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Polycystin-2 Expression Is Regulated by a PC2-binding Domain in the Intracellular Portion of Fibrocystin

Departmentof Medicine, Vanderbilt University, Nashville, Tennessee 37232, USA.
Journal of Biological Chemistry (Impact Factor: 4.6). 11/2008; 283(46):31559-31566. DOI: 10.1074/jbc.M805452200

ABSTRACT Autosomal dominant (ADPKD) and autosomal recessive (ARPKD) polycystic kidney disease are caused by mutations in Pkd1/Pkd2 and Pkhd1, which encode polycystins (PCs) and fibrocystin/polyductin (FPC). Our recent study reported that a deficiency in FPC increases the severity of cystic disease in Pkd2 mutants and down-regulates PC2 in vivo, but the precise molecular mechanism of these effects is unknown (Kim, I., Fu, Y., Hui, K., Moeckel, G., Mai, W., Li, C., Liang, D., Zhao, P., Ma, J., Chen, X.-Z., George, A. L., Jr., Coffey, R. J., Feng, Z. P., and Wu, G. (2008) J. Am. Soc. Nephrol. 19, 455-468). In this study, through the use of deletion and mutagenesis strategies, we identified a PC2-binding domain in the intracellular C terminus of FPC and an FPC-binding domain in the intracellular N terminus of PC2. These binding domains provide a molecular basis for the physical interaction between PC2 and FPC. In addition, we also found that physical interaction between the binding domains of PC2 and FPC is able to prevent down-regulation of PC2 induced by loss of FPC. In vivo, we generated a mouse model of ADPKD with hypomorphic Pkd2 alleles (Pkd2nf3/nf3) and show that PC2 down-regulation is accompanied by a phenotype similar to that of Pkhd1(-/-) mice. These findings demonstrate a common mechanism underlying cystogenesis in ADPKD and ARPKD and provide insight into the molecular relationship between PC2 and FPC.

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    ABSTRACT: Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease (ADPKD) is an inherited systemic disease with intrarenal cystogenesis as its primary characteristic. A variety of mouse models provided information on the requirement of loss of balanced polycystin levels for initiation of cyst formation, the role of proliferation in cystogenesis and the signaling pathways involved in cyst growth and expansion. Here we will review the involvement of different signaling pathways during renal development, renal epithelial regeneration and cyst formation in ADPKD, focusing on planar cell polarity (PCP) and oriented cell division (OCD). This will be discussed in context of the hypothesis that aberrant PCP signaling causes cyst formation. In addition, the role of the Hippo pathway, which was recently found to be involved in cyst growth and tissue regeneration, and well-known for regulating organ size control, will be reviewed. The fact that Hippo signaling is linked to PCP signaling makes the Hippo pathway a novel cascade in cystogenesis. The newly gained understanding of the complex signaling network involved in cystogenesis and disease progression, not only necessitates refining of the current hypothesis regarding initiation of cystogenesis, but also has implications for therapeutic intervention strategies. This article is part of a Special Issue entitled: Polycystic Kidney Disease.
    Biochimica et Biophysica Acta 05/2011; 1812(10):1249-55. DOI:10.1016/j.bbadis.2011.05.005 · 4.66 Impact Factor
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    ABSTRACT: Die autosomal rezessive polyzystische Nierenerkrankung stellt eine der häufigsten genetischen Nierenerkrankungen im Kindesalter dar. Das klinische Bild reicht dabei von perinatalem Versterben aufgrund respiratorischer Insuffizienz bis hin zu einem Überleben bis ins Erwachsenenalter. Bei etwa 80% der Patienten ist die Erkrankung auf Mutationen in dem auf Chromosom 6p12 gelegenen PKHD1-Gen zurückzuführen. Der längste offene Leserahmen umfasst 66 Exons und kodiert ein 4074 Aminosäuren langes Typ I-Transmembranprotein (Polyductin/ Fibrocystin). Zwei zum Kettenabbruch führende Mutationen sind in der Regel nicht mit dem Leben vereinbar und führen zum schweren klinischen Bild, so dass wenigstens eine Missense-Mutation vorliegen muss, damit der Patient die Neonatalperiode überlebt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden vier unterschiedliche homozygote trunkierende Mutationen bei fünf Familien untersucht, die mit einem außergewöhnlich milden Phänotyp assoziiert waren. Es konnte gezeigt werden, dass es bei drei der vier Mutationen zu einem qualitativ bzw. quantitativ von den Kontrollen abweichenden