof. Dr. Lutz Schmitt

Tag der mündlichen Prüfung: 13.7.2010

Page 3

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis
Publikationen ......................................................................................................................... 1
1 Einleitung ........................................................................................................................ 3
2 Rasterkraftmikroskopie (Atomic Force Microscopy) ..................................................... 4
2.1 Aufbau eines Rasterkraftmikroskops ........................................................................... 4
2.2 Anwendungen des Rasterkraftmikroskops ................................................................... 5
2.2.1 Abbilden .................................................................................................................... 5
2.2.2 Kraftspektroskopie .................................................................................................... 5
2.3 Rasterkraftspektroskopie zur Untersuchung von Membranproteinen .......................... 7
3 Entwicklung und Anwendung von Methoden zur Bestimmung der freien
Energielandschaft einer Bindung......................................................................................... 10
4 Einfluss von inter- und intramolekularen Interaktionen auf den Mechanismus von
Membranproteinen am Beispiel von Sensorhodopsin II ..................................................... 14
5 Oberflächenfunktionalisierung und Spitzenmodifikation ............................................. 19
6 Einfluss der Multivalenz des Ni- NTA- Histag Symstems auf seine Eigenschaft als
molekularer Griff ................................................................................................................. 21
7 Das Lantibiotikum Nisin und der ABC- Transporter NisT ........................................... 24
7.1 Material und Methoden .............................................................................................. 27
7.1.1 Herstellung Pränisin ................................................................................................ 27
7.1.2 Schutz mit BOC ...................................................................................................... 28
7.1.3 Anbinden Pränisin ................................................................................................... 28
7.1.4 Labeln von Pränisin mit alexa488 über einen PEG-Linker .................................... 29
7.1.5 Anbinden NisT ........................................................................................................ 29
7.1.6 Kontrollmessung zum Binden von modifiziertem Pränisin an NisT ...................... 30
7.1.7 Kraftmessungen von Pränisin an NisT Vesikeln .................................................... 30
7.2 Ergebnisse .................................................................................................................. 31
7.2.1 Kopplung Pränisin ................................................................................................... 31
7.2.2 Anbinden NisT und Kontrollmessung zum Binden von modifiziertem Pränisin an
NisT ..................................................................................................................... 34
7.2.3 Kraftspektroskopie zur Messung der Pränisin- NisT- Interaktion .......................... 36
7.3 Diskussion ............................................................................................................... 39
8 Zusammenfassung ......................................................................................................... 42
9 Summary ....................................................................................................................... 43
Abkürzungsverzeichnis ....................................................................................................... 44
Abbildungsverzeichnis ........................................................................................................ 45
Anhang ................................................................................................................................ 46
Literaturverzeichnis ................................................................................................................ I

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Publikationen
1
Publikationen

Diese Dissertation beruht auf folgenden Publikationen:

L. Oberbarnscheidt , A. Reichel, M. Bhagawati, R. Janissen, J. Piehler, F. Oesterhelt, 2010
Multivalent interactions in flexible interaction pairs increase their affinity but not the
mechanical stability
Manuskript in Revision

L. Oberbarnscheidt, R. Janissen, F. Oesterhelt, 2009
Direct and model free calculation of force-dependent dissociation rates from force
spectroscopic data
Biophys. J., 97(9), 19-21

L. Oberbarnscheidt, R. Janissen, S. Martell, M. Engelhard, F. Oesterhelt, 2009
Single-molecule force spectroscopy measures structural changes induced by light
activation and transducer binding in sensory rhodopsin II
J. Mol. Biol., 394(3), 383-390

R. Janissen, L. Oberbarnscheidt, F. Oesterhelt, 2009
Optimized straight forward procedure for covalent surface immobilization of
different biomolecules for single molecule applications
Colloids Surf B Biointerfaces,71(2), 200-207

D.A. Cisneros, L. Oberbarnscheidt, A. Pannier, J.P. Klare, J. Helenius, M. Engelhard, F.
Oesterhelt, D.J. Muller, 2008
Transducer binding establishes localized interactions to tune sensory rhodopsin II
Structure, 16(8), 1206-1213

