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The use of polymerase chain reaction to determine fetal RhD status

Center for Medical Genetics, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD.
American Journal of Obstetrics and Gynecology (Impact Factor: 3.97). 11/1994; 171(4):1047-51. DOI: 10.1016/0002-9378(94)90032-9
Source: PubMed

ABSTRACT Our purpose was (1) to establish the accuracy of a deoxyribonucleic acid amplification method in determination of RhD status in adult blood samples, including weak D variants (previously referred to as Du) and a D mosaic, and (2) to apply the method to determine fetal RhD status in alloimmunized pregnancies.
Twenty-five adult blood samples, including five weak D variants and one D mosaic, were analyzed with a polymerase chain reaction to determine RhD type. The method was then applied to amniotic fluid samples obtained by amniocentesis from three RhD-negative women with known RhD sensitization.
RhD type determined by polymerase chain reaction for all adult blood samples agreed with serologic typing results. All weak D variants and the D mosaic gave results consistent with RhD positivity. Fetal RhD status was determined in each of the three alloimmunized pregnancies, and obstetric management decisions were made on the basis of these results.
This polymerase chain reaction method allows rapid and accurate determinations of fetal RhD status by amniocentesis. Fetal blood sampling or serial amniocenteses may be avoided when the fetus is RhD negative, and plans for surveillance and intervention can be confidently made if the fetus is RhD positive. However, before the widespread use of this assay, its sensitivity and specificity must be established. Because weak D variants and a D mosaic demonstrated RhD-positive status by polymerase chain reaction, the method described is applicable to these RhD variants.