Spleißverhalten auf RNA-Ebene kam. Zudem konnte im Rahmen dieser Untersuchungen erstmals ein möglicher Effekt des Nonsense Mediated Decay (NMD), einem Abbau der mRNA aufgrund eines verfrühten Stop-Codons, für PKHD1 beschrieben werden und es ergaben sich Hinweise dafür, dass dieser Mechanismus bei wenigstens einem der untersuchten Patienten außer Kraft gesetzt war. Somit gelang es mit dieser Arbeit, weitere, der DNA-Ebene übergeordnete Mechanismen zu identifizieren, die das Krankheitsbild der ARPKD nachhaltig beeinflussen. Der zweite Schwerpunkt dieser Promotion lag in der näheren Charakterisierung des PKHD1-Genprodukts Polyductin und möglicher Interaktoren. Dazu wurden zunächst Antikörper gegen den intrazellulären C-Terminus des Proteins generiert und etabliert. Diese zeigten für Polyductin in HEK293-Zellen eine zentrosomale Lokalisation sowie eine Beteiligung am Aufbau der sog. Midbodies während der Telophase der Mitose, so dass für Polyductin eine Funktion im Rahmen der Zellteilung vermutet werden kann, die möglicherweise in der mitotischen Orientierung und/oder der Cytokinese liegt. Bei dem in dieser Arbeit zu untersuchenden Bindungspartner von Polyductin handelt es sich um eines der für das Bardet-Biedl-Syndrom (BBS) zugrunde liegenden Proteinen, BBS2, welches im Rahmen eines der Dissertation vorausgegangenen Yeast Two Hybrid-Assays als Interaktor identifiziert wurde. Bei dem Bardet-Biedl-Sydrom handelt es sich um eine Multisystemerkrankung, die meist mit pathologischen Veränderungen der Niere einhergeht. In der Immunfluoreszenz zeigte BBS2 in allen Phasen der Mitose sowie während der Interphase eine Kolokalisation mit Polyductin. Zudem konnten verschiedene Koimmunpräzipitations (CoIP)-Versuche mit Konstrukten für BBS2 und für den intrazellulären Abschnitt von Polyductin eine Interaktion der beiden Proteine bestätigen. Aufbauend darauf wurde untersucht, ob ein Zusammenhang zwischen Polyductin und dem BBSome besteht, einem Komplex aus 7 BBS-Proteinen, zu dem auch BBS2 gehört. Dazu wurden zunächst Immunfluoreszenz-Experimente mit Polyductin sowie einem weiteren Protein des BBSomes, BBS7, welches eine große Homologie zu BBS2 aufweist, durchgeführt. Hierbei zeigte sich eine partielle Kolokalisation der beiden Proteine während der Interphase unpolarisierter HEK293-Zellen. Da es sich sowohl bei ARPKD als auch bei BBS jeweils um eine zu den Ziliopathien gehörende Erkrankung handelt und die Lokalisation und Funktion des BBSomes bislang vor allem in bzw. an polarisierten, primäre Zilien tragenden Zellen beschrieben wurde, wurde zusätzlich die ziliäre Lokalisation der Interaktionspartner an polarisierten mIMCD-3-Zellen untersucht. Dabei konnten sowohl Polyductin als auch BBS7 in bzw. an der Basis der Zilie beobachtet werden. Weiterführende CoIP-Versuche zeigten, dass auch BBS7 mit Polyductin interagiert. Somit konnte mit dieser Arbeit erstmals ein direkter Zusammenhang zwischen dem mit der ARPKD assoziierten Protein Polyductin sowie Proteinen des Bardet-Biedl-Syndroms hergestellt werden. Dies erlaubt einen tieferen Einblick in das komplizierte Netzwerk der ziliären Signalwege und kann dabei helfen, die pathologischen Veränderungen, die mit diesen und anderen Ziliopathien einhergehen, besser zu verstehen und zu analysieren. Autosomal recessive polycystic kidney diesease is one of the most common diseases affecting the kidney in childhood. The clinical spectrum is highly variable with ranging from peri- or neonatal demise and survival to adulthood respectively. The ARPKD-gene, PKHD1, is located on chromosome 6p12 and the majority of the ARPKD-cases could be ascribed to mutations in this gene. The longest open reading frame comprises 66 exons and encodes a single-transmembrane-protein, called polyductin/ fibrocystin. A genotype-phenotype-correlation exists, that implicates that no patient carrying two truncating mutations survives the peri-/neonatal period. So at least one missense mutation is indispensable for survival of newborns. Within this doctoral thesis four recently identified truncating mutations in five families leading to a surprising mild phenotype where analysed. It was shown that three of them caused a quantitative or qualitative alteration on transcript level. Additionally a possible effect of nonsense mediated decay (NMD) in ARPKD has been shown for the first time and it seems as if NMD may has been circumvendet in at least one of the analysed clinically milder affected cases. Therefore mechanisms above DNA-level modifying the phenotype of ARPKD were revealed. The