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Mobilization of low-molecular-weight iron and peroxidative damage during ischemia and reoxygenation of the rat liver.

Third Department of Surgery, Tokyo Women's Medical College, Japan.
Transplantation Proceedings (Impact Factor: 0.95). 05/1994; 26(2):918-21.
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    ABSTRACT: Das zytotoxische Potential redox-aktiver, chelatisierbarer Eisenionen hängt entscheidend davon ab, wie schnell diese durch intrazelluläre Reduktionsmittel (re-)reduziert werden („Redox-Cycling”), da die eisenabhängige Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) vorwiegend durch zweiwertige Eisenionen (Fe(II)) vermittelt wird. Welche intrazellulären Reduktionsmittel das radikalgenerierende „Redox-Cycling” am effektivsten unterhalten, konnte jedoch bislang noch nicht geklärt werden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde vergleichend untersucht, wie effektiv isolierte Zellorganellen der Rattenleber, d.h. Mitochondrien, Mikrosomen, Zellkerne und das Cytosol, Fe(III)-ATP reduzieren können. Während die Fe(III)-Reduktionsrate durch das Cytosol und die Kernfraktion generell äußerst gering ausfiel, konnten die Mitochondrien und Mikrosomen (jeweils 0,01 mg Protein/ml) in Anwesenheit von NADH (200 µM) 50 µM Fe(III)-ATP innerhalb einer Stunde fast vollständig reduzieren. Eine Extrapolation auf die Proteinverhältnisse der Rattenleber ergab, dass die Mitochondrien die mit Abstand höchste (65%) NADH-abhängige Fe(III)-Reduktionskapazität aller Zellorganellen besitzen sollten, während auf die Mikrosomen 23% der NADH-abhängigen Fe(III)-Reduktionskapazität aller Organellen entfiel; die Fe(III)-Reduktionskapazität der cytosolischen Fraktion und der Zellkernfraktion betrug lediglich 9% bzw. 2,8%. Auf Grund seiner herausragenden Bedeutung wurde das NADH-abhängige Fe(III)-Reduktionssystem der Mitochondrien genauer untersucht. Eine Beteiligung von Ascorbinsäure und dem Superoxidanionradikal (O2.-) am mitochondrialen Fe(III)-Reduktionsprozess sowie ein direkter Elektronentransfer von NADH auf Fe(III) waren nicht nachweisbar. Neben dem Ausschluss dieser prominenten, niedermolekularen Reduktionsmittel für Eisen(III), wiesen auch der hemmende Effekt von 4,5-Dihydroxyanthrachinon (Rhein) und die ermittelten Michaelis-Menten-Kinetiken auf einen durch Enzyme vermittelten Fe(III)-Reduktionsprozess hin. Eine Beteiligung der Atmungskettenenzyme an der Reduktion von Fe(III)-Ionen konnte ausgeschlossen werden, da sowohl die Atmungsketteninhibitoren Antimycin A und Rotenon als auch die Substrate Glutamat und Malat keinen Einfluss auf die NADH-abhängige Ferrireduktaseaktivität der mitochondrialen Fraktion hatten. Durch Versuche mit submitochondrialen Fraktionen konnte schließlich gezeigt werden, dass die höchste spezifische Fe(III)-Reduktaseaktivität an oder in der äußeren Mitochondrienmembran lokalisiert ist. Aus den vorliegenden Ergebnissen wurde geschlussfolgert, dass ein NADH-abhängiges mitochondriales Enzymsystem, höchst-wahrscheinlich das Cytochrom-c-Reduktasesystem der äußeren Mitochondrienmembran, entscheidend zur effektiven Reduktion der chelatisierbaren Fe(III)-Ionen beiträgt. Aufgrund des hohen Km-Wertes für Fe(III)-ATP (ca. 0,95 mM) sollte dieser enzymatische Reduktionsprozess intrazellulär vor allem dann bedeutend werden, wenn die cytosolischen Konzentrationen von NADH und chelatisierbarer Fe(III)-Ionen unter pathologischen Bedingungen stark erhöht sind. In vergleichenden Versuchen wurde weiterhin demonstriert, dass die Mitochondrien der Skelettmuskulatur (Musculus gastrocnemius) chelatisierbares Fe(III) genauso effektiv wie die Lebermitochondrien NADH-abhängig reduzieren können. Das toxische Potential von extrazellulärem, chelatisierbarem Eisen im Rahmen des mechanischen Muskeltraumas wurde anhand eines in vitro-Traumamodells näher charakterisiert. Da bekannt ist, dass infolge einer mechanischen Zerstörung von Gewebestrukturen große Mengen intrazellulärer Metabolite freigesetzt werden, die zur Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies beitragen können, wurde zunächst die Freisetzung chelatisierbarer Eisenionen nach der Schädigung (Homogenisierung) des Skelettmuskels der Ratte untersucht. Im 1:10-Homogenat des Skelettmuskels Musculus gastrocnemius konnten mit dem Fluoreszenzindikator Phen Green SK (PG SK) 5 µM chelatisierbares Eisen nachgewiesen werden, das unmittelbar nach der Zerstörung des Muskelgewebes freigesetzt wurde und dessen Konzentration über einen Beobachtungszeitraum von 24 Stunden konstant blieb. Das freigesetzte, chelatisierbare Eisen entsprach 3% des muskulären Gesamteisens und war hauptsächlich