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    ABSTRACT: The complexity of the RHD and RHCE genes, which is the greatest of all blood group systems, confounds analysis at the molecular level. RH DNA typing was introduced in 1993 and has been applied to prenatal testing. PCR-SSP analysis covering multiple polymorphisms was recently introduced for the screening and initial characterization of partial D. Our objective is to summarize the accrued knowledge relevant to the approaches to Rh phenotype prediction by DNA typing, their possible applications beyond research laboratories and their limitations. The procedures, results and problems encountered are highly detailed. It is recommended that DNA typing comprises an analysis of more than one polymorphism. We discuss future directions and propose a piecemeal approach to improve reliability and cost-efficiency of blood group genotyping that may eventually replace the prevalent serology-based techniques even for many routine tasks. Transfusion medicine is in the unique position of being able to utilize the most extensive phenotype databases available to check and develop genotyping strategies.
    Transfusion Medicine 01/1999; 8(4):281-302. DOI:10.1046/j.1365-3148.1998.00173.x · 1.31 Impact Factor
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    ABSTRACT: Es werden derzeit für Genotypisierungen häufig PCR-gestützte Techniken herangezogen, die kurze, sogenannte diagnostische Sequenzen eines Gens nachweisen. Aufgrund seiner großen klinischen Bedeutung werden derartige Techniken, insbesondere in der Pränataldiagnostik, auch für den Nachweis des RHD-Gens zur Bestimmung des Phänotyps eingesetzt. Ein großes Problem bei RHD-Genotypisierungen stellen nicht-funktionale Allele des RHD-Gens dar, die von gängigen PCR-Verfahren nicht erkannt werden und somit deren Spezifität begrenzen. Es existieren derzeit keine populationsbezogenen Angaben zur Häufigkeit solcher nicht-funktionaler Allele, ebenso ist über deren molekulare Ursachen nur wenig bekannt. In der vorliegenden Arbeit wurden unter 1.039 serologisch RhD-negativ bestimmten Blutspenden aus Baden-Württemberg mit Hilfe von PCR-SSP-Technik nicht-funktionale Allele des RHD-Gens sowie Varianten mit stark reduzierter Antigenexpression (Del) identifiziert. Es erfolgte sowohl eine Analyse der molekularen Ursachen mittels SSP-PCR und genomischer Sequenzierung aller zehn Exons des RHD-Gens als auch eine Auswertung zur Angabe der Frequenz dieser Allele für die untersuchte Population. Dies stellt die erste derartige Beschreibung für eine Population anhand zufällig ausgewählter Probanden dar. Elf unterschiedliche nicht-funktionale Allele des RHD-Gens wurden identifiziert, von denen der größte Teil durch RHD-CE-D Hybridgene bedingt ist, bei denen unter anderem der Bereich von Exon 4 bis Exon 7 ausgetauscht ist. Ein Allel, das unter drei Individuen einer Familie gefunden wurde, zeigte keine RHD-spezifischen Banden in Intron 7 und Exon 9, wobei unklar ist, ob ebenfalls ein Hybrid oder eine Deletion in diesem Bereich vorliegt. Desweiteren wurden vier Allele mit Punktmutationen, die bei zweien ein vorzeitiges Stopkodon, bei zweien veränderte Spleißstellen bewirkten, gefunden. Als Ursachen für Del-Varianten konnten einerseits zusätzliche suppressive Effekte eines C sowohl in trans- auf qualitativ als auch in cis-Stellung auf quantitativ verändertes Antigen D beschrieben werden. Andererseits resultierte der Del-Phänotyp bei zwei Allelen aus Punktmutationen, die veränderte Spleißstellen bewirkten. Sämtliche Allele wurden unter RhD-negativen Proben mit vorhandenem Antigen C und/oder E gefunden. Hierbei war der Haplotyp Cde im Vergleich zu cdE im Verhältnis 6,2:1 Träger von Allelen mit RHD-spezifischen Bereichen. Die Frequenz von nicht-funktionalen Allelen des RHD-Gens wurde mit 1:27 in einer maximalen Abschätzung unter RhD-negativen Individuen mit vorhandenem Antigen C und/oder E bestimmt. Für Del-Phänotypen wurde eine Frequenz von 1:48 unter diesen RhD-negativen Proben bestimmt. Nicht-funktionale Allele des RHD-Gens sind in erster Linie durch RHD-CE-D Hybridgene bedingt. Daneben findet man zu einem weitaus geringeren Teil auch Punktmutationen, die zu einem vorzeitigen Stopkodon oder veränderten Spleiß-stellen geführt haben. Del-Varianten sind auch unter RhD-negativen Blutspendern aus Süddeutschland in gewissem Umfang zu finden und konnten auf unterschiedliche Ursachen zurückgeführt werden. Insgesamt weist der Haplotyp Cde häufiger Allele mit RHD-spezifischen Sequenzen auf als der Haplotyp cdE. Die von uns entwickelte Intron 4/Exon 7-Multiplex-PCR ist geeignet, durch Hybride bedingte, nicht-funktionale Allele des RHD-Gens als RhD-negativ zu erkennen. Diese Methode weist eine Fehltypisierungsrate von ungefähr einem in 90 RhD-negativen Individuen mit C und/oder E auf. Eine Verminderung dieser Fehltypisierungsrate ließe sich durch zusätzliche Untersuchung von Exon 9, dem eine Bedeutung für die Antigen D-Expression zuzukommen scheint, erreichen.
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    ABSTRACT: This study was designed to evaluate accuracy and clinical usefulness of fetal RhD genotyping with fluorescent duplex polymerase chain reaction. Two RhD-specific gene fragments (exon 10 in polymerase chain reaction 1 and exon 7 in polymerase chain reaction 2) were amplified in samples from 213 fetuses. Amplification failed in 0.9% of the specimens, and equivocal results were found in 1.4% of the specimens. Of the analyses, 6.6% had to be repeated. The concordance of genotyping and serotyping was 99.0% for each polymerase chain reaction. False-positive results were noted in 4 fetuses. Concordant findings from both assays indicated the correct serotype for all fetuses. In 44 alloimmunized pregnancies, further invasive procedures were avoided for 5 of the 6 genotypically RhD-negative fetuses. Only two of 38 RhD-positive fetuses had a hemoglobin level <8 g/dL at first fetal blood sampling. Fetal genotyping at distinct regions of the RhD gene is reliable and improves the care management of sensitized women.
    American Journal of Obstetrics and Gynecology 02/1999; 180(2 Pt 1):435-40. DOI:10.1016/S0002-9378(99)70228-0 · 3.97 Impact Factor
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