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Article: LSSP-PCR to identify polymorphisms in the gene cry1B of Bacillus thuringiensis native strain
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ABSTRACT: Resumen Se estandarizó la técnica LSSP-PCR (reacción en cadena de la polimerasa con un único oligonucleótido en condiciones de baja astringencia), para identificar polimorfismos del gen cry1B en aislamientos nativos de Bacillus thuringiensis (Bt). Se eva-luaron 164 aislamientos nativos colombianos identificándose el gen cry1Ba en 11 de estos aislamientos. Los 11 fragmentos amplificados, junto con el de la cepa de referencia Bt subsp. aizawai HD137, se analizaron por LSSP-PCR y los patrones electroforéticos obtenidos se compararon cualitativamente. Con los productos amplificados mediante el oligonucleótido directo se construyó un dendrograma utilizando UPGMA que mostró tres agrupamientos con similitud de 83, 79 y 68%. La agrupación con 68% de similaridad correspondió al aislamiento nativo BtGC120 que presentó el patrón de bandas más variable. Con el oligonucleótido reverso el aislamiento BtGC120 mostró una menor variabilidad (43%). La secuencia nu-cleotidica obtenida de este fragmento de 806 pares de bases mostró una identidad de 93% con la secuencia de los genes cry1Bc1 de Bt morrisoni y cry1Bb1 de la cepa BT-EG5847. Se predijo del marco de lectura +3 una proteína de 268 residuos aminoácidicos, con 88% de identidad con la proteína Cry1Bc. Esta secuencia reveló dos dominios, una endotoxina N implicada en la formación del poro y otra endotoxina M relacionada en el reconocimiento del receptor. La evaluación biológica del aislamiento BtGC120 sobre larvas de primer instar del insecto plaga Spodoptera frugiperda, mostró una CL50 de 1,896 ng de proteína total por cm 2 . Este estudio muestra que la LSSP-PCR es una técnica que permite identificar de una manera específica variaciones en las secuencias de los genes cry de Bt, con potencialidad de encontrar nuevos genes con novedosas actividades biológicas. Abstract LSSP-PCR (low stringency specific primer-PCR), technique was standardized for polymorphisms in native isolates cry1B genes Bacillus thuringiensis (Bt) identify. 164 isolates were evaluated by identifying the gene colombian native cry1Ba, in 11 of these isolates. The 11 amplified fragments, along with the reference strain Bt subsp. aizawai HD137 were analyzed by LSSP-PCR and electrophoretic patterns obtained were compared qualitatively. With the amplified products with direct oligonucleotide was constructed using UPGMA dendrogram showed three clusters with similarity of 83, 79 and 68%. The group with 68% similarity corresponded to the isolation BtGC120 native who introduced the variable pattern of bands. With the isolation BtGC120 reverse oligonucleotide showed less variability (43%). The nucleotide sequence obtained from this fragment of 806 bp showed 93% identity with the sequence of the genes of Bt morrisoni cry1Bc1 and cry1Bb1 BT-strain EG5847. Predicted reading frame of 268 +3 a protein amino acid residues with 88% identity with the protein Cry1Bc. This sequence revealed two domains, an N endotoxin involved in the formation of the pore and other related M endotoxin inRevista colombiana de Biotecnologia. 06/2012; XIV(1-1):125-138. -
Article: Estandarización de un bioensayo y evaluación preliminar de tres formulaciones comerciales de Bacillus thuringiensis sobre Tuta absoluta (Meyrick) (Lepidoptera: Gelechiidae)
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ABSTRACT: La polilla del tomate (Tuta absoluta Meyrick; Lepidoptera: Gelechiidae) es una de las plagas más devastadoras del tomate en Colombia y países suramericanos, produciendo pérdidas de hasta el 100% en cultivos sin protección. En 2009, T. absoluta se detectó en España, Portugal y países del mediterráneo, además de Inglaterra, Bulgaria y Alemania. Para su control se utilizan insecticidas químicos que generan resistencia e impacto ambiental y de salud. La alternativa de utilizar biopesticidas contra esta plaga es de importancia creciente. En este estudio se evaluaron cinco métodos de bioensayo para medir adecuadamente la toxicidad sobre larvas de T. absoluta de tres productos comerciales: Dipel®, XenTary® y Turilav®, formulaciones a base de Bacillus thuringiensis (Bt). El método de Inmersión del folíolo, con el producto Dipel®, causó el 100% de mortalidad de larvas y 96% de supervivencia del testigo; este método presentó diferencias significativas al segundo (F=0,025, p>0,05) y cuarto (F=0,0018, p>0,05) día después de la aplicación (DDA). El método de Aspersión foliar por aerógrafo produjo 100% de mortalidad de larvas con Dipel® al segundo DDA (F=7,94x10-10, p> 0,05), y produjo diferencias significativas también al cuarto DDA (F=3,45x10-6, p>0,05). Los métodos Foliolos sumergidos y Medio de cultivo provocaron una alta mortalidad en el control por lo que fueron rechazados. El uso de Dipel®, XenTari® y Turilav® en concentración de 1,25 g/L causó entre 80-100% de mortalidad entre el segundo y octavo DDA en tres métodos evaluados válidos (i, ii, v), además corrobora la actividad biológica de B. thuringiensis sobre este insecto plaga.Palabras clave: Tuta absoluta, Bacillus thuringiensis, Dipel®, XenTary®, Turilav®Abstract: The tomato moth (Tuta