mit Makromolekülen (≥ 30 kDa), höchstwahrscheinlich Proteinen, assoziiert. Vermutlich aus sterischen Gründen wurde das PG SK-detektierbare Eisen nur zu einem sehr geringen Teil durch Apo-Transferrin gebunden. Zudem war es hoch redox-aktiv und vermittelte eine erhebliche Bildung Thiobarbitursäure-reaktiver Substanzen (TBARS) als Maß für eine Lipidperoxidation im Muskelhomogenat. Eine Beteiligung von Protoporphyrin-Eisen des Myoglobins konnte hierbei ausgeschlossen werden. Im Hinblick auf die in vivo-Situation wurde aus den vorliegenden Daten postuliert, dass infolge eines mechanischen Muskeltraumas erhebliche Mengen redox-aktiver, chelatisierbarer Eisenionen in den Blutkreislauf freigesetzt werden könnten, die nicht durch Transferrin gebunden werden und somit potentiell eisenabhängige, oxidative Schädigungsprozesse vermitteln.
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    ABSTRACT: Extended hemodynamic monitoring during arterialized rat liver transplantation procedure and the effects of resuscitation with albumin, starch-desferrioxamine-conjugated hydroxyethyl starch (HES-DFO), or hydroxyethyl starch (HES) on hemodynamics are presented. Livers from SPRD rats were stored for 20 hr in ice-cold UW solution and were orthotopically transplanted with reconstruction of the hepatic artery under hemodynamical monitoring applying invasive measurement of mean arterial blood pressure (MAP) and cardiac output (CO). Comparable amounts of albumin, HES-DFO, and HES were given in a randomized and blinded fashion after transplantation. Ringer's solution was given additionally when blood pressure was below 65 mmHg. Fifteen, 60, and 90 min after surgical procedure blood samples were taken to determine acid base status, blood gases, and blood cell count. Oxygen radical-induced reperfusion injury was determined by thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) in serum and total glutathione in liver tissue 90 min after surgery. During the anhepatic period CO was reduced to 20% of baseline and MAP to 40 mmHg. In all groups, declamping led to a transient recovery of hemodynamic situation, whereas during further reperfusion, CO and MAP were significantly reduced in the HES- and HES-DFO-treated group in contrast to the group receiving albumin. Animals of the HES group required significantly more Ringer's solution to maintain blood pressure (2.6 +/- 0.9 ml; 4 of 6 animals needed additional resuscitation) than animals given albumin (0.4 +/- 0.3 ml, P < 0.05, 2/9 needed further supplementation) or HES-DFO (1.2 +/- 0.5 ml; 5/10 required additional resuscitation), respectively. Animals treated with HES or HES-DFO failed to restore base excess and serum lactate in contrast to resuscitation with albumin. However, TBARS was mitigated by resuscitation with HES-DFO compared to albumin and HES, whereas no significant differences were observed in respect to tissue glutathione of transplanted livers. In conclusion the model described allows intensive monitoring of hemodynamic parameters and metabolic status during arterialized rat liver transplantation procedure. Moreover, the results indicate that resuscitation with albumin could maintain central hemodynamics and restore homeostasis during the early reperfusion period after transplantation in contrast to resuscitation with HES or HES-DFO, respectively. Although resuscitation with HES-DFO resulted in mitigation of lipid peroxides determined by TBARS, no significant improvement of hemodynamics and homeostasis could be observed during reperfusion as it can be observed with albumin.
    Journal of Surgical Research 10/1996; 65(1):9-14. DOI:10.1006/jsre.1996.0336 · 2.12 Impact Factor
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    ABSTRACT: The University of Wisconsin solution is widely used for organ preservation. We show that this fluid is often contaminated by traces of iron catalytic for free radical reactions, as demonstrated by the bleomycin assay and the ability of the iron to stimulate lipid peroxidation. Reduced glutathione (GSH) added to University of Wisconsin solution during its commercial preparation had oxidized to the disulfide in all samples examined. Addition of GSH to UW solution showed its half-life to be about one day. The metal ion chelators desferrioxamine and phenanthroline did not substantially delay the loss of GSH, although desferrioxamine was able to suppress iron-mediated lipid peroxidation induced by the contaminant iron in the preservation solution. Additional iron was released from rat liver after a period of cold storage/rewarming.
    Transplantation 11/1996; 62(8):1046-9. DOI:10.1097/00007890-199610270-00002 · 3.78 Impact Factor