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Identification of genes with specific expression in pancreatic cancer by cDNA representational difference analysis

Department of Internal Medicine I, University of Ulm, Germany.
Genes Chromosomes and Cancer (Impact Factor: 3.84). 07/1997; 19(2):97-103. DOI: 10.1002/(SICI)1098-2264(199706)19:23.0.CO;2-V
Source: PubMed

ABSTRACT cDNA representational difference analysis (cDNA-RDA) is a polymerase-chain-reaction-coupled subtractive and kinetic enrichment procedure for the isolation of differentially expressed genes. In this study, the technique was used to isolate novel genes specifically expressed in pancreatic cancer. cDNA-RDA was done on cDNA reverse transcribed from a poly(A)+ mRNA pool made from 10 cancer tissues (tester) by using as a driver a cDNA from a poly(A)+ mRNA pool made from a combination of 10 tissues of chronic pancreatitis and 10 healthy pancreatic tissues. The use of chronic pancreatitis in addition to healthy pancreas mRNA in the driver preparation eliminated the influence of stromal tissue components present as contamination in the cancer-specific preparations. Such cDNA-RDA led to the isolation of 16 distinct, cancer-specific gene fragments. These were confirmed to be overexpressed in pancreatic cancer tissues by Northern blot analysis. Sequence analysis revealed homologies to five genes previously implicated in the carcinogenesis of the pancreas or other tissues. Eleven fragments had no significant homology to any known gene and thus represent novel candidate disease genes. The experiments demonstrate that cDNA-RDA is a reproducible and highly efficient method for the identification of novel genes with cancer-specific expression.

