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Absolute quantification of gene expression in biomaterials research using real-time PCR

Biomaterials (Impact Factor: 8.31). 01/2007; 28:203-210.

ABSTRACT Cited By (since 1996): 18, Export Date: 27 September 2011, Source: Scopus

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Available from: Fook Tim Chew, Jul 17, 2015
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    • "This method requires similar amplification efficiencies (see below) for all samples and standards. Therefore, the standard curve template must be carefully chosen (Dhanasekaran et al., 2010; Leong et al., 2007; Malorny et al., 2008; Whelan et al., 2003). Relative quantification is used to estimate changes in gene expression. "
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    ABSTRACT: Molecular methods are being increasingly applied to detect, quantify and study microbial populations in food or during food processes. Among these methods, PCR-based techniques have been the subject of considerable focus and ISO guidelines have been established for the detection of food-borne pathogens. More particularly, real-time quantitative PCR (qPCR) is considered as a method of choice for the detection and quantification of microorganisms. One of its major advantages is to be faster than conventional culture-based methods. It is also highly sensitive, specific and enables simultaneous detection of different microorganisms. Application of reverse-transcription-qPCR (RT-qPCR) to study population dynamics and activities through quantification of gene expression in food, by contrast with the use of qPCR, is just beginning. Provided that appropriate controls are included in the analyses, qPCR and RT-qPCR appear to be highly accurate and reliable for quantification of genes and gene expression. This review addresses some important technical aspects to be considered when using these techniques. Recent applications of qPCR and RT-qPCR in food microbiology are given. Some interesting applications such as risk analysis or studying the influence of industrial processes on gene expression and microbial activity are reported.
    Food Microbiology 08/2011; 28(5):848-61. DOI:10.1016/j.fm.2011.02.008 · 3.37 Impact Factor
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    ABSTRACT: Die Koordination komplexer Entwicklungsvorgänge in multizellulären Organismen erfordert eine stringente Regulation und die Verknüpfung verschiedener Signalwege. Bei Hefen und filamentösen Pilzen ist die sexuelle Entwicklung oftmals an spezifische Stadien des Zellzyklus gekoppelt, wodurch die synchrone Entwicklung verschiedener Zellen gesichert und ein geordneter Ablauf der zellulären Differenzierung gewährleistet wird. Bei dem dimorphen Basidiomyzeten U. maydis sind sexuelle und pathogene Entwicklung eng miteinander verknüpft und finden in Abhängigkeit der Wirtspflanze Mais statt. Voraussetzung für die Bildung des filamentösen Dikaryons, der infektiösen Wuchsform von U. maydis, ist die gegenseitige Erkennung und Verschmelzung kompatibler Sporidien, welche durch das Pheromon/Rezeptorsystem des a-Kreuzungstyp-Locus gesteuert wird. Die Aktivierung dieses Systems führt zu einem Zellzyklusarrest in der G2-Phase und der Ausbildung von Konjugationshyphen. Nach der Fusion der Konjugationshyphen unterliegt die weitere Entwicklung der Kontrolle des b-Locus. Die Expression des durch den b-Locus kodierten heterodimeren Transkriptionsfaktors bE/bW ist notwendig für die Aufrechterhaltung des Zellzyklusarrestes und des filamentösen Wachstums. In vorangegangenen Studien konnten 345 b-regulierte Gene identifiziert werden, von denen mehr als 90% in Abhängigkeit des C2H2-Zinkfinger Transkriptionsfaktors Rbf1 reguliert werden. Neben diesem „Master-Regulator“ der pathogenen Entwicklung ist clp1 das einzige direkt b-regulierte Gen, das ebenfalls für die pathogene Entwicklung von U. maydis notwendig ist und unabhängig von Rbf1 exprimiert wird. Delta-clp1 Stämme sind nicht in der Lage Schnallenzellen zu bilden und innerhalb der Pflanze zu wachsen, was eine mögliche Funktion in der Regulation dieser Entwicklungsprozesse vermuten ließ. Die induzierte Co-Expression von clp1 führt zur Inhibition der Funktion des b-Heterodimers, wodurch filamentöses Wachstum und der G2-Zellzyklusarrest verhindert werden (Scherer et al., 2006; Scherer, unveröffentlicht). In vorangegangenen Untersuchungen konnte ich zeigen, dass Clp1 