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2
0

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Einleitung
3
1
Einleitung
Die Nanotechnologie rückt heutzutage immer mehr in das Bewusstsein der Öffentlichkeit.
Hierbei stehen sich Vorstellungen aus Science Fiction Romanen, in denen
Nanotechnologie intelligente Roboter und implantierte Microchips ermöglicht,
Diskussionen gegenüber, die vor der Gefahr von Nanopartikeln als Zusatzstoff in
Lebensmitteln warnen. Bei genauerer Betrachtung zeigt sich, dass sich hinter dem relativ
neuen, modischen Begriff „Nanotechnologie“ etablierte Forschungsfelder der Biologie,
Chemie und Physik verbergen. Mit biochemischen und biophysikalischen Methoden
werden mittlere bis große Biomoleküle untersucht, die mit ihrer Größenordnung im
Nanometerbereich liegen. Biomoleküle, wie Proteine oder DNA, werden hierbei als
biologische Nanomaschinen gesehen, und das Ziel der Nanotechnologie ist es, diese zu
verstehen und dann zu instrumentalisieren. Hierbei kann generell zwischen dem bottom-up
Ansatz und dem top-down Ansatz unterschieden werden. Bei ersterem werden komplexe
Maschinen aus kleinsten Funktionseinheiten nach dem biologischen Prinzip der
Selbstorganisation entwickelt, während beim letzteren kleinste nanoskalige Strukturen
durch Miniaturisierung geschaffen werden, die ihren Einsatz zum Beispiel zur
Effizienzsteigerung in der Mikroelektronik, als smarte Materialien oder als Sonden in der
Biomedizin finden.
Die Rasterkraftmikroskopie ist ein wichtiges Werkzeug der Nanotechnologie, da sie
sowohl die Untersuchung als auch die gezielte Manipulation einzelner Biomoleküle
erlaubt. Sie wurde 1986 aus der Rastertunnelmikroskopie entwickelt (Binning et al., 1986)
und ermöglicht es, nicht leitende Proben im Nanometer- und Pikonewtonbereich zu
untersuchen. Sie besitzt somit eine Auflösung, die zweihundert- bis dreihundert mal
kleiner ist als die Auflösung beugungslimitierter, optischer Methoden. In dieser Arbeit
wurde diese physikalische Methode genutzt und weiterentwickelt um Struktur-
Funktionsbeziehung und chemische Eigenschaften von biologischen Proben, nämlich den
Membranproteinen Sensorhodopsin und dem ABC-Transporter NisT, zu untersuchen.
Nachdem die Technik als solche und ihre Anwendung zur Untersuchung von
Membranproteinen in Kapitel 1 vorgestellt wird, wird in den weiteren Kapiteln der
Hintergrund zu den entsprechenden Publikationen und ihr Platz im Kontext erläutert.

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Rasterkraftmikroskopie (Atomic Force Microscopy)
4
2
Rasterkraftmikroskopie (Atomic Force Microscopy)
2.1 Aufbau eines Rasterkraftmikroskops
Das Prinzip des Rasterkraftmikroskops ist in Abbildung 1A schematisch dargestellt. Um
einzelne Moleküle abzubilden wird die Probe mit einer Spitze, deren Ende aus nur wenigen
Atomen besteht und die einen Radius von nur wenigen Nanometern besitzt (Abb. 1B, 1C),
abgerastert.

Abbildung 1: Schema des Prinzips eines Rasterkraftmikroskops und elektronenmikroskopische
Aufnahme von Spitzen
A: Schema vom Aufbau eines Kraftmikroskops. Der Laserstrahl wird auf die Rückseite einer Blattfeder
gelenkt, deren Auslenkung entsprechend den Eigenschaften der Probe ist. Die Auslenkung wird durch die
Reflektion des Lasers auf die unterschiedlichen Segmente einer Photodiode bestimmt. B: Elektronen-
mikroskopische Aufnahme von Spitzen, die in dieser Arbeit verwendet wurden. (Bilder entnommen von
https://www.veecoprobes.com.)