other main task of this doctoral thesis was a further characterisation of the protein encoded by PKHD1, polyductin, and possible interaction partners. Antibodies against the intracellular C-terminus were generated and established. In this process it has been shown that polyductin localised to the centrosome in HEK293 cells and that the protein participates in the so called midbody during telophase in mitosis. So an involvement of polyductin in cell division concerning mitotic orientation and/or cytokinesis could be hypothesised. The potential binding partner of polyductin analysed during this work, BBS2, is one of the proteins related to the Bardet-Biedl-Syndrom (BBS). BBS is a multisystemic disorder usually concerning pathological alterations of the kidney among others. Immunofluorescence showed a colocalisation of polyductin and BBS2 during all phases of mitosis as well as the interphase. Additional koimmunoprecipitation experiments using different constructs for both, polyductin and BBS2, affirmed the expected interaction. Thereupon a possible connection between polyductin and the BBSome, a complex of seven BBS-proteins including BBS2, was analyzed. BBS7, another member of the BBSome, was shown to interact with BBS2 and revealed a large homology to this protein. So it was tested wether there was link between Polyductin and BBS7. In immunofluorescence experiments a partial colocalisation within the centrosome during the interphase was observed. ARPKD as well as BBS concern to the group of ciliopathies and the localisation and function of the BBSome is described only for polarised ciliated cells. So the ciliar localisation was checked in polarised mIMCD-3 cells. It turned out that polyductin as well as BBS7 could be detected predominantly at the basis and within the cilium. Continuative CoIP experiments indicated the interaction between polyductin and BBS7. Therefore a direct link between the proteins associated with ARPKD and the Bardet-Biedl-Syndrome could be made for the first time. This allows a deeper insight in the complicated network of ciliary signalling and could help understanding and analysing the pathological changes accompanying these and other ciliopathies.
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    ABSTRACT: Polyzystische Nierenerkrankungen (PKD) sind der häufigste genetische Grund für ein terminales Nierenversagen. Flüssigkeitsgefüllte Zysten bilden sich im Nierenparenchym und beeinträchtigen die Nierenfunktion mit zunehmender Anzahl und Größe, bis diese vollkommen zum Erliegen kommt. Seit mehreren Jahrzehnten werden Tiermodelle mit PKD für die Aufklärung der molekularen Mechanismen der Zystogenese verwendet. War man anfangs auf zufällige, durch Spontanmutationen aufgetretene Zystenmodelle angewiesen, eröffneten transgene und Knock-out-Technologien in den letzen 20 Jahren eine völlig neue Dimension, die molekularen Pathomechanismen der Zystogenese durch gezielte genetische Veränderungen im Erbgut aufzuklären. Nur mit der Hilfe von Tiermodellen konnte die Lokalisation von „Zystenproteinen“ in den Zilien und die Beteiligung zilienabhängiger Signalkaskaden in der Zystogenese gezeigt werden. Dieser Artikel gibt einen Überblick über die derzeit vorhandenen murinen Tiermodelle mit PKD. Polycystic kidney disease (PKD) is the most common genetic cause for end-stage renal failure. Numerous fluid-filled cysts develop in the parenchyma of the kidney. They compromise kidney function with increasing number and size of the cysts until renal failure is inevitable. The cysts are epithelial in origin but cysts develop in different nephron segments depending on the type of the PKD. Animal models with PKD have been used for several decades to unravel the molecular mechanisms of cystogenesis. Initially, research was dependent on the morphological analysis of spontaneously emerging cystic phenotypes. Nowadays, in addition to theses models transgenic and knock-out models targeting PKD genes are also available. The localization of “cystoproteins” in the cilia of the tubulus epithelia and the involvement of cilia-dependent pathways in cystogenesis was shown only with the help of these animal models. This article gives an overview on the currently available murine models presenting with PKD. SchlüsselwörterPolyzystische Nierenerkrankung-Tiermodelle-Zilien-Zystenproteine-Ziliopathie KeywordsPolycystic kidney diseases-Models, animal-Cilia-Cystoproteins-Ciliopathy
    Medizinische Genetik 09/2010; 22(3):332-338. DOI:10.1007/s11825-010-0230-3 · 0.09 Impact Factor