absoluta Meyrick; Lepidoptera: Gelechiidae) is one of the most devastating pest of tomato in Colombia and South American countries producing losses of up to 100% on unprotected crops. In 2009, T. absoluta was detected in Spain, Portugal and the Mediterranean countries, besides England, Bulgaria and Germany. For control it chemical insecticides are used, these generate resistance and environmental and human health impact. The alternative of using biopesticides against this pest is of increasing importance. This study evaluated five bioassay methods that properly measure the toxicity on larvae of T. absoluta of three commercial products: Dipel®, XenTary® and Turilav® based formulations in Bacillus thuringiensis (Bt). The method "leaf dipping bioassay" caused with the product Dipel® 100% mortality of larvae and 95% survival of the control group. The other products showed significant differences to 2nd (F=0.025, p> 0.05), 4th (F=0.0018, p> 0.05) day after application (DAA). The "leaf spray airbrush" method used, produced with Dipel® 100% mortality of larvae to 2nd DAA with significant differences with the other products tested (F=7.94x10-10, p> 0.05 ), 4th (F=3.45x10-6, p> 0.05 ) and the 8th (F=1.07x10-5, p> 0.05 ) DAA. Methods "leaflets submerged" and "culture medium" caused high mortality in control being rejected. A variation of the leaflet immersion method was standardized. The three commercial product on concentration of 1.25 g/L produced high mortality in Lab conditions against control of larvae of T. absolute, corroborating the biological activity of B. thuringiensis on this insect pest.Key words: Tuta absoluta, Bacillus thuringiensis, Dipel®, XenTary®, Turilav®Revista Colombiana de Biotecnología. 01/2010; -
Article: Molecular and biological characterization of native Bacillus
World J Microbiol Biotechnol. 01/2011; -
Article: [Lymphocyte culture and partial karyotype of the marine turtle Caretta caretta (Testudines: Cheloniidae) in Santa Marta, Colombian Caribbean].
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ABSTRACT: Over the past few years an important reduction in the number of nesting marine turtle Caretta caretta individuals has been registered in the Colombian Caribbean, raising the question of a possible extinction in the medium-term. A conservation plan is needed. We studied the culture requirements for C. caretta lymphocytes and preliminary karyotype analysis for cytogenetic identification, immunological study and toxicology without the need to kill individuals. Peripheral blood samples were obtained from 47 individuals in Santa Marta, Colombia and tests were made until optimal conditions were established for lymphocyte culture. The karyotype had 56 chromosomes, 32 macrochromosomes and 24 micro-chromosomes. An ideogram showed that C. caretta has four groups of chromosomes. Sexual chromosomes were not observed. These results do not coincide with the karyotype described from the Pacific (Japan). The present study is the first to include a complete description of the chromosome morphology of turtles from the Atlantic Ocean. It is possible that one of the adaptive strategies of this species is genetic interchange with other species of the family, producing viable hybrids. Individuals in this study might be viable hybrids of C. caretta and further molecular studies are needed.Revista de biologia tropical 10/2008; 56(3):1459-69. · 0.46 Impact Factor -
Article: IDENTIFICACIÓN Y SECUENCIACIÓN PARCIALDE UN NUEVO GEN CRY1Ab EN AISLAMIENTOS NATIVOSDE Bacillus thuringiensis POR LSSP-PCR
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ABSTRACT: Se implementó la LSSP-PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa con un único oligonucleótido en condiciones de baja astringencia) para la identificación de nuevos genes cry1 en aislamientos nativos de Bacillus thuringiensis (Bt). Se utilizaron 18 aislamientos, previamente caracterizados para la presencia de genes cry1, provenientes de la región andina y el caribe colombiano. Se diseñaron oligonucleótidos específicos para los genes cry1Aa, cry1Ab y cry1Ac que amplificaron una región variable de 1000 pares de bases. Con estos se evaluaron los aislamientos nativos para la presencia de tales genes. Las 18 cepas amplificaron al menos uno de los 3 genes evaluados, pero en la cepa 130 BtGC se identificaron los 3 genes. Después se procedió a la evaluación por LSSP-PCR de cada uno de los aislamientos. Los perfiles electroforéticos de las cepas se observaron en gel de poliacrilamida al 5% y se compararon con el perfil de la cepa de referencia Bt kurstaki HD-1. El aislamiento 130 BtGC mostró el mayor número de diferencias para el gen cry1Ab, identificándose presencia o ausencia de 11 bandas electrofóreticas para el oligonucleótido directo Ab1 y 12 diferencias para el oligonucleótido reverso Ab2. Este fragmento del gen cry1Ab se secuenció y se comparó con la base de datos del NCBI, mostrando 91% de identidad con las secuencias previamente reportadas. Este resultado confirma que la técnica LSSP-PCR es útil, sensible y económica para la identificación de genes de la familia cry (la cuál muestra una alta variabilidad genética) y se puede utilizar para evaluar grandes colecciones de aislamientos nativos como los que existen en Colombia.EL Astrolabio. 06/2006; 1(2-1):14-21.