Mithilfe von Scannern in x- und y-Richtung wird hierzu entweder die Spitze über die
Probe gerastert oder die Probe unter der Spitze bewegt, wie es der Fall in der hier
vorliegenden Arbeit ist. Die Spitze befindet sich am Ende einer mit Gold beschichteten
Blattfeder (Cantilever), deren Bewegung von einem Laser detektiert wird, indem er auf die
Rückseite der Blattfeder gelenkt wird, von der er entsprechend des Lichtzeigerprinzips auf
eine Photodiode reflektiert wird. Die Photodiode ist in zwei oder vier Segmente unterteilt,
so dass die genaue Position des Lasers - und damit auch die Verbiegung des Cantilevers -
durch die Differenz der Signale der einzelnen Segmente bestimmt werden kann. Um zu
A

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Rasterkraftmikroskopie (Atomic Force Microscopy)
5
vermeiden, dass die Kräfte zu groß werden und die Probe zerstören, wird die Verbiegung
des Cantilevers möglichst konstant gehalten, indem die Entfernung zwischen Probe und
Spitze mit dem z-Scanner nachgeregelt wird. Aus den Daten der Verbiegung des
Cantilevers (Deflection) und der Einstellung des z-Scanners können sowohl
Oberflächenstruktur und Konsistenz der Probe (beim Abbilden) als auch ihre Stabilität
innerhalb ihrer Umgebung (bei Kraftmessungen) bestimmt werden.

2.2 Anwendungen des Rasterkraftmikroskops
2.2.1 Abbilden
Beim Abbilden wird die Oberflächenstruktur der Probe bestimmt, indem die Probe mit der
Spitze zeilenweise abgerastert wird. Hierbei bleiben Spitze und Probe entweder in
ständigem Kontakt (Contact Mode), wobei sich das Bild der Oberfläche dann aus dem
Deflection- und Höhenbild zusammensetzt. Eine andere Möglichkeit ist das Abrastern im
Tapping Mode, in dem die Spitze zum Oszillieren gebracht wird, so dass sich das Bild der
Oberfläche aus Änderungen der Amplitude der schwingenden Spitze ergibt, die durch
Wechselwirkungen zwischen Spitze und Probe entstehen. Der Tapping Modus eignet sich
besonders bei biologischen Proben, da die Proteine nicht so stark deformiert werden wie
im Contact Mode. So wird eine Auflösung im Nanometerbereich erreicht, bei der
Substrukturen reproduzierbar erkennbar sind, die vergleichbar mit der entsprechenden
Kristallstruktur sind (Möller et al., 1999; Heymann et al., 1999). Dies erlaubt es, die
Komplexbildung und Dynamik von Membranproteinen sichtbar zu machen, was zum einen
durch den Vergleich vieler Bilder einzelner Proteine erreicht wird (Scheuring et al., 2003;
Scheuring et al., 2004) und zum anderen durch die Weiterentwicklung der Methode zum
Highspeed Imaging (Viani et al., 2000). Hierbei werden viele Bilder von der Probe mit
einer Geschwindigkeit aufgenommen, die es erlaubt sie zu einem Film über die
molekularen Vorgänge zusammen zu setzen.

2.2.2 Kraftspektroskopie
Im Gegensatz zum Abbilden, bei dem die Spitze die Probe möglichst nicht beeinflussen
soll, wird bei der Kraftspektroskopie gerade ausgenutzt, dass die Probe durch die Spitze
manipulierbar ist. Das zu untersuchende Protein wird hierbei kovalent an die Spitze