unter anderem mit dem bW-Protein und Rbf1, den zentralen Regulatoren der pathogenen Entwicklung interagiert. In der vorliegenden Studie wurden die funktionellen Auswirkungen der Clp1-Protein-Interaktion auf die pathogene Entwicklung von U. maydis untersucht. Die Interaktion von Clp1 mit bW führt zu einem generellen Funktionsverlust des b-Heterodimeres und, daraus resultierend, zur globalen Repression der b-abhängigen Genregulation. Die Interaktion von Clp1 mit Rbf1 hingegen führt zu einer spezifischen Repression des Pheromongens mfa, wodurch die Pheromonantwort sowohl auf morphologischer als auch auf regulatorischer Ebene unterdrückt wird. Die weitere Charakterisierung von Clp1-interagierenden Proteinen führte zur Identifizierung des Transkriptionsfaktors Cib1. Die Deletion von cib1 führt zu einer Phänokopie der clp1 Deletion. Ähnlich wie bei Clp1 ist die Proteinexpression von Cib1 posttranskriptionell reguliert und auf postpenetrative Entwicklungsstadien begrenzt. Im Gegensatz zu Clp1 konnte der Mechanismus der posttranskriptionellen Regulation von Cib1 aufgeklärt und auf entwicklungsspezifisch reguliertes alternatives Spleißen zurückgeführt werden. Clp1 fungiert als Modulator von zwei Transkriptionsfaktoren, die beide eine zentrale Rolle bei der Steuerung des pathogenen Wachstums, aber auch bei der Zellzyklus-Kontrolle haben. Sowohl Rbf1 als auch das b-Heterodimer induzieren einen G2-Zellzyklusarrest, der erst nach der Penetration der Pflanzenoberfläche aufgehoben wird. Die Funktion des b-Heterodimeres, und vermutlich auch die von Rbf1, ist während der gesamten pathogenen Entwicklung notwendig. Die Funktion von Clp1 ist es, durch die Interaktion mit bW und Rbf1 die Re-Initiation des Zellzyklus zu ermöglichen. Durch die Verwendung eines artifiziellen Promotorsystems, das die Expression von rbf1 während und nach der Penetration der Pflanzenoberfläche gewährleistet, wurde erstmalig die Bildung von Appressorien und die darauffolgende Penetration der Pflanzenoberfläche unabhängig von einem aktiven b-Heterodimer nachgewiesen. Die durch Rbf1 regulierten Gene sind damit für die initialen Infektionsprozesse ausreichend. Die Re-Initiation des Zellzyklus und eine begrenzte Proliferation in planta werden allerdings erst durch die zusätzliche Expression von Clp1 ermöglicht. Im weiteren Verlauf der Infektion kommt es dann zu asynchronen Kernteilungen und Pflanzenabwehrreaktionen. Für die Unterdrückung von Pflanzenabwehrreaktionen und eine koordinierte synchrone Entwicklung in planta ist offensichtlich die Funktion des b-Heterodimeres entscheidend. Durch diesen Ansatz wurden neue Einblicke und ein grundlegendes Verständnis der regulatorischen Wechselwirkungen innerhalb der verschiedenen Signalwege und deren Auswirkung auf die biotrophe Entwicklung von U. maydis erlangt. The coordination of complex developmental processes in multicellular organisms requires the stringent regulation and interconnection of various signaling pathways. Sexual development in yeasts and filamentous fungi is often coupled to defined cell cycle stages, to account for the synchronized development of the different cells and to guarantee a controlled cellular differentiation. In the dimorphic basidiomycete U. maydis sexual and pathogenic development are tightly connected and depend on the host plant maize. Prerequisite for the formation of the infectious dikaryon is the cell/cell recognition and fusion that is controlled via an a-locus encoded pheromone/receptor system. The activation of this system triggers a G2 cell cycle arrest and the formation of conjugation tubes. After fusion of the conjugation tubes, further development is controlled by the b-locus. The expression of the heterodimeric bE/bW transcription factor, which is encoded by the b-locus, is required for the maintenance of the cell cycle arrest and filamentous growth. In previous studies, 345 b-dependently regulated genes have been identified, out of which more than 90% are regulated via the C2H2 zinc finger transcription factor Rbf1. Besides this “master regulator“ of pathogenic development, clp1 represents the sole directly b-regulated gene that is, in addition to rbf1, essential for pathogenic development and expressed independently from Rbf1. Delta-clp1 strains do not form clamps and are unable to proliferate in planta, suggesting that Clp1 might be involved in the regulation of these processes. The induced co-expression of clp1 blocks the function of the