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    ABSTRACT: The matrix metalloproteinases(MMP)-2 and -9, also known as the gelatinases have been long recognized as major contributors to the proteolytic degradation of extracellular matrix during tumor invasion. In the recent years, a plethora of non-matrix proteins have also been identified as gelatinase substrates thus significantly broadening our understanding of these enzymes as proteolytic executors and regulators in various physiological and pathological states including embryonic growth and development, angiogenesis and tumor progression, inflammation, infective diseases, degenerative diseases of the brain and vascular diseases. Although the effect of broad-spectrum inhibitors of MMPs in the treatment of cancer has been disappointing in clinical trials, novel mechanisms of gelatinase inhibition have been now identified. Inhibition of the association of the gelatinases with cell-surface integrins appears to offer highly specific means to target these enzymes without inhibiting their catalytic activity in multiple cell types including endothelial cells, tumor cells and leukocytes. Here, we review the multiple functions of the gelatinases in cancer, and especially their role in the tumor cell migration and invasion.
    Biochimica et Biophysica Acta 06/2005; 1755(1):37-69. DOI:10.1016/j.bbcan.2005.03.001 · 4.66 Impact Factor
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    ABSTRACT: Gene isolation methods used during positional cloning rely on physical contigs consisting of bacterial artificial chromosomes, P1, or cosmid clones. However, in most instances, the initial framework for physical mapping consists of contigs of yeast artificial chromosome (YACs), large vectors that are suboptimal substrates for gene isolation. Here we report a strategy to identify gene sequences contained within a YAC by using cDNA representational difference analysis (RDA) to directly isolate transcripts expressed from the YAC in mammalian cells. The RDA tester cDNAs were generated from a previously reported hamster cell line derived by stable transfer of a 590-kb YAC (911D5) that expressed NPC1, the human gene responsible for Niemann-Pick type C (NP-C). The driver cDNAs were generated from a control hamster cell line that did not contain the YAC that expressed NPC1. Among the gene fragments obtained by RDA, NPC1 was the most abundant product. In addition, two non-NPC1 fragments were isolated that were mapped to and expressed from 911D5. One of these RDA gene fragments (7-R) spans more than one exon and has 98% sequence identity with a human cDNA clone reported previously as an expressed sequence tag (EST), but not mapped to a chromosomal region. The other fragment (2-R) that had no significant sequence similarities with known mammalian genes or ESTs, was further localized to the region of overlap between YACs 911D5 and 844E3. The latter YAC is part of a contig across the NP-C candidate region, but does not contain NPC1. This two-part approach in which stable YAC transfer is followed by cDNA RDA should be a useful adjunct strategy to expedite the cloning of human genes when a YAC contig is available across a candidate interval.
    Genome Research 03/1999; 9(2):182-8. · 13.85 Impact Factor
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    ABSTRACT: Der Kern-/Cytoplasma-Transport von Proteinen und RNA-Protein-Komplexen durch die Kernpore wird von Transport-Rezeptoren der Importin beta-Familie vermittelt. Verschiedene Transport-Rezeptoren erkennen ihre Substrate anhand bestimmter Transportmotive. CRM1 ist ein Export-Rezeptor, der seine Substrate über Leucin-reiche Kern-Export-Signale bindet und daraufhin exportiert. Dieser Transport-Rezeptor hat ein weites Spektrum an Export-Substraten, da es sowohl Proteine als auch Protein-RNA-Komplexe wie ribosomale Untereinheiten, U snRNPs aber auch retrovirale ungespleißte mRNAs exportiert. Da es unwahrscheinlich erschien, daß CRM1 ausschließlich retrovirale mRNAs exportiert, bestand die Frage, ob CRM1 auch zelluläre mRNAs transportiert, auch wenn der konstitutive mRNA-Export durch den Export-Rezeptor TAP vermittelt wird. Zu diesem Thema gibt es nur vereinzelte Berichte über bestimmte mRNAs, die CRM1-vermittelt exportiert werden sollen. In dieser Arbeit wurde systematisch nach zellulären mRNAs gesucht, die mittels CRM1 exportiert werden. Dazu wurde der mRNA-Export in Zellen, die mit dem CRM1-spezifischen Inhibitor Leptomycin B (LMB) behandelt wurden, mit dem mRNA-Export von unbehandelten Zellen verglichen. CRM1-abhängig exportierte mRNAs sollten nach LMB-Behandlung im Kern akkumulieren und aus dem Cytoplasma depletiert werden. Zur Analyse des Kernexports der so behandelten Zellen wurde die Repräsentative Differenz-Analyse (RDA) eingesetzt. Die Validierung dieser Methode erfolgte mit Cl-4-Zellen, die einen Teil des Genoms des Humanen Immundefizienz-Virus (HIV) tragen und in denen CRM1-abhängiger Export der HIV-env-mRNA stattfindet. In diesen Zellen konnte der CRM1-vermittelte Export der env-mRNA gezeigt werden und dient deshalb als Positivkontrolle für das Funktionieren der RDA. Außerdem konnte gezeigt werden, daß Negativkontrollen wie die ß-actin- oder die GAPDH-mRNA nicht CRM1-abhängig exportiert werden. Neben der Durchführung der RDA mit Cl-4-Zellen wurde sie auch mit HeLa-Zellen durchgeführt. Mit der Analyse der Kern/Cytoplasma-Verteilung der aus den HeLa- und Cl-4-RDA erhaltenen RNAs konnte der CRM1-abhängige Export der 28S und 18S rRNA gezeigt werden. Zelluläre mRNA-Substrate von CRM1 konnten unter den gleichen Bedingungen jedoch nicht identifiziert werden. Daraus ergibt sich die Schlußfolgerung, daß der CRM1-vermittelte Export unter den gewählten Bedingungen kein bedeutender Exportweg für konstitutiv exprimierte zelluläre mRNAs in Cl-4- und HeLa-Zellen ist. Um den Kerntransport induzierbarer mRNAs zu untersuchen, wurde die T-Zell-Aktivierung als System ausgewählt. Nach Aktivierung der T-Zellen und Behandlung mit LMB konnten 11 verschiedene Transkripte wie z.B. die TNFalpha- oder die CD83-mRNA identifiziert werden, die eine veränderte Kern/Cytoplasma-Verteilung nach LMB-Behandlung zeigten. Mit Northernblot- und RT-PCR-Analysen konnte zusätzlich bewiesen werden, daß die Transkription der meisten untersuchten mRNAs durch T-Zell-Aktivierung induziert wird und daß Behandlung der Zellen mit LMB zur Reduktion der Gesamtmenge dieser mRNAs führt. Für sieben dieser mRNAs war außerdem die Bindung an das RNA-Binde-Protein HuR bereits gezeigt worden. HuR wird unter bestimmten Bedingungen durch CRM1 ins Cytoplasma transportiert, und deshalb könnte HuR als Adaptor im Export zwischen den identifizierten mRNAs und CRM1 fungieren. Die Identifizierung dieser induzierbaren CRM1-abhängigen mRNAs führt zu der Hypothese, daß der CRM1-abhängige Export ein Seitenweg für den mRNA-Export unter Aktivierungsbedingungen in T-Zellen ist.

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