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Rasterkraftmikroskopie (Atomic Force Microscopy)
6
gebunden, so dass es beim Wegziehen der Spitze von der Unterlage auseinander gezogen
wird und sich sequentiell entfaltet. Die kovalente Bindung wird entweder durch starkes
Eindrücken der Spitze in die Probe mit entsprechend hohen Kräften (300-1000 pN)
erreicht, (Oesterhelt et al., 2000) oder das Protein wird über spezielle Kopplungschemie
spezifisch an die Spitze gebunden. Für Proteine wurden solche Versuche zuerst am
Muskelprotein Titin (Rief et al., 1997) durchgeführt, bevor dann auch Messungen an
Membranproteinen wie Bacteriorhodopsin (BR) (Oesterhelt et al., 2000), Halorhodopsin
(Cisneros et al., 2005), dem Na/H-Antiporter (Kedrov et al., 2004) und anderen folgten.
Für die Entfaltung von Membranproteinen nimmt vor allem das BR die Rolle als
Modellsystem ein.
Nach früheren Entfaltungsexperimenten an BR wurde das Zwei-Schritt-Modell zur Faltung
von Membranproteinen entwickelt. Hiernach bildet die Sekundärstruktur stabile Segmente
in der Membran, die sich dann erst zur Tertiärstruktur formieren (Popot et al., 1987; Popot
et al., 1990). Bei Kraftmessungen wird nun das Protein durch die Abstandsvergrößerung
zwischen Spitze und Oberfläche entlang seines Polypeptidstranges auseinander gezogen,
wodurch die Sekundärstrukturelemente in definierten Sequenzen (z. B. paarweise α-
Helices) entfaltet werden, was durch definierte Zwischenabrisse (Peaks) zu sehen ist. Die
Kraftkurve der Entfaltung eines einzelnen Proteins zeigt den Anstieg der Kraft bei
Dehnung der Polypeptidkette mit zunehmendem Abstand. Die Kraft steigt bis sie so groß
ist, dass die Sekundärstruktur nicht mehr stabil ist und sich entfaltet, so dass sich die
Polypeptidkette verlängert und die Kraft wieder nachlässt bevor sie mit weiterem Ziehen
erneut ansteigt (Abb. 2). In der Umkehrung faltet sich das Protein in
Rückfaltungsexperimenten ebenfalls in diesen Segmenten (Janovjak et al., 2004). Die
Abrisse werden mit einer Genauigkeit in z-Richtung von ca. 1 nm und die entsprechende
Aufwendung von Kraft mit einer Genauigkeit von ca. 5 pN bestimmt. Die Kettenlänge der
entfalteten Polypeptidkette und ihre Elastizität kann mit dem Worm Like Chain (WLC)
Modell beschrieben werden (Bustamante et al., 1994). Im Gegensatz zum Freely Jointed
Chain (FJC) Modell, das eine Kette als Aneinanderreihung vieler in sich steifer Glieder
sieht, die nur an ihren Verlinkungen beweglich sind, stellt das WLC-Modell eine Kette dar,
die mit einer gewissen Steifheit kontinuierlich beweglich ist. Ihre Dehnung x unter der
Kraft F hängt von der thermischen Energie kBT, der Konturlänge der Kette L0 und der
Persistenzlänge P ab:

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Rasterkraftmikroskopie (Atomic Force Microscopy)
7
0
2
0
4
1
1
4
1
L
x
L
x
Tk
FP
B









[1]

Über die Beschreibung von Kraft-Weg Kurven mit dem WLC Fit können Kurven über ihre
Länge und die Abstände der Abrisse zueinander selektiert werden.


Abbildung 2: Beispiel Kraftkurve und Schema
Typische Kraftkurve der Entfaltung eines Bacteriorhodopsins (rote Kurve); das Schema zeigt den jeweiligen
Zustand des Bacteriorhodopsins. (1) Die Spitze ist auf der Oberfläche, es wirkt noch keine Kraft. (2) Mit
zunehmendem Weg, mit dem sich die Spitze von der Oberfläche entfernt, wird das Polypeptidkette des N-
Terminus gedehnt und die Kraft steigt. (3) Der N-Terminus wurde so weit gedehnt, dass die Kraft auf die
noch gefaltete Sekundärstruktur so groß wurde, dass sich die ersten beiden α-Helices entfalten. So wird die
ungefaltete Polypeptidkette länger und die Kraft lässt nach. Mit weiterem Abstand zwischen Spitze und
Probe wiederholt sich das sequentielle entfalten des Bacteriorhodopsins bis das Protein vollständig entfaltet
und von der Oberfläche gelöst ist


2.3 Rasterkraftspektroskopie zur Untersuchung von Membranproteinen
Um funktions- und lebensfähig zu sein muss sich die Zelle von ihrer Umgebung
abgrenzen; eukaryontische Zellen besitzen zudem verschiedene Kompartimente, in denen
unterschiedliche Bedingungen herrschen. So können lebenswichtige Faktoren wie der
Energiehaushalt in Mitochondrien oder die Entsorgung von überflüssigen Proteinen in
Lysozymen aufrechterhalten und gesteuert werden. Für die Kompartimentierung sind
Membrane verantwortlich, die nach dem Modell von Singer und Nicholson (Singer. und