b-heterodimer and prevents filamentous growth and the G2 cell cycle arrest (Scherer et al., 2006; Scherer, unpublished). In prevoius studies I have demonstrated that Clp1 interacts, among others, with both the bW-protein and Rbf1, the central regulators of pathogenic development. In this study the functional impact of Clp1-protein interactions on the pathogenic development of U. maydis were analyzed. The interaction of Clp1 with bW results in the loss of b-function resulting in the global inhibition of b-dependent gene regulation. In contrast, the interaction of Clp1 with Rbf1 leads to the specific repression of the pheromone gene mfa, and thereby represses the pheromone response on both, the morphological, as well as on the regulatory level. The further characterization of Clp1-interacting proteins led to the identification of the transcription factor Cib1. Deletion of cib1 results in a phenocopy of !clp1 strains and, similar to Clp1, Cib1 protein expression is posttranscriptionally regulated and restricted to postpenetrative stages of the pathogenic development. In contrast to Clp1, the mechanism of the posttranscriptional control of Cib1 expression has been elucidated and could be attributed to developmentally regulated alternative splicing of the cib1 mRNA. Clp1 acts as modulator of two transcription factors, of which both play a central role in the regulation of the pathogenic development and the cell cycle. Expression of either Rbf1 or the b-heterodimer trigger both a G2 cell cycle arrest that is only released after plant penetration. The function of the b-heterodimer, and most likely also of Rbf1, is required during the entire process of pathogenic development. The function of Clp1 is to allow the re-initiation of the cell cycle by the interaction with bW and Rbf1. By use of an artificial promoter system that mediates rbf1 expression prior and post penetration of the leaf surface, the formation of appressoria and the penetration of the leaf surface was demonstrated for the first time independent of an active b-heterodimer. Rbf1-regulated genes are therefore sufficient for the initial phase of pathogenic development, whereas the re-initiation of the cell cycle and the limited proliferation in planta requires the additional expression of Clp1. The further progression of the infectious development results in asynchronous nuclear divisions and elicits plant defense responses. Obviously, the b-heterodimer is required for the suppression of plant defense responses and the coordinated and careful control of the in planta development. This approach provided new insights and a fundamental knowledge of the regulatory cross connections of the different signaling pathways and their contribution to the regulation of the biotrophic development of U. maydis.
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    ABSTRACT: Epidemiological studies indicate that exposure to envi-ronmental pollutants such as pesticides and dioxins leads to the pathogenesis of lymphoma and leukemia. Here, we show that activation of the aryl hydrocarbon receptor (AhR) by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) resulted in loss of the programmed cell death (apoptosis) response in three different lymphoma cell lines, which plays a key role in the development of cancer, especially lymphoma and leukemia. The AhR-mediated inhibition of apoptosis in vitro was associated with a clear increase of cyclooxygenase-2 (COX-2) and deregulation of genes of the B-cell lymphoma-2 (Bcl-2) family involved in apoptosis including Bcl-xl and Mcl-1 in several lymphoma cell lines. Treatment with the COX-2 inhibitor NS-398 and the AhR antagonist 3-me-thoxy-4-nitroflavone abolished the TCDD-induced re-sistance of apoptosis in vitro. Furthermore, using mi-cropositron emission tomography imaging, in vivo findings demonstrated that exposure to TCDD pro-motes the development of lymphoma in superficial lymph nodes of C57BL/10J mice, which was associated with a marked increase of COX-2 expression in the affected lymph nodes. The results indicate that AhR activation and COX-2 overexpression likely represent a mechanism of resistance to apoptosis in lymphoma cell lines that might be relevant for the development of lymphoma in vivo. (Am J Pathol 2007, 171:1538 –1548; DOI: 10.2353/ajpath.2007.070406)
    American Journal Of Pathology 01/2007; 171(5):1538-48. · 4.60 Impact Factor
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