Page 11

Rasterkraftmikroskopie (Atomic Force Microscopy)
8
Nicolson, 1972) aus einer zweidimensional flüssigen, doppelten Phospholipidschicht
bestehen, in die entweder integrale Membranproteine eingebettet oder membrangebundene
Proteine verankert sind. Die Phospholipidschicht ist impermeabel für Makromoleküle und
nur selektiv permeabel für Ionen, so dass der Verkehr solcher Substanzen durch
Membranproteine kontrolliert wird. Diese werden unterteilt in diejenigen, die den
Transport aktiv gegen einen Konzentrationsgradienten unterstützen und als Pumpen unter
Aufwendung von Energie zum Überleben der Zelle oder des Organismus beitragen oder in
solche, die den Transport als Kanal ermöglichen und steuern und so Energie gewinnen
können, wie zum Beispiel Bacteriorhodopsin (Berg, Tymoczko, Stryer, 2002).
Trotz dieser vielschichtigen Aufgaben und Relevanz von Membranproteinen, fällt auf, dass
verhältnismäßig wenige Strukturen bekannt sind, wenn man die Anzahl veröffentlichter
Strukturen von Membranproteinen mit der von löslichen Proteinen vergleicht. Dieses
Verhältnis verlagert sich noch mehr bei der Betrachtung von Membrankomplexen und
ihren bekannten Struktur-Funktionsbeziehungen und Mechanismen. Das mag sicherlich an
der schwierigeren Handhabung von Membranproteinen liegen, und daran, dass es für viele
biophysikalische Techniken erforderlich ist, dass das Protein in gelöster Form vorliegt. Es
gibt deutlich weniger Kristallstrukturen von Membranproteinen, da die wegen ihrer
Hydrophobizität hinzugefügten Detergenzien die für die Röntgenbeugung notwendige
Kristallisation aus der Lösung erschweren. Ebenso zeigen sich momentan Grenzen in der
Strukturbestimmung mittels NMR- (Nuclear Magnetic Resonance) Spektroskopie, die sich
dadurch ergeben, dass sich Proben rekonstituierter Membranproteine in Lösung sehr
anisotrop bewegen wodurch eine genaue Auswertung heute unmöglich ist. Dieses Problem
kann zwar durch die Anwendung von Feskörper-NMR gelöst werden, aber auch hier sind
die Daten der Messungen größerer Proteine zu komplex um Struktur-
Funktionsbeziehungen zu erhalten.
Ungeachtet dessen sind bessere Kenntnisse der Struktur von Membranproteinen für die
Medizin sehr wichtig, da Fehler in deren Struktur häufig verantwortlich für Krankheiten
sind und sie auch oft als Ziel für Medikamente genutzt werden (Dobson et al., 1999).
Die Untersuchung von Membranproteinen mit dem Rasterkraftmikroskop hat wesentliche
Vorteile: Membranproteine können innerhalb einer Membran untersucht werden, die
Proteine können durch die induzierte kovalente Bindung zur Spitze direkt manipuliert
werden und durch die Messung vieler einzelner Proteine können Aussagen über
Subpopulationen getroffen werden, wie es Ensemblemessungen nicht ermöglichen würden.
Für AFM-Messungen werden Membranproteine in künstlichen Lipiden rekonstituiert, auf

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Rasterkraftmikroskopie (Atomic Force Microscopy)
9
der Oberfläche adsorbiert und in Puffer gemessen. Dies erlaubt es Membranproteine unter
Bedingungen abzubilden, die den nativen Bedingungen einigermaßen ähnlich sind. Im
Gegensatz dazu stehen Messungen in Lösung oder in Mizellen, wie sie z. B. für NMR-
oder EPR- (Electron Paramagnetic Resonance) Spektroskopie nötig sind, oder auch die
Anordnung im Kristallgitter. Beim Abbilden kann die Oberflächenstruktur mit einer
Auflösung von unter einem Nanometer sichtbar gemacht werden (Czajkowski et al., 1998;
Engel und Müller, 2000), wobei die einwirkenden Kräfte von einigen Pikonewton
biologische Bindungen und Anordnungen weitaus weniger beeinflussen, als es bei
optischen Messungen oder durch Elektronenmikroskopie der Fall ist. Während bei der
Elektronenmikroskopie die Energie der eingestrahlten Elektronen ausreicht, kovalente
Bindungen zu brechen, erlauben die Messbedingungen optischer Methoden keine direkte
hochauflösende Abbildung von Biomolekülen.
Ein weiterer Vorteil der Rasterkraftmikroskopie besteht darin, dass das untersuchte Protein
durch die Interaktion mit der Spitze direkt manipulierbar ist. So sind durch Entfaltung auch
intra- und intermolekulare Interaktionen, die bei der Proteinfaltung eine Rolle spielen,
messbar (Kellermayer et al., 1997; Oesterhelt et al., 2000). Auch können Ligand-
Rezeptor- Wechselwirkungen gemessen werden, indem der an die Spitze gekoppelte
Ligand gezielt und unter definierten Bedingungen entsprechend zum Zielprotein
positioniert werden kann.
Das Entfalten einzelner Moleküle erlaubt es individuelle Unterschiede der Faltungs- und
Entfaltungswege, und damit die jeweiligen Ursprungszustände, aufzulösen, wie es in
Ensemblemessungen nicht der Fall ist. So kann aus den Kraftmessungen auch ein Bild über
die Energielandschaft und mögliche Faltungstrichter und deren Abhängigkeit von der
physiologischen Umgebung gewonnen werden (Radford et al., 2000; Janovjak et al.,
2004).
Zusammen mit den Kenntnissen der allgemeinen Struktur aus röntgenkristallografischen
Daten und Ergebnissen der NMR-Messungen und den Erkenntnissen über die Dynamik
einzelner gelabelter Aminosäuren aus z.B. EPR- oder Fluoreszenzmessungen trägt die
Rasterkraftmikroskopie so erheblich zum grundlegenden Verständnis der Struktur-
Funktionsbeziehungen von Membranproteinen bei.

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Entwicklung und Anwendung von Methoden zur Bestimmung der freien Energielandschaft
einer Bindung
10
3
Entwicklung und Anwendung von Methoden zur Bestimmung der
freien Energielandschaft einer Bindung
Im folgenden Kapitel wird der Hintergrund zur Publikation „Direct and model free
calculation of force-dependent dissociation rates from force spectroscopic data”
beschrieben, die zusammen mit Dr. Filipp Oesterhelt entwickelt wurde und ein neues
Modell zur Bestimmung der freien Energielandschaft einer Bindung vorstellt.

Durch die Faltung eines Proteins in seine korrekte Struktur wird aus einem
Polypeptidstrang ein komplexes System, das durch definierte Bewegungsfreiheit seine
spezielle Funktion erfüllen kann und so zu einer Maschine der Zelle wird. Die Faltung
entsteht durch die Bildung der korrekten Bindungen innerhalb des Polypeptidstranges, die
durch ihre spezielle Energielandschaft vorgegeben sind. Diese Energielandschaft kann
entsprechend des Levinthal-Paradoxons als Faltungstrichter beschrieben werden
(Levinthal, 1986). Demnach erfolgt die korrekte Faltung nicht durch zufälliges
Ausprobieren aller möglichen Kombinationen an Bindungen, da dies rein rechnerisch zu
Faltungszeiten von Proteinen führen würde, die in der Größenordnung des Alters der Erde
liegen, sondern durch Bildung von Strukturelementen in einer trichterähnlichen
Energielandschaft. Zudem wird sie durch zusätzliche Faltungshelferproteine (Chaperone)
unterstützt (Buchner, 2002). Umgekehrt wird bei Kraftmessungen das Protein auseinander
gezogen und so dessen Struktur aufgelöst. Wie oben beschrieben entfalten sich hier zuerst
die Strukturelemente, wie α-helices oder β-Faltblätter. So beträgt die Lebensdauer einer
einzelnen α-Helix 100 s und die paarweise angeordneter α-Helices 10 000 s, was der
gleichen Größenordnung wie der der Stabilität löslicher Proteine entspricht (Janovjak et a.,
2004). Der Vergleich der Entfaltungsmuster einzelner BR Proteine zeigt, dass neben den
Hauptpeaks, die für alle BR Proteine gleich sind und die auf das Entfalten in
Sekundärstrukturelemente hinweist, auch verschiedene Nebenpeaks auftreten, die auf
unterschiedliche Entfaltungswege hindeuten. Hierbei zeigt sich, dass äußere
physiologische Bedingungen eine wichtige Rolle in der Statistik spielen, welcher
Entfaltungsweg bevorzugt wird. So hat die Temperatur (Janovjak et al., 2003), der pH-
Wert (Kedrov et al., 2004) oder der oligomerische Zustand einen deutlichen Einfluss auf
das Entfaltungsmuster.

Page 14

Entwicklung und Anwendung von Methoden zur Bestimmung der freien Energielandschaft
einer Bindung
11
Durch das Lösen einzelner Bindungen können unter Zuhilfenahme Kramers Theorie
(Kramers, 1940) Teile des Energiepotentials mittels Kraftspektroskopie beschrieben
werden. Hierbei bilden die stabilen Zustände Täler, die durch energetisch höhere Berge
voneinander getrennt sind; um also vom Zustand A in einem Tal in den Zustand B des
anderen Tals zu gelangen, muss ein energetisch höherer Übergangszustand B’ durchlaufen
werden (Abb. 3). Im Protein können diese zwei Zustände zum Beispiel die geöffnete und
geschlossene Form eines Kanals sein, oder die aktive und inaktive Konformation eines
Enzyms, oder der gebundene und ungebundene Zustand eines Rezeptor-Ligand Systems.

Abbildung 3: Schema der Energiepotentiale unter Einwirkung von Kraft
Gezeigt ist der Zusammenhang zwischen den Potentialen der Zustände A und B (durchgezogene Linie) und
deren Änderung unter Einwirkung von Kraft (gestrichelte Linie). Durch die Ratenabhängigkeit der Abrisse
kann wie in Formel [4] beschrieben die Weite des Energiepotentials Δx und seine Zerfallsrate kdiss bestimmt
werden. Mithilfe von Jarzynskis Gleichung [5] lässt sich die Differenz der freien Energien der
Gleichgewichtszustände ΔG beschreiben.

Page 15

Entwicklung und Anwendung von Methoden zur Bestimmung der freien Energielandschaft
einer Bindung
12
Die Häufigkeit mit der die Barriere überwunden wird, wird durch die Dissoziationsrate kdiss
angegeben. Ohne äußere Einwirkung wird dieses Ereignis durch die Arrhenius-Gleichung
beschrieben, wonach kdiss folgendermaßen von der thermischen Energie kBT, der
Aktivierungsenergie des Systems EA und der charakteristischen Schwingungsfrequenz υ0
abhängt:

kdiss = υ0 * exp(ΔEA/kBT). [2]

Durch Anlegen einer Kraft F reduziert sich die Aktivierungsenergie um das Produkt der
Potentialweite Δx mit der angelegten Kraft (Bell et al., 1978; Evans et al., 1997):

kdiss = υ0 * exp((ΔEA – F * Δx)/kBT). [3]

Die Abhängigkeit der Dissoziationskonstante kdiss in dieser Gleichung erklärt sich dadurch,
dass die Kraft bei den AFM-Messungen konstant ansteigt und das System daher nicht im
Gleichgewicht gemessen wird. Bei langsamem Ziehen ist die Wahrscheinlichkeit, dass der
Übergangszustand durch thermisches Rauschen überwunden wird, deutlich erhöht, so dass
durchschnittlich geringere Abrisskräfte gemessen werden. Bei schnellerem Ziehen kann
das System dagegen nicht schnell genug reagieren, um seinen Zustand direkt zu ändern, so
dass die Kraft bis zum Lösen des Zustands weiter ansteigt und durchschnittlich höhere
Kräfte gemessen werden. Nach Bell-Evans lassen sich die Dissoziationskonstante k0 (bei
der keine Kraft auf das System wirkt), sowie die Potentialweite Δx aus dem linearen
Zusammenhang des Maximums der Kraftverteilung und dem Logarithmus der Ladungsrate
F` bestimmen (Izrailev et al., 1997):

f = kBT/Δx * ln((F’ * Δx)/( kBT * kdiss)). [4]

Die Ladungsrate hängt von der Federkonstante der Spitze und der Ziehgeschwindigkeit ab
und gibt die Kraft an, die pro Zeiteinheit auf das System wirkt. Dies gilt allerdings nur
unter der Annahme, dass der Kraftanstieg linear ist (Izrailev et al. 1997, Evans und Ritchie
1997) und gibt daher für viele Systeme nur einen Annäherung. Ein Beispiel ist der
nichtlineare Kraftanstieg bei der Dehnung von PEG. Zudem vernachlässigt die Analyse
weitere systematischer Messfehler. So unterliegt das Molekül durch die Ziehrichtung einer
vorgegebenen Ausrichtung, was die Zahl der Freiheitsgrade reduziert. Auch werden das